2. 农业部动物疫病病原生物学重点实验室东北科学观测实验站, 哈尔滨 150030
, XU Yigang1,2, CHEN Qiuyan1, MEI Zhuyuan1, CUI Wen1,2, JIANG Yanping1,2, ZHOU Han1,2, WANG Li1,2, QIAO Xinyuan1,2, LI Yijing1,2, TANG Lijie1,2
2. Northeast Scientific Inspection Observation Station, Key Laboratory of Animal Pathogen Biology of Ministry of Agriculture, Harbin 150030, China
猪圆环病毒病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)是危害当今世界养猪生产的重要免疫抑制性疾病。PCVAD包括一系列症候群，如仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)等[1]，另外，由于该病毒引起的宿主免疫抑制，使患畜对其他细菌和病毒的抵抗力降低，从而更容易引发继发感染和混合感染[2]，对全球养猪业造成了严重的经济损失[3]。引起PCVAD的病原体是猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)，是迄今为止发现的最小病毒之一。PCV是无囊膜的单股环状负链DNA病毒，基因组大小约1.7 kb[4-5]。PCV有4种基因型，分别为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[6]，其中PCV2和PCV3致病性较强[7]。根据ORF2基因进化树分析，PCV2被分为PCV2a~PCV2f 6个亚型[8]。研究发现不同地区分离的PCV2存在遗传变异[9]，目前，我国PCV2分离株多属于PCV2b亚型，PCV2b已成为近年来国内流行毒株的优势基因型[10]。在感染动物的鼻腔和粪便中可以检测到大量的PCV2，感染PCV2的方式最可能是经由粪口途径，从而进入机体引发感染[11-12]。作为机体免疫的第一道屏障，黏膜在预防病毒经由粪口途径感染的过程中发挥重要作用[13-14]，因此，采用黏膜疫苗接种对于预防PCV2感染是最有效的保护策略[15]。此外，黏膜免疫具有操作简单，风险性低，可同时诱导局部黏膜免疫和全身免疫，作用效应快且直接的优势[2]。因此，开发一种安全有效的新型黏膜疫苗来预防和控制PCV2的感染具有重要意义。
乳酸菌作为公认的益生菌，近年来，在黏膜免疫口服活菌疫苗载体的研制上受到越来越多的重视，被广泛应用于口服疫苗活菌载体。乳酸菌作为外源基因表达宿主菌，还有以下优点：培养容易，操作方法简便；重组的乳酸菌可用来表达不同类型的异源蛋白；在消化道有良好的定植能力；具有免疫佐剂作用，可增强机体的黏膜免疫应答[16]。因而乳酸菌作为开发新型口服活疫苗载体的前景十分广阔。
笔者使用组成型分泌表达载体pPG-T7 g10-PPT构建了表达cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌。通过蛋白质印迹技术证实重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri表达cap蛋白，并初步评价重组菌的免疫特性以及口服免疫保护效果, 为防控PCV2的新型疫苗研发提供理论与物质基础。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 病毒、细胞和菌株 PCV2毒株(GenBank登录号：MT104511，PCV2b亚型)和猪源罗伊氏乳酸杆菌J31株(Lactobacillus reuteri J31，GenBank登录号：MK921700)，由本实验室分离并保存；猪肾细胞(PK-15)由本实验室保存；大肠杆菌Trans5α感受态购自全式金公司。
1.1.2 主要试剂 pMD-19T simple载体、Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、dNTP、DNA Marker(DL8000 Marker和DL2000 Marker等)购自日本TaKaRa生物公司；限制性内切酶Sac Ⅰ、ApaⅠ、预染蛋白Marker购自NEB公司；氯霉素(Cm+)、氨苄青霉素(Amp+)、溶菌酶等购自北京索莱宝生物公司；鼠源IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12细胞因子ELISA检测试剂盒购自酶免公司；快速提取DNA试剂盒购自全式金公司；DNA小量胶回收试剂盒购自TIANGEN公司；罗氏染料LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master购自上海罗氏有限公司；PE标记抗鼠CD4+、APC标记抗鼠CD8+等抗体购自三箭生物；胎牛血清(FBS)购自草原绿野生物工程材料有限公司；HRP标记山羊抗鼠IgG、sIgA抗体购自Sigma公司，DMEM培养液购自Thermo Fisher Scientific公司；LB培养基(酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g和氯化钠1 g定容至100 mL)；MRS培养基购自青岛海博生物技术有限公司；罗伊氏乳酸杆菌组成型分泌表达质粒pPG-T7 g10-PPT(氯霉素抗性)由本实验室构建；猪圆环病毒2型灭活疫苗(WH株)购自中牧实业股份有限公司；猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗购自青岛易邦生物工程有限公司。
1.1.3 实验动物 3周龄SPF级BALB/c小鼠，购自辽宁长生实验动物中心。
1.2 方法1.2.1 引物设计与合成 本研究所用引物见表 1，具体引物信息如下：根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站所公布的PCV2 LJ0313/2018株基因序列(GenBank登录号：MT104511)，设计引物F1(含SacⅠ位点)、R1(含ApaⅠ位点)用于扩增cap基因，以构建pMD-19T-cap质粒；F2、R2用以构建荧光定量PCR所需质粒标准品pMD-19T-PCR；F3、R3用以进行荧光定量PCR检测组织病毒载量。
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表 1 引物序列 Table 1 Primers sequence |
1.2.2 pMD-19T-cap重组质粒构建及鉴定 以PCV2病毒基因组为模板，F1、R1为引物扩增目的基因cap，反应体系：5 μL模板、2 μL Ex Taq、5 μL 10×Ex Taq buffer、2 μL F1、2 μL R1、4 μL dNTP、30 μL ddH2O，反应程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。扩增产物经回收纯化后连接至pMD-19T simple载体。对构建的质粒进行PCR鉴定、双酶切(SacⅠ、ApaⅠ)鉴定和测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-19T-cap。
1.2.3 pPG-T7 g10-PPT-cap重组质粒构建及鉴定 对实验室保存的乳酸菌组成型分泌表达质粒pPG-T7 g10-PPT，用SacⅠ、ApaⅠ进行双酶切，回收线性pPG-T7 g10-PPT载体片段；对构建的重组质粒pMD-19T-cap同样用Sac Ⅰ、ApaⅠ进行双酶切后回收目的基因cap，将二者相连，热转进大肠杆菌感受态Trans5α中，涂布于含500 μg·mL-1Amp+抗性的LB固体培养基平板上，37 ℃培养过夜，随机挑取单菌落，扩大培养后提取质粒。对重组质粒进行PCR鉴定、双酶切(SacⅠ、ApaⅠ)鉴定和测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pPG-T7 g10-PPT-cap。
将重组质粒pPG-T7 g10-PPT-cap电转化至罗伊氏乳酸杆菌J31感受态中，涂布于含100 μg·mL-1 Cm+抗性的MRS固体培养基平板上，37 ℃培养24~36 h；随机挑取单菌落，扩大培养后提取质粒，对重组质粒进行PCR鉴定、双酶切(SacⅠ、ApaⅠ)鉴定和测序鉴定，将鉴定正确的重组罗伊氏乳酸杆菌命名为pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri，含有空载体的罗伊氏乳酸杆菌命名为pPG-T7 g10-PPT/L. reuteri。
1.2.4 重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri目的蛋白表达及鉴定 将重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri按1%的比例接种到含100 μg·mL-1 Cm+抗性的MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，收集菌液。取5 mL菌体沉淀经溶菌酶作用后，用500 μL PBS悬起，加入125 μL 5×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸10 min。同时，按照上述方法对空载体菌和空菌进行处理，并进行12% SDS-PAGE电泳；电泳结束后，转印至PVDF膜，完成后，将PVDF膜置于50 g·L-1的脱脂乳溶液中室温封闭2 h，然后将PVDF膜转移至实验室保存的PCV2单克隆抗体3C11株小鼠腹水中[17]，4 ℃孵育过夜，然后用PBST洗涤3次，每次10 min，再将PVDF膜转移至含有HRP标记山羊抗鼠IgG的脱脂乳溶液中[V(脱脂乳):V(IgG) =10 000:1]，室温孵育1 h，PBST洗涤3次，使用ECL显色后观察结果。
1.2.5 小鼠口服感染PCV2模型的建立 BALB/c雌鼠每只口服300 μL TCID50为10-1.875·(0.1 mL)-1的PCV2细胞培养物作为试验组，口服同等剂量的细胞培养液作为对照组。在攻毒后进行体温的检测，通过荧光定量PCR方法对小鼠各组织中病毒载量进行检测。首先，建立荧光定量PCR的标准曲线。以PCV2的DNA为模板，F2、R2为上下游引物，PCR扩增基因序列，反应体系：5 μL模板、1 μL Ex Taq、3 μL 10×Ex Taq buffer、2 μL F2、2 μL R2、4 μL dNTP、13 μL ddH2O。反应程序：95 ℃ 5 min；94℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。收纯化目的基因片段，并与pMD-19T simple载体连接，热转化入大肠杆菌感受态Trans5α中，经PCR和测序鉴定正确后，将重组质粒命名为pMD-19T-PCR，进而以重组质粒pMD-19T-PCR为质粒标准品，建立定量检测PCV2的标准曲线。然后在小鼠攻毒PCV2后的第5、10和15天，分别采集小鼠的肺、肝、肾、心、脾、小肠、血液等组织，提取各组织总DNA，经荧光定量PCR检测各组织中的病毒载量。反应体系：5 μL模板、10 μL SYBR Green Ⅰ Mix、0.2 μL F3、0.2 μL R3、6.6 μL ddH2O。反应程序：95 ℃ 15 min；95℃ 10 s，60 ℃ 30 s，35~40个循环。熔解曲线分析。
1.2.6 重组罗伊氏乳酸杆菌口服免疫小鼠效果分析 将BALB/c雌鼠共90只随机分为5组：试验组Ⅰ每只小鼠皮下注射200 μL猪圆环病毒灭活疫苗(WH株)；试验组Ⅱ每只小鼠皮下注射200 μL猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗；试验组Ⅲ每只小鼠口服300 μL菌体浓度为1×1010CFU·mL-1的重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri；试验组Ⅳ口服同等剂量的pPG-T7 g10-PPT/L. reuteri；试验组Ⅴ口服同等剂量的PBS作为对照。免疫程序：Ⅰ和Ⅱ组小鼠每隔2周免疫1次，共免疫3次。Ⅲ~Ⅴ组小鼠每隔2周免疫1次，共免疫3次，每次连续免疫3 d，每天1次。而后采集小鼠的血液并分离血清，采用间接ELISA的方法检测免疫鼠血清中抗cap蛋白的特异性IgG抗体水平[2]；采集小鼠粪便、鼻洗液、阴道洗液和肠黏液，采用间接ELISA的方法检测免疫鼠抗cap蛋白的特异性sIgA抗体水平；采集免疫小鼠脾淋巴细胞做增殖试验；按照试剂盒说明书检测血清中细胞因子水平；通过流式细胞技术测定脾淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞水平。
1.2.7 重组罗伊氏乳酸杆菌口服免疫小鼠攻毒保护试验 在初次免疫后的第35天，分别从5组小鼠中随机各选取12只小鼠，每只口服300 μL TCID50为10-1.875·(0.1 mL)-1的PCV2细胞培养物，攻毒后第0~15天，每天测量小鼠直肠温度，观察小鼠体温变化；在攻毒后第5、10和15天采集各组小鼠的肺、脾、肝、小肠和血液样本，通过荧光定量PCR方法检测免疫小鼠各组织中的病毒载量。
2 结果 2.1 重组质粒pMD-19T-cap的构建利用特异性引物F1、R1进行PCR扩增目的基因PCV2 cap，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见在702 bp处有清晰条带(图 1a)，与预期相符。用SacⅠ、ApaⅠ双酶切法鉴定，结果与预期一致(图 1b)；经测序鉴定结果正确，说明重组质粒pMD-19T-cap构建成功。
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a. PCR鉴定(M. DL2000相对分子质量标准；1、2. cap；3.阴性对照)；b.双酶切鉴定(M. 2K Plus Ⅱ相对分子质量标准；1. Apa Ⅰ单酶切；2. Sac Ⅰ单酶切；3. Apa Ⅰ、Sac Ⅰ双酶切) a. PCR identification (M. DL2000 DNA marker; 1, 2. cap gene; 3. Negative control); b. Identification by double enzyme digestion (M. 2K Plus Ⅱ marker; 1. Digested by Apa Ⅰ; 2. Digested by SacⅠ; 3. Digested by ApaⅠ and SacⅠ) 图 1 重组质粒pMD-19T-cap的PCR鉴定(a)和双酶切鉴定(b) Fig. 1 Identification results of pMD-19T-cap by PCR(a)and enzyme digestion(b) |
利用 Sac Ⅰ、Apa Ⅰ双酶切法分别处理重组质粒pMD-19T-cap和pPG-T7 g10-PPT载体，胶收纯化目的基因cap片段和pPG-T7 g10-PPT载体片段，通过T4连接酶把两段目的片段进行连接，转入大肠杆菌感受态细胞Trans5α中，提取质粒经PCR鉴定(图 2a)和双酶切鉴定(图 2b)，结果正确。将阳性重组质粒命名为pPG-T7 g10-PPT-cap，然后将重组质粒电转入罗伊氏乳酸杆菌感受态细胞中，将阳性重组罗伊氏乳酸杆菌命名为pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri。
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a. PCR鉴定(M. DL2000相对分子质量标准；1、2. cap；3.阴性对照)；b.双酶切鉴定(M. 2K Plus Ⅱ相对分子质量标准；1. Apa Ⅰ单酶切；2. Sac Ⅰ单酶切；3. Apa Ⅰ、Sac Ⅰ双酶切) a. PCR identification (M. DL2000 DNA marker; 1, 2. cap gene; 3. Negative control); b. Identification by double enzyme digestion (M. 2K Plus Ⅱ marker; 1. Digested by Apa Ⅰ; 2. Digested by SacⅠ; 3. Digested by ApaⅠ and SacⅠ) 图 2 重组质粒pPG-T7 g10-PPT-cap的PCR鉴定(a)和双酶切鉴定(b) Fig. 2 Identification results of pPG-T7 g10-PPT-cap by PCR(a)and enzyme digestion(b) |
用PCV2单克隆抗体3C11株小鼠腹水作为一抗，对重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri，空载菌pPG-T7 g10-PPT/L. reuteri和未电转罗伊氏乳酸杆菌表达情况进行Western blot鉴定，结果显示(图 3)，重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri出现预期大小的免疫印迹条带，而作为对照的空载菌pPG-T7 g10-PPT/L. reuteri和未电转的罗伊氏乳酸杆菌未见相应条带，表明重组菌可以表达目的蛋白，并且能被小鼠腹水所识别，重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri构建成功。
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M.预染蛋白质相对分子质量标准；1.未电转罗伊氏乳酸杆菌/L. reuteri菌体沉淀；2.空载菌pPG-T7 g10-PPT/L. reuteri菌体沉淀；3.重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri菌体沉淀 M. Prestained protein marker; 1. The precipitation of L. reuterii; 2. The precipitation of pPG-T7 g10-PPT/L. reuteri; 3.The precipitation of pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri 图 3 pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri表达cap蛋白的Western blot鉴定 Fig. 3 Identification of cap protein expressed in pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri by Western blot |
2.4.1 抗cap蛋白特异性血清IgG抗体水平 在初次免疫后的不同时间点，分别采集各组小鼠血清样本，以PCV2细胞培养物为包被抗原，采用间接ELISA方法检测各组小鼠血清中抗cap蛋白特异性IgG抗体水平，结果见图 4。疫苗组和口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组小鼠从初次免疫后第14天开始和对照组相比差异极显著(P < 0.01)。
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**. P < 0.01；*. P < 0.05 图 4 免疫鼠血清中抗cap蛋白特异性IgG水平 Fig. 4 Anti- cap specific IgG level in the serum of immunized mice |
2.4.2 抗cap蛋白特异性黏膜sIgA抗体水平 在初次免疫后的不同时间点，分别采集各组小鼠粪便、鼻腔洗液和生殖道洗液；在初次免疫后第35天收集各组小鼠肠黏液，以PCV2细胞培养物为包被抗原，采用间接ELISA方法检测各组小鼠粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液和肠黏液中抗cap蛋白特异性黏膜sIgA抗体水平，结果见图 5。口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组小鼠sIgA抗体水平和对照组相比差异极显著(P < 0.01)，而疫苗组和对照组相比差异不显著。
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a.粪便中抗cap蛋白特异性sIgA水平；b.鼻腔洗液中抗cap蛋白特异性sIgA水平；c.生殖道黏液中抗cap蛋白特异性sIgA水平；d.肠黏液中抗cap蛋白特异性sIgA水平；**. P < 0.01；*. P < 0.05 a. Anti-cap specific sIgA level in feces; b. Anti-cap specific sIgA level in nasal fluid; c. Anti-cap specific sIgA level in genital tract; d. Anti-cap specific sIgA level in intestinal mucus; **. P < 0.01; *. P < 0.05 图 5 免疫鼠不同样品中抗cap蛋白特异性sIgA水平 Fig. 5 Anti-cap specific sIgA level of immunized mice |
2.4.3 小鼠脾淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+ T细胞水平 于三免后第7天(即首免后第35天)，分别取各组小鼠脾以分离脾淋巴细胞，经流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+ T细胞的水平，结果见图 6。疫苗组和口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组小鼠脾细胞中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的含量高于对照组。
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图 6 免疫鼠脾淋巴细胞中CD4+、CD8+ T细胞水平测定 Fig. 6 The content of CD4+, CD8+ cells in splenic lymphocytes |
2.4.4 脾淋巴细胞增殖试验 于三免后第7天(即首免后第35天)，分别分离各组小鼠的脾以制备脾淋巴细胞，定量细胞数后，用PCV2细胞培养物进行刺激，同时设RPMI1640培养基为阴性对照和刀豆蛋白(ConA)为阳性对照，在37 ℃、50 mL·L-1 CO2培养箱中培养72 h后，采用MTT法计算刺激指数，结果见图 7。在PCV2抗原刺激下，疫苗组和口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组小鼠的脾淋巴细胞增殖刺激指数均显著高于对照组，表明免疫重组菌可促进针对cap蛋白的特异性细胞免疫应答。
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**. P < 0.01; *. P < 0.05 图 7 脾淋巴细胞增殖指数 Fig. 7 Lymphocyte proliferation index |
2.4.5 细胞因子水平 于三免后第7天(即首免后第35天)取各组小鼠血清样本检测细胞因子水平，结果见图 8。与对照组相比，疫苗组和口服重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高，IL-10水平降低，IFN-α无显著变化。表明重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri可有效刺激小鼠产生Th1、Th2型细胞免疫，继而刺激小鼠机体产生保护性的体液免疫和细胞免疫。
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图 8 免疫鼠血清中细胞因子含量的测定 Fig. 8 Determination of cytokines in serum of immunized mice |
2.5.1 小鼠体温变化 试验期间，每日中午12时，采用小鼠体温测量仪测量攻毒组小鼠和对照组小鼠的直肠温度，以监测小鼠体温的变化，持续监测15 d，结果见图 9，与对照组小鼠体温相比，小鼠在攻毒后体温出现短暂的下降，然后体温逐渐升高，最终恢复至正常水平。
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图 9 小鼠体温变化 Fig. 9 Change trend of body temperature in mice model |
2.5.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 将构建的质粒标准品pMD-19T-PCR进行10倍梯度稀释作为模板，以F3、R3为引物，进行荧光定量PCR，试验结果以Ct值为横坐标，质粒拷贝数的对数为纵坐标，建立该方法的标准曲线，结果见图 10。建立的标准曲线线性关系良好，可用于PCV2基因的定量检测。
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图 10 标准曲线 Fig. 10 Standard curve of real-time RT-PCR |
2.5.3 各组织中的病毒载量 分别在攻毒后第5、10、15天采集小鼠的肺、肝、肾、脾、小肠、血液等组织，进行荧光定量PCR检测，结果见图 11，在攻毒后小鼠的小肠、肺、肝、血液、脾可检测出PCV2的存在。在口服攻毒后的第5天开始，小鼠的小肠、肺、肝、血液、脾中病毒核酸的拷贝数开始显著升高，小肠和血液中病毒载量最高，第10天后升高趋势变缓，趋于稳定。
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图 11 小鼠感染PCV2后血液(a)、小肠(b)、脾(c)、肝(d)和肺(e)组织中病毒核酸拷贝数 Fig. 11 Viral loads in blood(a), intestine(b), spleen(c), liver(d) and lung (e) of mice |
2.6.1 免疫小鼠攻毒后的体温变化 免疫小鼠攻毒后分别监测各组小鼠的体温变化情况，结果见图 12，与正常小鼠体温相比，各组小鼠在攻毒后体温均出现下降，从第4天开始体温逐渐恢复至正常水平。
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图 12 免疫小鼠攻毒后的体温变化 Fig. 12 Changes of body temperature of mice after challenge |
2.6.2 免疫小鼠攻毒后各组织中的病毒载量变化 分别在攻毒后的第5、10、15天采集各组小鼠的血液、小肠、肺、肝、脾样本，采用荧光定量PCR方法检测各组织中的病毒载量变化，结果见图 13。结果显示，对照组小鼠各组织中的病毒载量在攻毒后持续上升，并于第10天后维持在稳定水平；疫苗组和口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组小鼠在血液、肝、脾、肺、小肠组织中的病毒载量呈现逐步下降趋势，其中，口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组小肠内病毒载量的下降最为显著，在攻毒15 d后，小肠内已检测不出PCV2的存在。
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图 13 免疫小鼠攻毒后肝(a)、肺(b)、血液(c)、小肠(d)和脾(e)中病毒载量的变化 Fig. 13 Viral loads in liver(a), lung(b), blood(c), intestine(d) and spleen (e) of immunized mice |
罗伊氏乳酸杆菌自1980年被正式分类鉴定以来[18]，一直以其良好的肠道定植能力和对胃液的酸性环境及肠道的胆盐环境具有良好的耐受性而受到人们的关注。罗伊氏乳酸杆菌目前已被报道可稳定存在于人、猪、小鼠、大鼠、不同种类的鸟类等各种脊椎动物体内。这说明罗伊氏乳酸杆菌在脊椎动物肠道中良好的适应性，并且在啮齿动物、猪和鸡中，罗伊氏乳酸杆菌是胃肠道中的优势菌群[19]。罗伊氏乳酸杆菌作为动物体内固有乳酸杆菌之一，已有研究表明它对人和动物无任何危害，目前，罗伊氏乳酸杆菌已是国家允许的可用于保健食品和动物饲料添加剂目录中的益生菌，这说明了罗伊氏乳酸杆菌的安全性。因此，本研究选用罗伊氏乳酸杆菌作为口服疫苗的载体。越来越多的证据表明，动物肠道微生物在与特定宿主物种长期进化过程中，同一菌种不同亚种之间为更好地适应宿主物种而产生了不同的特性[20]。因此利用猪源的罗伊氏乳酸杆菌来应对猪病会起到更好的效果。本研究所用猪源罗伊氏乳酸杆菌J31株分离自3月龄健康仔猪的空肠段，之前研究表明，J31株罗伊氏乳酸杆菌的黏附能力与作为指示菌株的鼠李糖乳酸杆菌LGG AT7469能力相当。J31株罗伊氏乳酸杆菌可在pH2.0环境下存活；在60 ℃环境中15 min后仍有活性，还可以耐受0.3%浓度的猪胆盐环境，说明该株菌株适应胃肠道环境，有发挥其良好肠道益生作用的前提[21]。
近年来，PCV2感染在我国猪场越来越严重，特别是其引起的继发感染和混合感染，给我国养猪业造成了不可估量的经济损失[22]。因此，研制针对PCV2的有效疫苗至关重要。PCV2 ORF2编码的cap蛋白是PCV2刺激机体产生中和抗体的重要结构蛋白，cap蛋白以其良好的免疫原性，成为PCV2诊断和基因工程疫苗研究的靶点。目前，我国PCV2分离株多属于PCV2b亚型，PCV2b已取代PCV2a成为近年来国内流行毒株的优势基因型[10]。因此，本研究采用实验室分离保存的PCV2b型LJ0313/2018株病毒进行后续试验，以便能更适应我国目前的流行趋势。
在免疫原性研究中，间接ELISA结果显示，在3免后第1周，小鼠体内特异性抗体水平达到峰值(图 4、图 5)，在3免后第2周，小鼠体内的IgG抗体水平已有下降趋势，因此选择在3免后第1周进行攻毒试验是合适的。试验结果表明重组罗伊氏乳酸杆菌可有效引起针对PCV2的黏膜、体液和细胞免疫反应。其中需要注意的是抗PCV2特异性sIgA抗体水平只在口服重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组中显著升高，而试验所用的商品化疫苗免疫组相比PBS对照组和pPG-T7 g10-PPT/L. reuteri对照组差异不显著。Lencer等[23]的研究结果表明，通过注射方式免疫动物而最终到达胃肠道黏膜层的抗体很少，难以抵御从肠道黏膜侵入的病原体侵害。因此，本试验中疫苗组采用皮下注射的免疫方式，很难引起肠道特异性sIgA抗体水平的上升。同时，表明本研究所构建的重组罗伊氏乳酸杆菌经口服免疫能够有效诱导机体产生针对抗原的特异性黏膜免疫应答和系统免疫应答，同时也间接验证构建的重组罗伊氏乳酸杆菌无需诱导，就能够分泌免疫抗原并对动物机体实施有效刺激。
细胞因子是指主要由免疫活性细胞合成和分泌的一类具有生物学活性的蛋白质多肽分子，具有介导和调节免疫应答的功能。检测细胞因子水平，结果显示口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri能够有效刺激小鼠产生Th1和Th2细胞免疫。Kalampokis等[24]研究表明，IL-10主要是作为一种抗炎因子调节固有免疫细胞的生长和分化，并能抑制T细胞的活化。当IL-10水平提高时，T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应明显被抑制[25]。因此，疫苗组和口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri组小鼠血清中的IL-10含量低于对照组，表明在免疫之后，小鼠机体的免疫抑制作用相比对照组有所降低。而对照组小鼠体内有免疫抑制作用，可能原因是由于PCV2本身就是猪获得性免疫抑制因子，对小鼠也存在一定的免疫抑制作用[26]，这与Fort等[27]的研究结果类似。
在测量小鼠体温时，笔者发现攻毒感染试验小鼠的平均体温比免疫后攻毒保护试验中小鼠的平均体温要低1.5~2.0 ℃(图 9、图 12)，分析原因是当时饲养实验动物的外界温度变化导致的，资料显示小鼠尤其是幼鼠体温调节能力差，随着外界环境温度变化自身体温会产生较大波动[28]。因此，前后两批小鼠平均体温出现了差异。在对免疫小鼠攻毒后，所有组小鼠的体温变化趋势相同，在攻毒后出现下降，而后体温逐步上升，恢复至正常水平，在此期间，攻毒组和对照组的体温均未超过小鼠正常体温。分析小鼠体温变化可能的原因是病毒的刺激造成了小鼠的持续应激反应，会导致血压下降、血管渗透性增高、血液浓度降低及体温下降等症状，体现为各组小鼠体温的集体下降[29]。而后小鼠经过适应，对病毒的抵抗能力增强，出现各种防御手段，使机体代谢率升高，最终恢复到正常体温。而通过5组小鼠体温的变化可以看出疫苗组、重组菌组小鼠的体温和对照组相比均相差不大(图 12)，侧面反映重组菌本身对小鼠体温影响较小，安全性高。
检测细胞因子水平和刺激淋巴细胞增殖等试验结果显示，重组乳酸菌和另外两组疫苗都可以有效刺激小鼠产生Th1和Th2细胞免疫。诱导特异性抗体水平结果显示，经皮下注射的商品化疫苗可以持续诱导较高水平的特异性IgG抗体(图 4)，引起全身性免疫应答；而口服重组乳酸菌疫苗不仅可以诱导特异性IgG抗体，还可以诱导较高水平的sIgA抗体(图 5)。表明口服重组乳酸菌既可以诱导全身性免疫应答又可以激发抗原特异性黏膜免疫应答。黏膜免疫在预防病毒感染方面具有重要的作用，而PCV2感染的方式最可能是经由粪口途径[30]，病毒通过感染上皮细胞的黏膜后进行穿胞运输是病毒在黏膜侵入的重要方式之一。黏膜免疫球蛋白尤其是IgA能够阻断病毒的穿胞运输方式而阻止病毒入侵[31]。以上结果证明重组乳酸菌疫苗不仅能诱导全身性免疫应答，还能诱导黏膜免疫应答，通过两种应答的协同作用，达到更好的防治效果。攻毒后组织中病毒载量结果显示，经3种疫苗免疫后小鼠的病毒载量与对照组相比均显著降低，表明商品化的疫苗和重组乳酸菌疫苗均能有效减少体内病毒含量。且在攻毒15 d后，重组乳酸菌组小鼠肠道内已检测不到PCV2，而其他疫苗组还能检测到低浓度的PCV2，说明在小肠处重组乳酸菌疫苗的效果优于另外两组疫苗，这可能是由于重组乳酸菌疫苗诱导的sIgA抗体可以协同全身性免疫应答更好清除机体内的病毒，也可能是口服乳酸菌载体疫苗改善了小鼠的肠道菌群平衡[32]，增强了肠道黏膜的屏障功能，进而增强了小鼠的抵抗力。
大量研究表明，PCV2中的cap蛋白是病毒的主要免疫原，因此，cap蛋白也是目前所有PCV2疫苗的主要成分。但Jin等[33]研究发现，病毒病原体可以使宿主细胞优先表达诱饵表位，诱导产生针对该表位的非中和抗体，从而降低中和抗体的表达，以达到免疫逃逸的目的。因此，中和抗体是评价免疫效果的一个非常重要的指标。侯成才[34]研究指出，PCV2病毒的颗粒化构象在诱导机体产生中和抗体的过程中具有重要作用。Yu等[35]进一步研究发现，cap蛋白第169-180位氨基酸的中和活性最高。在后续的本动物试验中将会增加对中和抗体的检测。由于本试验所用实验动物为小鼠，为了更好地评价重组乳酸菌口服疫苗在实际生产中的效果，后续试验将使用仔猪作为实验动物，进行相应指标的检测，评价口服疫苗对易感动物猪的免疫效果。为使用重组菌作为黏膜免疫口服疫苗防控PCV2感染奠定基础。
4 结论构建了表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri，表达的蛋白可以与cap蛋白单克隆抗体发生特异性反应。经口服途径免疫，表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7 g10-PPT-cap/L. reuteri活载体口服疫苗能够诱导小鼠产生特异性的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答，并能提供有效的抗病毒保护。
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