鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus, IBV)属于冠状病毒科Gamma-冠状病毒属的正股RNA病毒[1]。IBV引起的鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是家禽的一种急性、高度接触性呼吸道疾病，给养鸡业带来严重的经济损失[2]。IBV基因组全长约27.6 kb，含有纤突(spike, S)蛋白、小膜(small envelope, E)蛋白、膜(membrane, M)蛋白及核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白4个结构蛋白[3]。S蛋白由蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，其中，S1蛋白可刺激机体产生中和及血凝抑制抗体，具有细胞吸附、组织亲和性以及决定血清型特异性的抗原位点，是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白[4-5]。因此，在IBV的分子流行病学和疫苗研究中，S1基因成为首选靶基因。
IBV血清型众多，目前全世界报道的血清型超过50种，不同血清型之间交叉保护作用有限。该病主要依赖弱毒苗和灭活苗进行防控，但目前生产中所用的IBV弱毒苗和灭活苗在高效、安全和成本方面都存在缺陷，尤其弱毒苗效果不甚理想[4, 6]。由于IBV基因组极其容易发生碱基的突变、插入、缺失以及毒株间的同源重组，导致新基因型和血清型毒株不断产生以及强毒株的出现，给IB的防控带来很大的难度[3-5, 7]。研究表明[4]，自2008年以来，LX4 (QX or GI-19)型IBV毒株已成为国内主要的流行基因型，且基因重组可能是LX4型毒株出现的原因。因此，近年来，学者们一直致力于研发安全高效的新型疫苗用于IB的防控[4, 8-9]。表位疫苗因其安全高效，既无弱毒苗毒力返强、碱基突变及基因重组等缺陷，也无油乳苗免疫引起机体局部反应大等缺点，且可同时诱导体液和细胞免疫，并具有把免疫效应集中在高度保守的特异性抗原表位上等优点，是近年新型疫苗研发的新方向，具有广阔的应用前景[4, 9-12]。
鉴于此，本研究利用生物信息学软件在筛选病毒细胞表位方面具有准确性高及减少科研工作量等特点，对广泛使用的IBV疫苗H120株S1蛋白的抗原表位进行预测和筛选，并通过小鼠免疫试验分析表位的抗原性，为了解S1蛋白的免疫学特性以及研发诊断试剂和有效表位疫苗奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物及材料6周龄雌性BALB/c小鼠购自长沙天勤生物技术有限公司；小鼠阳性及阴性血清、IBV阳性血清(Mass血清型)及阴性血清(鸡源)由广西大学养禽与禽病研究所制备保存；TMB ELISA Substrate、HRP标记的兔抗鼠抗体及羊抗鸡抗体均购自北京全式金生物技术有限公司；小鼠脾淋巴细胞分离液试剂盒购自Solarbio公司；淋巴细胞亚群抗小鼠CD3e-FITC、CD4 (L3T4)-PE、CD8а-PE-Cy5.5单抗购自Southernbiotech公司；IBV H120株由本研究所保存，该毒株S1基因GenBank登录号为GU393335。
1.2 候选抗原表位多肽的预测及合成1.2.1 S1蛋白的B细胞抗原表位预测 应用在线分析软件IEDB Analysis Resource (http://www.tools.iedb.org/main/)的表位预测及分析工具进行S1蛋白B细胞抗原表位预测，筛选评分最高的2条候选多肽：Pep76-106 (VNASSIAMTAPSSGMAWSSSQFCTAYCNFSD)和Pep403-421 (KSGGSRIQTATEPPVITQH)。
1.2.2 S1蛋白的T细胞抗原CTL表位预测 应用NetCTL 1.2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、BIMAS量化基序法(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/)以及SYFPEITHI超基序法(http://www.syfpeithi.de//bin/MHCServer.dll/)在线网站进行S1蛋白细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位预测，选取得分最高的2条候选CTL表位肽：Pep240-257 (DGFYPFTNSSLVKQKFIV)和Pep511-537 (SRNETGSQLLENQFYIKITNGTRRFRR)。
1.2.3 S1蛋白的T细胞抗原Th表位预测 应用SYFPEITHI超基序法(http://www.syfpeithi.de//bin/MHCServer.dll/)以及RANKPEP (http://imed.med.ucm.es/Tools/)在线网站进行S1蛋白辅助性T细胞表位(Th)预测，选取综合得分最高的2条候选Th表位肽：Pep135-172 (AMKNGQLFYNLTVSVAKYPTFKSFQCVNNL-TSVYLNGD)和Pep403-421 (KSGGSRIQTA-TEPPVITQH)，其中多肽Pep403-421兼具B细胞抗原表位功能。
1.2.4 S1蛋白的候选表位多肽的合成及偶联 将上述软件预测筛选的5条多肽交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并分别与大分子蛋白牛血清蛋白(BSA)偶联，所有多肽纯度均达到98%以上。
1.3 候选表位多肽抗原性分析用BSA偶联的5种多肽(10 μg·mL-1)分别包被酶标板4 ℃过夜，用5%的脱脂奶常温封闭2 h。每孔加入IBV阳性血清各100 μL，并设立阴性对照。37 ℃温育1 h，PBST洗涤后加入HRP-羊抗鸡IgG (1:4 000稀释)，37 ℃温育1 h，加入TMB底物溶液，37 ℃避光显色15 min后，用H2SO4终止，测定OD450 nm。应用SPSS 24.0软件中的单因素方差法进行组间差异性分析，以此评估5条多肽与血清结合力的强弱。
1.4 小鼠的多肽免疫将BSA偶联的5条多肽与弗氏佐剂等量混合进行乳化作为免疫原。一免的免疫原制备时使用弗式完全佐剂，二免及以后使用弗式不完全佐剂。取6周龄BALB/c小鼠36只，随机分为6组，其中，5组试验组分别皮下多点免疫偶联的5种多肽，另外1组免疫PBS作为对照，每只小鼠免疫剂量为150 μg。首免后，间隔2周进行二免，依次间隔2周进行三免及四免，免疫剂量及免疫途径与首免相同。
1.5 间接ELISA方法的建立1.5.1 间接ELISA方法最佳工作条件的确定 通过方阵滴定法测定多肽抗原、小鼠血清以及HRP标记兔抗鼠抗体的最佳工作浓度。用BSA偶联的5种多肽分别采用10、5、2.5和1.25 μg·mL-1的抗原浓度包被酶标板，4 ℃过夜，用5%的脱脂奶常温封闭2 h。每孔加入小鼠阳性血清各100 μL，并设立阴性对照。37 ℃温育1 h，PBST洗涤后加入HRP-兔抗鼠IgG，37 ℃温育1 h，加入TMB底物溶液，37 ℃避光显色15 min后，用H2SO4终止，测定OD450 nm。将阳性血清及HRP-兔抗鼠抗体倍比稀释，阳性血清结果标记为P，阴性血清结果标记为N，计算P/N值，取P/N值最大，且阳性血清OD值接近1.0时的各样品稀释度为最佳，确定5条多肽抗原、小鼠血清以及HRP-兔抗鼠抗体的最佳工作浓度。
1.5.2 间接ELISA阴阳性临界值的确定 用建立的ELISA方法，检测临床采集的24份小鼠阴性血清，计算出阴性血清的平均OD值(x)和标准方差(s)。根据统计学原则，样本的OD450 nm值≥阴性样本OD450 nm值的平均值(x)+3×标准方差(s)时，判为阳性；反之则为阴性。
1.6 间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体分别于免疫前、首免后2周、二免后2周、三免后2周及四免后2周分别进行小鼠眼睑采血，分离血清。用BSA偶联的相应多肽作为抗原，分离的小鼠血清及HRP-兔抗鼠IgG根据选定的最佳稀释浓度进行稀释，用间接ELISA检测小鼠血清中针对不同免疫原的IBV特异性抗体水平。
1.7 免疫小鼠中和抗体的检测参照本实验室的方法进行鸡胚气管环的制备与培养[7]。参照Reed-Muench法[13]计算IBV H120毒株的鸡胚气管环半数感染量(TOC-ID50)的值为10-7.7·mL-1；采用固定病毒稀释血清的方法在24孔培养板上进行中和试验[7]。
1.8 小鼠脾T淋巴细胞亚群的检测四免2周后，致死试验小鼠，分离脾并参照小鼠脾淋巴细胞分离液试剂盒说明书制备脾细胞悬液(1×106 cells·mL-1)。取分离的脾细胞悬液各100 μL，分别加入3种不同荧光标记的荧光染料(FITC-CD3、cy5-CD4、PE-CD8)各1 μL，同时，设置各染色抗体单染对照管和空白管。将样品避光染色20~30 min，每10 min摇1次。染色结束后，即上流式细胞检测仪进行测定。圈定CD3+淋巴细胞亚群，应用BD Accuri C6 Software软件进行各类淋巴细胞表达情况分析，对数据进行统计学分析。
2 结果 2.1 候选表位多肽的抗原性应用SPSS 24.0软件中的单因素方差分析ELISA结果显示(表 1)，Pep76-106、Pep135-172、Pep240-257多肽作为包被抗原时，IBV阳性血清与相应的阴性血清相比达到差异极显著水平(P < 0.01)；Pep403-421和Pep511-537多肽则达到差异显著水平(P < 0.05)。
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表 1 候选表位多肽的血清反应 Table 1 Serum reaction of candidate epitope-polypeptides |
由ELISA结果可知，多肽Pep76-106、Pep135-172、Pep240-257、Pep403-421及Pep511-537的抗原最佳包被浓度依次为5、5、2.5、1.25和5 μg·mL-1；P/N值依次为4.60、4.36、5.53、4.65及4.88；血清的最佳稀释度依次为1:600、1:800、1:400、1:600、1:200；二抗(HRP-兔抗鼠)最佳稀释度为1:4 000。
2.3 阴阳性临界值对24份阴性小白鼠血清样本进行检测，计算24份血清5条多肽：Pep76-106、Pep135-172、Pep240-257、Pep403-421、Pep511-537的阴性血清OD450 nm平均值依次为0.048、0.053、0.045、0.045、0.054；标准方差依次为0.004 243、0.011 314、0.001 414、0.001 414、0.012 012。根据公式阴性临界值=OD450 nm + 3×s，确定5条多肽待检样品的阴阳性临界值依次为0.060、0.087、0.049、0.049、0.090。因此，将0.05定为阴阳性血清的界限。样本效价≥0.05即为阳性，低于0.05即为阴性。
2.4 免疫小鼠血清的抗体水平5种偶联BSA的多肽免疫小鼠后均可刺激产生相应的抗体，结果见图 1。各免疫组第1次免疫后均可产生相应的抗体，且随着免疫次数及时间的增长，各免疫组抗体水平不断升高，且均高于临界值(0.05)，多肽Pep76-106组和Pep240-257组抗体上升很明显。第1次免疫后2周(14 d)，各免疫组抗体水平极显著(P < 0.01)高于未免疫组。多肽Pep76-106组抗体水平除略高于Pep240-257组，差异不显著(P>0.05)外，均显著(P < 0.05)高于其他免疫组。第2次免疫后2周(28 d)，各免疫组抗体水平极显著(P < 0.01)高于未免疫组。多肽Pep76-106组抗体水平除略高于Pep240-257组，差异不显著(P>0.05)外，均显著(P < 0.05)高于其他免疫组。第3次免疫后2周(42 d)，各免疫组抗体水平极显著(P < 0.01)高于未免疫组。多肽Pep76-106组抗体水平均显著(P < 0.05)高于其他免疫组。第4次免疫后2周(56 d)，各免疫组抗体水平极显著(P < 0.01)高于未免疫组。多肽Pep76-106组抗体水平除略高于Pep240-257组，差异不显著(P>0.05)外，均显著(P < 0.05)高于其他免疫组。因此，各免疫组间OD值(抗体滴度)由高到低依次为Pep76-106＞Pep240-257＞Pep511-537＞Pep403-421＞Pep135-172＞PBS。
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**表示各免疫组与PBS组差异极显著(P < 0.01)；*表示各免疫组与PBS组差异显著(P < 0.05)，不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，相同字母表示组间差异不显著(P>0.05) **.The vaccinated groups significantly (P < 0.01) higher than the PBS group; *.The vaccinated groups significantly (P < 0.05) higher than the PBS group. The different letters indicate significant difference between vaccinated groups (P < 0.05). The same letter indicates no significant difference among vaccinated groups (P>0.05) 图 1 多肽诱导鼠产生的抗体 Fig. 1 Specific antibody response in mouse immunized with polypeptides |
取第4次免疫后2周的小鼠血清进行中和试验，结果显示，表位多肽Pep240-257、Pep403-421及Pep511-537免疫小鼠血清的中和滴度平均效价最高，达到1:128；表位多肽Pep76-106和Pep135-172的血清中和滴度次之，达到1:64；5条多肽免疫小鼠血清中和滴度均明显高于PBS组的血清中和滴度(1:4)。
2.6 免疫小鼠脾的T淋巴细胞亚群分离小鼠的脾淋巴细胞，用流式细胞术三色分析法检测其CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例，结果如图 2所示。对各免疫组淋巴细胞进行单因素方差分析，结果如图 3所示。
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A.淋巴细胞圈门；B. CD3+T淋巴细胞；C. CD4+T淋巴细胞；D. CD8+T淋巴细胞 A. Detection of lymphocyte; B. Detection of CD3+T lymphocyte; C. Detection of CD4+T lymphocyte; D. Detection of CD8+T lymphocyte 图 2 流式细胞术三色分析法 Fig. 2 Flow cytometer of the three-color analysis method |
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**表示各免疫组的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞与PBS组差异极显著(P < 0.01)；*表示各免疫组的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞与PBS组差异显著(P < 0.05)，不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，相同字母表示组间差异不显著(P>0.05) **.The CD3+, CD4+and CD8+T lymphocyte percentages of vaccinated groups significantly (P < 0.01) higher than the PBS group; *.The CD3+, CD4+and CD8+T lymphocyte percentages of vaccinated groups significantly (P < 0.05) higher than the PBS group. The different letters indicate significant difference between vaccinated groups (P < 0.05). The same letter indicates no significant difference among vaccinated groups (P>0.05) 图 3 四免后2周小鼠脾淋巴细胞CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞比例 Fig. 3 CD3+, CD4+ and CD8+ expression on T lymphocytes in spleen 2 weeks after the fourth immunization |
四免后2周，5条多肽免疫组与PBS对照组在CD3+、CD4+ CD8-、CD8+ CD4-T淋巴细胞水平上均差异极显著(P < 0.01)。各多肽免疫组间在CD3+、CD4+ CD8-、CD8+ CD4-T淋巴细胞水平出现差异。在CD3+、CD4+ CD8-T细胞水平上，多肽Pep76-106免疫组、多肽Pep240-257免疫组及多肽Pep403-421免疫组组间差异不显著(P>0.05)，但都极显著高于多肽Pep135-172和多肽Pep511-537免疫组(P < 0.01)，各多肽免疫组间在CD3+T及CD4+ CD8-T淋巴细胞数量由大到小顺序依次为Pep403-421＞Pep240-257＞Pep76-106＞Pep511-537＞Pep135-172；在CD8+ CD4-T细胞水平上，多肽Pep403-421免疫组极显著高于其他免疫组(P < 0.01)，其他免疫组间差异不显著(P>0.05)。各多肽免疫组间在CD8+ CD4-T淋巴细胞数量由大到小顺序依次为Pep403-421＞Pep76-106＞Pep511-537＞Pep240-257＞Pep135-172。
3 讨论IBV血清型众多，且不同血清型间交叉保护作用有限，增加了IB的防控难度[7, 14]。S1是IBV变异程度最大的基因，其基因的突变或重组很有可能导致新基因型的产生，从而导致传统疫苗免疫失败[3-5, 7, 15]。因此，尽管该病报道至今已超过60年，疫苗毒株及免疫程序也一直在不断更新，但IBV的防控效果仍然不理想[4-6]。本课题组自1985年以来在广西地区分离鉴定了100多株IBV，分属于8种基因型和7种血清型，且优势基因型及血清型随着时间的推移而发生变化[3, 5, 7, 15]，提示IBV防控的严峻性。研究表明[4]，LX4型毒株占国内IBV分离株的50%左右，为最主要的基因型。本课题组研究表明[3, 6]，IB商品弱毒疫苗株H120、4/91和LDT3-A均不能对南方优势流行毒株GX-YL5 (LX4、QX或GI-19)、GX-GL11079 (LDT3-A或GI-28)和GX-NN09032 (New-type 1或GVI-1)提供完全的保护。而传统疫苗株H120一直在被广泛长期使用，对不同地区流行株的攻毒保护作用约50%[6]。基于此，本研究筛选对国内多数血清型IBV均有相当保护作用的疫苗H120株的S1基因进行抗原表位的筛选和鉴定，对于IBV诊断试剂和新型表位疫苗的研发，具有重要的现实意义。
本研究利用多种在线生物信息软件，预测筛选了5条IBV H120株S1蛋白表位多肽，其中，表位的筛选均综合两种以上软件分析结果，提高了分析结果的准确性。考虑到合成的表位肽均为小分子半抗原，不能直接刺激机体产生良好的免疫应答[16]，因此，将其与大分子蛋白载体BSA进行偶联作为包被抗原，试验结果证明其包被抗原效果良好。ELISA结果表明，以5条表位多肽作为包被抗原，IBV阳性血清与相应的阴性血清相比达到差异显著(P < 0.05)甚至极显著水平(P < 0.01)，表现出良好的抗原性，推测5条表位多肽可能存在抗原表位优势区域，因此均具有成为功能表位的潜能。
相关研究表明，IBV的中和表位主要集中于S蛋白的S1亚基上[17-18]，且抗体水平的高低可以反映表位功能的强弱[16]。Bande等[8]通过相关生物软件分析，预测在S1基因的80—89 aa位置，含有潜在的B细胞表位；Ignjatovic等[19]通过合成S1基因的245—260 aa位置的表位多肽，并进行相关动物试验，证明该多肽可被IBV免疫血清识别，诱导机体产生良好的免疫应答反应；Zou等[20]通过在S1基因77—107 aa及399—424 aa位置进行原核表达含有抗原表位的S1蛋白短肽pET-se1和pET-se2，并对其进行ELISA检测及Western blot分析，证明在这两个区域确实含有线性的中和性B细胞抗原表位。本研究合成IBV H120株S1蛋白的表位肽后免疫小鼠，并应用间接ELISA以及中和试验分析小鼠血清的抗体水平。结果表明，5条表位多肽均可能具有潜在的B细胞表位。其中，Pep240-257、Pep76-106和Pep403-421 3条多肽展现了良好的体液免疫功能。中和试验结果表明，5条表位多肽免疫小鼠的血清中和滴度均显著高于空白对照组的血清中和滴度，这也侧面佐证了表位疫苗具有把免疫效应集中在高度保守的特异性抗原表位上的优势[12]。本研究筛选的中和表位多肽结果与上述研究报道[8, 19-20]相近。
T淋巴细胞数量的变化可反映机体细胞免疫应答水平[6, 16]。因此，本研究利用流式细胞术检测5条多肽免疫小鼠后在CD3+、CD4+ CD8-、CD8+ CD4-T淋巴细胞水平上的变化。结果表明，多肽Pep403-421具有较好的细胞免疫功能。Ignjatovic等[19]发现澳大利亚Vic S毒株的S1亚基294—316 aa及532—537 aa位置具有B细胞表位；Tan等[10]通过相关动物试验，证明在M41等毒株的S1亚基45—52 aa、413—421 aa以及517—525 aa位置具有良好的T细胞表位，可刺激机体产生良好的CD8+ T淋巴细胞水平。本研究结果表明，在76—106 aa处设计合成的表位肽Pep76-106展现的体液免疫功能，优于在511—537 aa设计的表位肽Pep511-537，表明在76—106 aa处可能含有优于511—537 aa的B细胞抗原表位，该试验结果与Ignjatovic等[19]的结果不尽相同，可能与不同的毒株S1基因变异较大从而导致潜在的表位出现差异具有一定的相关性；而在403—421 aa设计合成的表位肽Pep403-421展现的细胞免疫功能，可刺激机体产生良好的CD3+、CD4+CD8-、CD8+CD4-T淋巴细胞水平，与Tan等[10]的结果相近，证明在Mass型毒株(H120、M41等)的403—421 aa处确实含有良好的T细胞抗原表位。此外，本研究的结果发现利用软件预测筛选的表位多肽的免疫性与试验结果并不完全一致，表明筛选有效的抗原表位用于表位疫苗的研发必须通过免疫学试验加以验证。
4 结论经预测、筛选及免疫效果分析，获得IBV H120株S1蛋白的5条表位多肽，其中多肽Pep240-257、Pep76-106和Pep403-421可以诱导体液免疫；多肽Pep403-421可以诱导细胞免疫；多肽Pep403-421可以同时诱导细胞免疫及体液免疫。本研究结果为深入了解S1蛋白的免疫学特性以及研发诊断试剂和有效表位疫苗奠定了基础。
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