副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是定植于猪上呼吸道的革兰阴性菌，在猪免疫力低下或受到应激时会引起副猪嗜血杆菌病(又称为格拉瑟病，Glässer’s disease)^[1]。副猪嗜血杆菌病可导致猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎以及败血症和死亡，是当前我国养猪业的重要细菌性疾病之一，在断奶仔猪中可引起30%的死亡率^[2]，但国内尚无ELISA抗体检测试剂盒用于血清学诊断、疫苗免疫后抗体监测及副猪嗜血杆菌病的抗体检测。细菌性病原的抗体检测方法通常难以建立，尤其是HPS有15个血清型和27%的不能分型的菌株^[3]。早期的HPS抗体检测方法有补体结合试验、间接血凝试验和ELISA，所使用的抗原成份有细菌超声波破碎后的上清(多糖和蛋白)、热酚水法提取的LPS，但所建立的方法既不稳定，又容易出现假阴性^[4-6]。近年来，国内有使用HPS细胞膨胀致死毒素(CdtB)，外膜蛋白(Omp2)和寡肽通透酶(OppA)等大肠杆菌表达的蛋白作为诊断抗原建立的ELISA和间接血凝的抗体检测方法^[7-10]。国内市场也已有荷兰BioChek公司的HPS ELISA抗体检测试剂盒，以寡肽通透酶(OppA)作为诊断抗原^[11-12]。但大肠杆菌有与HPS的CdtB结构和功能相似的同源蛋白(44%氨基酸一致性)^[13]，胸膜肺炎放线杆菌有与外膜蛋白Omp2同源的蛋白(42%~71%氨基酸一致性)^[14]。HPS的OppA在大肠杆菌、伤寒沙门菌、多杀性巴氏杆菌和耶尔森菌都有同源蛋白(55%~57%氨基酸一致性)^[15-16]。所以用此类蛋白建立抗体检测方法或试剂盒，有可能会受到其他病原同源蛋白抗体的影响而产生交叉反应。黏附素蛋白(autotransporter passenger domain，Apd)为HPS所特有的一种位于细菌表面的蛋白^[17]，在HPS的15个血清型菌株和不能分型菌株中都含有该蛋白，而在其他相关猪的细菌性病原中没有同源或类似蛋白^[18]。本研究对Apd-ELISA抗体检测方法的反应参数、阴阳性判定标准以及封闭液和包装方式进行优化和选择，进行了1 179份临床血清样品的检测和比较，初步获得了性能稳定、结果判定准确和可稳定保存的HPS ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒可用于HPS灭活疫苗免疫后的抗体检测和副猪嗜血杆菌病的血清检测。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂(trypton soy agar, TSA)，胰蛋白胨大豆肉汤(trypton soy broth, TSB)购自Difco。新生牛血清(NCS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Biosharp。HRP-羊抗猪IgG购自武汉安特捷生物技术有限公司。HPS灭活疫苗A和B分别购自武汉科前生物股份有限公司(血清4型和5型)和海博莱生物，酶标板稳定剂K和F分别购自武汉科前生物股份有限公司和福因德科技(武汉)有限公司。HPS的OppA-ELISA抗体检测试剂盒购自荷兰Biocheck公司。

1.2 菌株、质粒和Apd和OppA蛋白

HPS血清5型强毒株SH0165为本实验室分离鉴定和保存^[19]，用于攻毒试验。弱毒株SH0165Δcap(荚膜多糖合成蛋白基因缺失)为本课题组构建^[20]，用于猪的感染试验。HPS用含有10%胎牛血清和补充20 μg·mL^-1 NAD的TSA或者TSB培养。大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司。Apd蛋白原核表达质粒pET-apd由本实验室构建^[18]。Apd蛋白的制备，用质粒pET-Apd转化大肠杆菌BL21(DE3)，在37 ℃条件下，用0.8 mmol·L^-1的IPTG诱导4 h，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，BCA试剂盒测定浓度后稀释并包被酶标板^[18]。参考HPS SH0165株的序列(NC_011852.1)设计上下游引物5′-GATGCAAACAACCTTTA-3′和5′-CTGCTTAATGATATAAAGGTT -TC-3′，扩增oppA基因构建表达质粒pET-OppA。表达质粒pET-OppA转化大肠杆菌BL21(DE3)，在20 ℃条件下，0.2 mmol·L^-1的IPTG诱导10 h，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，BCA试剂盒测定浓度后用于Western blot检测。

1.3 血清

1.3.1 优化ELISA反应参数的HPS阴阳性对照血清 　　用HPS菌体ELISA筛选阴性仔猪用于动物试验^[18]。免疫和感染2次，间隔两周。第2次接种后2周采血分离血清，采血2 d后用SH0165菌株2×10¹⁰CFU进行攻毒。试验一获得的51份血清用于条件优化前后ELISA反应条件的评价(表 1，标注^a)，其中免疫组攻毒后未发病的12份血清作为HPS阳性血清(表 1，标注^b)，PBS对照组发病的12份血清作为HPS阴性血清(表 1，标注^c)。用HPS菌体ELISA对12份阳性和12份阴性血清进行检测，选择OD_{630 nm}值与所在组别平均值最接近的血清作为HPS的阴阳性对照血清，51#和26#用于反应参数和条件的优化以及临界值公式中n值的确定(表 1，标注^{b, c})。

1.3.2 确定试剂盒临界值的阴阳性血清 　　试验一有16份血清作为HPS阳性血清(表 1，标注^{b, d})，试验二有11份血清也作为HPS阳性血清(表 1，标注^{b’, d’})。40份HPS阴性血清系用HPS菌体ELISA从330份不同日龄健康猪血清中筛选，其中4份来自哺乳仔猪、23份来自保育猪、13份来自育肥猪。

1.3.3 试剂盒包装条件评价用阴阳性血清 　　18份阳性血清中的12份阳性血清来自商业疫苗A免疫组(表 1，标注^b)，6份来自HPS弱毒株感染组(表 1，标注^d’)；18份阴性血清从临床筛选的40份阴性血清中选取。

1.4 间接ELISA基本反应程序

将抗原用包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)做适当稀释，100 μL·孔^-1加入酶标板4 ℃包被过夜。用洗涤液(含有0.05%Tween-20的PBS)200 μL·孔^-1洗涤3次，加封闭液(含5%脱脂乳的洗涤液)200 μL·孔^-137 ℃温育2 h，洗涤3次。用样品稀释液(PBS含有0.05% Tween-20，0.5%BSA)稀释被检血清，加100 μL·孔^-137 ℃作用1 h，洗涤3次。加稀释后的HPR标记的羊抗猪二抗(ABclonal)100 μL·孔^-137 ℃作用30 min，洗涤3次。加底物液四甲基联苯胺(TMB)和30% H₂O₂各50 μL·孔^-1，混匀室温避光显色10 min，加50 μL·孔^-1终止液氢氟酸(0.25%)，10 min内在酶标仪上测波长630 nm的OD_{630 nm}值。

1.5 封闭液和包装条件的选择

用酶标板稳定剂K、F和5%脱脂乳(M)对包被的ELISA板进行封闭。封闭的酶标板用真空包装(Vacuum)、塑封袋包装(Bag)、不包装(Open)3种包装方式。根据商业封闭剂的使用说明，加封闭液K120 μL·孔^-137 ℃孵育2 h；加封闭液F 150 μL·孔^-1 37 ℃孵育1 h；加5%脱脂牛奶200 μL·孔^-137 ℃孵育2 h。脱脂牛奶封闭后用洗涤液洗3次，封闭液F和K封闭后不洗涤。

1.6 Western blot

纯化的OppA蛋白经SDS-PAGE电泳后转移到硝化纤维素膜上，用含5%脱脂乳的TBST(20 mmol·L^-1 Tris-HCl，150 mmol·L^-1 NaCl，0.05%Tween20，pH 7.4)室温封闭2 h。用TBST洗涤3次，将转移后的膜在标记的部位切开，每张膜包含蛋白相对分子质量标准和OppA。将126份临床猪血清用含有5%脱脂牛奶的TBST以1:100稀释后室温孵育2 h，抗-His标签的单抗做1:5 000稀释后孵育作为阳性对照。用TBST洗涤3次，在封闭液中加入1:5 000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG抗体(ABclonal)室温孵育1 h。用TBST洗涤3次，用Clearity Western ECL底物(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)显色，观察结果。

2 结果 2.1 Apd-ELISA反应参数和条件的优化

将Apd蛋白从2 μg·mL^-1倍比稀释至0.125 μg·mL^-1，酶标二抗稀释为1:5 000、1:10 000、1:15 000、1:20 000后进行方阵滴定。HPS阴阳性对照血清51#和26#进行1:100稀释。结果显示，当抗原包被质量浓度为0.5 μg·mL^-1、二抗稀释度为1:15 000时，阳性和阴性血清OD_{630 nm}的P/N值(12.996)最大。固定抗原包被质量浓度为0.5 μg·mL^-1和二抗稀释浓度为1:15 000，将阴阳性血清进行1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释，37 ℃作用30、45、60、75 min。结果显示，血清以1:200倍稀释、反应时间为45 min时，P/N值(13.505)最大，故待检血清最佳稀释倍数为1:200，最佳反应时间为45 min。

反应参数和条件固定后，对动物试验1中的51份血清进行检测。结果表明，条件优化后阴性对照组的OD_{630 nm}值从0.547±0.439降为0.362±0.332，ELISA反应背景显著降低，商业灭活疫苗A免疫组OD_{630 nm}值从1.438±0.389降为1.188±0.367。可见，条件优化降低了ELISA反应背景和样品OD_{630 nm}值的离散度。灭活疫苗B组在条件优化前后OD_{630 nm}值在阴阳性分布区间都有，这可能与其刺激机体产生Apd抗体水平的不均一有关(图 1)。

2.2 Apd-ELISA临界值的确定

间接ELISA临界值通常用OD_{630 nm}+ n *s表示，可分3步确定: ①临界值计算公式中的n值；②多份阴性样品的标准差；③实际检测中的阴性对照值^[21-22]。首先将HPS阴阳性对照血清(51#和26#)从1:100倍比稀释至1:204 800，每个稀释度做8个重复，测定平均值OD_{630 nm}并计算对应的t值^[22]。当稀释度为1:12 800时，t=2.571＞2.145[t_{(0.05, 14)}]，阴阳性血清样品的OD_{630 nm}差异显著(P < 0.05), 当稀释度为1:25 600时，阳性血清的OD_{630 nm}小于阴性血清的OD_{630 nm}，说明该方法已经不能区分阴阳性血清(表 2)。所以，临界值中的n为2.57。然后用Apd-ELISA对40份阴性血清进行检测，其OD_{630 nm}值为0.189±0.118。最后根据临界值=OD_{630 nm}+ n *s可得0.492，即被检血清的OD_{630 nm}≥ 0.492时为阳性，OD_{630 nm} < 0.492时为阴性。

为了提高结果判定的准确性，OD_{630 nm}(0.492)没有作为Apd-ELISA试剂盒阳性判定的临界值，而是使用了(S-N)/(P-N)值。其中S(Sample)代表待测样品OD_{630 nm}值，取临界值0.492；N(Negative)代表阴性对照的OD_{630 nm}值，取40份阴性猪血清的OD_{630 nm}值0.189；P(Positive)代表阳性对照的OD_{630 nm}值，取HPS免疫和感染并获得保护的27头猪的平均OD_{630 nm}值1.110。根据公式(S-N)/(P-N)可得(0.492-0.189)/(1.110-0.189)，计算获得临界值为0.33。接下来，根据临界值计算公式中P和N的OD_{630 nm}，对组装试剂盒用阴阳性对照血清进行标定，使阴性对照的OD_{630 nm}值在0.10~0.20，阳性对照的OD_{630 nm}为1.10~1.20，保证P与N的差值在1.0左右。检测血清样品后，根据样品OD_{630 nm}值和阴阳性对照血清的OD_{630 nm}值，通过公式(S-N)/(P-N)计算，当(S-N)/(P-N)≥0.33时判定为阳性，(S-N)/(P-N) < 0.33判定为阴性。

2.3 Apd-ELISA试剂盒封闭液和包装方式的选择

确定了Apd-ELISA试剂盒的临界值后，对酶标板的封闭液和包装方式进行了选择。通常认为包被的ELISA酶标板在37 ℃放置1 d相当于在4 ℃放置48 d^[24]。在此基础上，根据阿伦尼乌斯公式$\ln k = \frac{{ - Ea}}{{RT}} + C$，计算可求得酶标板在50 ℃放1 d相当于4 ℃存放162 d^[25]。作者对3种封闭液和3种包装方式下的酶标板在50 ℃存放4 d进行检测。结果表明，脱脂乳封闭的酶标板保存到第2天，阳性血清OD_{630 nm}值降至临界值以下，而商业化封闭液F和K在第4天时仍然没有下降(图 2A)；与此同时，18份阴性血清一直显示低于临界值(图 2B)。对封闭液F和K在抽真空和袋装在50 ℃存放4 d的结果进一步分析，表明封闭液K在抽真空条件下18份阳性血清检测OD_{630 nm}值最高(P>0.05)(图 2C)，所以笔者选择封闭液K封闭和抽真空包装。根据阿伦尼乌斯公式计算，使用该条件封闭和保存的酶标板在可以4 ℃存放22个月^[25]。

2.4 Apd-ELISA试剂盒的应用和比较

收集2018年我国8个省份14个猪场的猪血清样品1 179份，用Apd-ELISA试剂盒进行了检测。结果显示，不同猪场的母猪Apd-ELISA抗体阳性率在73.5%~100.0%，后备和育肥猪阳性率在40.0%~100.0%，仔猪阳性率在0~75.0%(表 3)。母猪、后备和育肥猪、仔猪的总阳性率依次为83.76%(428/511)、61.09%(168/275)、27.48%(108/393)，见表 3。

从上述样品中选取126份Apd-ELISA阳性和29份Apd-ELISA阴性血清，用Biocheck公司的OppA-ELISA试剂盒检测。结果表明，两种方法的阴性符合率为100%(29/29)，而阳性符合率为4.76%(6/126), 见表 4。对动物试验获得的27份阳性血清(表 1，标^{b, b’, d, d’})进行检测，灭活疫苗免疫血清与Biocheck试剂盒检测结果的符合率为100%(15/15)，而弱毒株ΔcapD感染血清的符合率为8.33%(1/12)，见表 4。

为了探索两种方法阳性符合率低的原因，笔者表达了HPS的OppA蛋白，以其作为抗原通过Western blot(WB)对126份Apd-ELISA阳性血清进行了检测。结果表明，母猪血清的符合率为80.28%(57/71)，后备和育肥猪的为69.77%(31/40)，仔猪的为45.45%(5/11)，总阳性率为73.02%(92/126)，比Biocheck试剂盒的4.76%(6/126)的符合率显著上升(表 4)。此外，OppA-WB检测15份灭活疫苗免疫血清全部为阳性100%(15/15)；12份弱毒株ΔcapD感染血清50%(6/12)为阳性，这也比Biocheck试剂盒8.33%(1/12)的阳性率明显上升(表 4)。

然后测定了Biocheck试剂盒检测阳性的6份临床血清以及动物试验确认阳性的27份血清的效价(表 4，^e标注)。结果表明，6份临床血清的效价在1:200~1:1 600，27份动物试验血清的效价在1:400~1:3 200(表 5)。用Apd-ELISA检测27份动物试验血清的效价范围基本一致，但Biocheck试剂盒检测15份灭活苗免疫血清全部为阳性，而12份弱毒株ΔcapD感染血清中仅1份为阳性(表 5)。所以笔者推测，有可能是OppA蛋白抗体水平在HPS感染血清和疫苗免疫血清中存在较大差异，而Apd蛋白抗体在两种血清中差异比较小。

3 讨论

对细菌的ELISA抗体检测方法而言，包被抗原的选择至关重要。如果选择与其他相关细菌具有同源性的组分作为抗原，有可能会导致交叉反应。即使选择了细菌特异性组分，但如果其在菌体中的含量(表达量)较低或者免疫原性差，相应方法的敏感性也可能较低。HPS的黏附素蛋白Apd是外膜蛋白，在体外培养和体内感染后都有大量表达^[17]。这预示其具有良好的免疫原性。Apd在HPS的15个血清型和不能分型菌株中均存在，而猪的其他相关病原菌(包括大肠杆菌、沙门菌、支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌)中却没有同源蛋白；虽然猪链球菌中存在低同源性的金属内肽酶(metallo-endopeptidase)(54%同源区和27%氨基酸一致性)，但并不与Apd的抗体反应^[18]。这保证了Apd-ELISA方法具有较高的特异性。

在建立血清学检测方法时，已知背景的阴阳性血清也是至关重要^{[23, 26-27]}。对血清背景的确认，通常是使用商业化试剂盒或敏感性和特异性更高的血清学方法(比如免疫印迹试验)^[28-29]。但这些条件在本研究开展时都不具备，所以笔者通过猪的免疫和感染试验制备了HPS的阴阳性血清。由于HPS是猪上呼吸道的常在菌，国外研究者进行HPS的感染或攻毒试验通常使用SPF猪或未食初乳的剖腹产仔猪^[31-32]。鉴于SPF猪或未食初乳的剖腹产仔猪难以获得，笔者使用HPS菌体ELISA对2~3周龄仔猪进行筛选，抗体阴性的同窝仔猪会进行动物试验。事实上，后续试验结果也证实了制备HPS阴阳性标准血清的方法是可行的。

用Biocheck的ELISA试剂盒与Apd-ELISA进行了比较试验，发现126份Apd-ELISA阳性的临床血清中，Biocheck试剂盒仅检出4.76%(6/126)为阳性(表 4)。HPS的CdtB间接ELISA也证实了与Biocheck试剂盒的阳性符合率只有25%(29/116)^[8]。HPS在我国健康猪群分离率可达到22.6%，应激或病毒感染通常会导致不同程度的隐性感染而出现抗体阳性^[33-34]。所以，笔者认为临床猪血清中HPS的抗体阳性率不可能这么低。正如OppA-WB检测结果所显示的一样，126份血清中有73.02%(92/126)的样品为阳性(表 4)。尽管Biocheck的ELISA试剂盒也是以OppA作为抗原，但其敏感性远不如OppA-WB。一方面由于ELISA敏感性不如WB高，另一方面受试剂盒反应参数和条件的影响。此外，灭活疫苗免疫和弱毒株ΔcapD感染血清的Apd-ELISA效价范围相当(表 5)，但Biocheck试剂盒对两类血清的检测结果却不一致。笔者推测，有可能是HPS感染血清中OppA抗体水平低于疫苗免疫血清，导致了OppA-ELISA对疫苗免疫血清的检出率高，而对细菌感染血清的抗体检出率低。当然，也有可能是Apd-ELISA试剂盒存在缺陷和不足。总之，要对Apd-ELISA和OppA-ELISA进行进一步评价，既需要获取多份临床发病血清和疫苗免疫血清样品进行检测并与第3种方法比较，也需要对Apd和OppA在HPS菌体中的表达量和在HPS感染与免疫中的作用进行研究。

4 结论

1) Apd-ELISA反应参数和条件的优化降低了其反应背景，提高了对阴阳性血清的区分度。2) Apd-ELISA试剂盒的阳性判定标准定为(S-N)/(P-N)≥0.33，使用封闭液K和真空密封可使酶标板在50 ℃保存4 d(相当于4 ℃存放22个月)。3) Apd-ELISA与Biocheck(OppA-ELISA)试剂盒检测HPS阴性血清和灭活疫苗免疫血清的符合率为100%(29/29；15/15)；检测阳性血清的符合率为4.76%(6/126)，但与OppA-WB的阳性符合率可达到73.02%(92/126)。