2. 福建农林大学动物科学学院, 福州 350002;
3. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 兰州 730046;
4. 西藏农牧学院动物科学学院, 林芝 860000
, SUN Xiaoshuang1,2, QIU Yunfei1,3, YANG Fei1,4, TANG Jie1, LIAN Wenjian1, HUANG Cuiqin1
, CHIU Hungchuan1
2. College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;
3. Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China;
4. College of Animal Science, Tibetan Agricultural and Animal Husbandry College, Linzhi 860000, China
猪囊等孢球虫(Cystoisospora suis)，原名为猪等孢球虫(Isospora suis)，过去被归类为艾美耳科的等孢属球虫(Isospora)，现被一致认为归类于顶复亚门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoea)、真球虫目(Eucoccidiida)、肉孢子虫科(Sarcosporidae)的一新的属——囊等孢属(Cystoisospora)[1-2]，区别于鸟的等孢属球虫。由C. suis引起的猪球虫病呈世界性流行和分布，45%~100%的猪场存在C. suis感染[3-5]。该虫是引起新生仔猪球虫病的重要病原体，临床上表现为糊状至水样的非出血性腹泻，体重明显下降和消瘦，常引起仔猪死亡[6]，其他生长阶段猪也会感染，经产母猪或产房母猪多为带虫宿主，不表现临床症状，给猪场造成巨大的经济损失[7]。随着世界养猪业的发展，球虫病的控制越发引起人们的重视。目前，猪球虫病的控制主要还是依赖于抗球虫药，但是抗寄生虫药物的长期过度使用已经造成全球性分布的寄生虫耐药性问题及动物产品和环境中的药物残留问题，目前，尚无更好的解决办法，使得人们试着探索一条新的途径来防控寄生虫的感染。
C. suis的发育过程需要经历裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖3个阶段，其中，孢子生殖阶段在外界环境中完成，裂殖生殖和配子生殖阶段在猪的肠黏膜上皮细胞内进行。孢子化阶段是从不具有感染能力的未孢子化卵囊变成具有感染能力的孢子化卵囊的阶段，这一阶段是该寄生虫能否感染宿主的关键阶段[8]。这一孢子化过程中，必定有一些其特定表达的蛋白质，而这些特异表达的蛋白质很可能成为免疫预防或化学治疗的“关键”靶分子。目前，对猪囊等孢球虫的研究还主要集中在流行病学调查、药物治疗、分子诊断和免疫保护研究等方面[9-11]，其他球虫病尤其是鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的发育相关的基因组学、转录组学及蛋白质组学方面已有深入研究[12-16]，但对猪囊等孢球虫这类哺乳动物球虫的发育和入侵宿主的分子机制研究还未见有报道。
因此，本研究运用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术结合液相色谱串联质谱LC-MS/MS分析比较猪囊等孢球虫孢子化卵囊与未孢子化卵囊之间差异表达的蛋白质，以期为猪囊等孢球虫的发育生物学、感染与免疫应答机制的研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 样品制备购买无球虫感染的4日龄仔猪10头，连续5 d检测仔猪粪便中无球虫卵囊后，每头仔猪经口感染猪囊等孢球虫卵囊5 000个，感染后每天检测粪便中的卵囊，在第7天排卵囊数量达到高峰时开始收集卵囊并纯化，将纯化后的卵囊一部分采用2.5%重铬酸钾溶液进行体外培养，至孢子化，经液氮迅速冷冻后置-80 ℃保存备用，剩余纯化的未孢子化卵囊直接经液氮迅速冷冻后置-80 ℃保存备用。猪囊等孢球虫卵囊由华南农业大学寄生虫实验室惠赠。
1.2 主要仪器及试剂真空干燥仪、冷冻离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；LC-20AD液相色谱(一维)(Shimadzu)；Dionex Ultimate 3000 RSLCnano液相色谱(二维)(Thermo Scientific)；Q Exactive质谱仪(Thermo Scientific)；分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；基因扩增仪(HEMA，9600)；PMSF(-20 ℃保存，使用前需摇匀使结晶溶解)(上海生工)；裂解液L3 SDS(含0.2%SDS，使用前加入1×PMSF)；胰酶(Promega)；8-plex iTRAQ试剂盒(AB Sciex)；10 KD超滤管(Pall)；UltraSYBR Mixture (High ROX)(康为世纪)；HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康为世纪)。
1.3 蛋白质的提取纯化、iTRAQ标记及质谱检测取适量样本充分研磨加入1 mL裂解液，按常规方法提取蛋白质后，转移至新的EP管中。定量后取200 μg蛋白溶液置于离心管中，加入胰蛋白酶进行酶解，收集管底部共得到100 μL酶解后的样品。取50 μL样品(100 μg酶解产物)转移到新的离心管中，将iTRAQ试剂添加到样品中进行标记，混合标记后的样品，真空冷冻离心干燥，抽干后的样品冷冻保存待用。经液相色谱串联质谱LC-MS/MS分离肽段后，进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测。
1.4 蛋白质鉴定与数据分析进入Cystoisospora suis_uniprot数据库(https://www.uniprot.org/proteomes/UP000221165)进行质谱检索。根据差异表达倍数>2倍和 < 0.5倍，分别选出作为蛋白表达量上调和下调的研究对象。针对差异蛋白进行GO注释、分类和富集分析，KEGG pathway注释分析，pathway分析和富集分析，String等生物信息学分析。统计分析数据以x±s为标准，并对数据进行t检验用来评估组间差异的显著性。应用SPSS18进行统计分析，P < 0.05时表明差异显著。
1.5 实时荧光定量PCR分析验证mRNA的表达水平采用Trizol分别对纯化的猪囊等孢球虫孢子化和未孢子化卵囊进行RNA提取，紫外分光光度计测定RNA浓度；通过反转录试剂盒HiFiScript gDNA Removal cDNA Removal cDNA Synthesis Kit转录成cDNA；参照UniGene上的基因序列用Premier 5.0软件设计特异性qPCR引物(表 1)；采用UltraSYBR Mixture (High ROX)试剂盒进行荧光定量PCR反应，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s(采集荧光信号)，40个循环，循环结束后, 从60 ℃升高到98 ℃获取熔解曲线。每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因(18S rRNA)的平行试验。
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表 1 荧光定量PCR引物序列 Table 1 Sequences of gene-specific primers for qPCR assays |
通过ProteinPilot软件进行蛋白质组学定量分析，检测到804个蛋白，去除没有定量信息和重复性不好的蛋白，选择T检验 < 0.05的蛋白，计算各组数据比值的均值(AVG)，选取AVG≥2为上调蛋白，AVG≤0.5为下调蛋白，发现猪囊等孢球虫孢子化卵囊和未孢子化卵囊相比有38个上调蛋白(95%)和2个下调蛋白(5%)。部分差异蛋白信息见表 2。
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表 2 前十个上调差异表达蛋白信息 Table 2 The top ten up-regulate differentially expressed proteins |
2.2.1 差异蛋白GO分析 差异蛋白按照生物学过程(biological process)、细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)3个方向进行GO功能注释和分类。结果可见，在生物学过程方面，小分子代谢过程包含的差异蛋白最多，有7个；其次是碳水化合物代谢相关的蛋白，有6个。在分子功能方面，离子结合包含的差异蛋白最多，有12个；其次是氧化还原酶活性相关的蛋白，有9个。在细胞组分方面，差异蛋白主要参与含蛋白复合物、核糖体、细胞核、胞外结构、细胞质等的形成(图 1)。
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图 1 差异表达蛋白的GO功能分析 Fig. 1 Gene ontology analysis of differentially expressed proteins |
2.2.2 差异蛋白KEGG pathway分析 在生物体内，不同蛋白相互协调行使其生物学行为，基于Pathway的分析有助于更进一步了解其生物学功能。通过Pathway分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。KEGG pathway分析表明，差异蛋白一共涉及了20个通路(pathway)，见图 2，富集最显著的通路主要包括代谢通路(53.33%)、抗生素的生物合成(46.67%)、次生代谢产物的生物合成(46.67%)和糖酵解/糖异生过程(33.33%)等。
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图 2 差异表达蛋白的通路富集分析 Fig. 2 Enriched KEGG processes analysis of differentially expressed proteins |
2.2.3 String蛋白质互作分析 将差异蛋白比对到STRING-DB数据库中的相应物种蛋白，将蛋白序列提取出来，做蛋白相互作用分析。String蛋白质互作网络分析如图 3所示，球形代表输入的差异蛋白质，其蛋白间的关联用线形表示，连线越多，代表该蛋白处于相对重要的位置或该蛋白的研究相对较多，大部分蛋白至少与其中一个蛋白存在相互作用，Hsp70(TGME49_111720、TGME49_073760)，Hsp90(TGME49_044560)，ADP核糖基化因子1(TGME49_076140)，组蛋白H4(TGME49_039260)，延长因子1α(TGME49_094800)，Ub-CEP52-1(TGME49_089750)，Actin(TGME49_009030)，假定蛋白14-3-3(TGME49_063090)等处在关系互作网的重要节点。
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球形代表输入的差异蛋白质，其蛋白间的关联用线形表示，连线越多，代表该蛋白处于相对重要的位置或该蛋白的研究相对较多 The spherical shape represents the input differential proteins, and the correlation between the proteins is represented by the linear shape. The more the lines are, the more important the position of the proteins are or the more studies on the proteins are 图 3 差异蛋白String分析图 Fig. 3 String analysis diagram of differentially expressed proteins |
为了进一步验证iTRAQ结果的可靠性，试验选取6个差异表达蛋白进行qRT-PCR检测，其中有5个蛋白的结果与iTRAQ结果一致，1个蛋白基因在未孢子化卵囊中未扩增出来。结果表明，iTRAQ技术在本研究中具有可靠性(图 4)。
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图 4 荧光定量PCR验证部分差异表达蛋白mRNA表达水平 Fig. 4 Verification part of differentially expressed proteins by qRT-PCR |
随着人类基因组测序的完成和多种生物全基因组测序工作的结束，学者们已将研究重心从揭示生命的遗传信息转到对功能的研究方向，人类进入后基因组时代，蛋白质组学的研究应运而生，已成为在蛋白质水平上大规模研究基因功能的强有力工具。其中，相对和绝对定量的等量异位标签技术iTRAQ以其高通量、重复性好、能够处理复杂样本和同时进行定性、定量分析的优点，在生命科学各个领域研究不同细胞周期、不同发育阶段、不同生长和营养状况下蛋白质的表达差异上得到了广泛应用。对于寄生虫的蛋白质组学研究，除了基因序列已知的模式生物——自由生活的秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)外[17]，主要集中在某些原虫和少数吸虫及线虫上[12-16, 18-20]，已取得了较大进展。然而，关于囊等孢属球虫的蛋白质组学目前的研究报道较少，其相关的组学信息也几乎是空白，2017年Palmieri等[21]利用新一代测序技术，获得了C. suis的全基因组序列(约84 Mb)，并对11 000多个蛋白质编码基因进行了人工修饰注释，将该工具应用于1 168种疫苗候选基因的鉴定，其中，69%的蛋白功能是未知的。进一步的进化分析表明，C. suis与柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)亲缘关系最远，处于独立的分支，与弓形虫(Toxoplasma gondii)和犬新孢子虫(Neospora caninum)亲缘关系也仅有27.8%和28.1%的相似性，这些数据表明，数据库中C. suis的“组学”信息报道甚少。因此，本研究中的获得的差异蛋白的生物信息学参考数据主要来源于亲缘关系相对较近的T. gondii蛋白质组学数据库。
本研究运用iTRAQ技术，结合LC-MS/MS分析差异表达蛋白质，共鉴定出C. suis有效蛋白174个，其中差异表达蛋白40个，有38个蛋白在孢子化卵囊中呈上调表达，2个蛋白在孢子化卵囊中呈下调表达。刘立恒[12]利用比较蛋白组学方法对柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)未孢子化卵囊和孢子化卵囊两个时期的可溶性蛋白进行了比较分析，发现了18个在两个时期均表达的蛋白点，15个只在未孢子化卵囊阶段出现的蛋白点和21个只在孢子化阶段出现的蛋白点。Katrib等[13]研究发现，一些柔嫩艾美耳球虫蛋白酶基因是球虫纲特有的表达基因，可能在卵囊壁的形成过程中扮演重要角色。Lal等[14]采用多维蛋白质鉴定技术鉴定了E. tenella 812个子孢子，1 528个裂殖子和所有卵囊蛋白，而2-D凝胶蛋白质组学鉴定了230个子孢子和98个裂殖子蛋白质。
KEGG通路分析表明，C. suis孢子化卵囊与未孢子化卵囊中的差异蛋白主要涉及代谢通路、抗生素的生物合成、次生代谢产物的生物合成和糖酵解/糖异生过程等代谢功能。代谢是生命活动的基本特征之一，由细胞内一系列互相关联的生物化学反应组成，同时，也是本研究的结果中富集差异蛋白最多的信号通路，本研究中涉及代谢通路的上调表达蛋白质有烯醇酶2(ENO2)、磷酸丙糖异构酶(TPI-I)、丙酮酸激酶(PYK1)等8个蛋白。刘立恒[12]的研究也发现烯醇酶在E. tenella未孢子化卵囊阶段丰度小于孢子化卵囊阶段，而乳酸脱氢酶丰度在未孢子化卵囊阶段高于孢子化卵囊阶段，然而，丙酮酸激酶仅发现于E. tenella的未孢子化卵囊阶段，与本研究中C. suis的结果不一致。其他学者也发现糖酵解和糖异生是E. tenella所有发育阶段检测到的最丰富的代谢组蛋白[14]。
顶复门原虫的代谢酶基因序列、结构特征明显区别于脊椎动物和大多数的真核生物的代谢酶，这一特征决定糖酵解代谢途径的关键酶可以作为开发新型抗顶复门原虫药物的重要靶标[22]。目前，对顶复门原虫类的糖酵解代谢途径相关酶的研究还仍局限于少数的一些人兽共患寄生虫，对其他种类的相关研究还鲜有详细报道，尤其在其他一些重要的能够引起畜禽严重疾病的顶复门原虫(如C. suis)等的研究几乎空白，而且对糖酵解代谢途径在顶复门原虫不同发育阶段的作用，以及不同物种之间的差异等问题尚未清楚。
烯醇酶(ENO)参与了多个代谢途径，是糖酵解过程中的一个关键酶，催化磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸相互转化。顶复门虫体在不同发育阶段对能量的需求不同，因此参与糖酵解代谢途径的酶在顶复门原虫不同发育阶段的表达量差异明显[23-25]。例如，弓形虫中TgENO1存在于缓殖子阶段，而TgENO2存在于速殖子阶段[25]，有研究表明在弓形虫编码糖酵解酶的基因中，ENO2的沉默对虫体的生长影响最大[26]。本研究中，在孢子化卵囊呈上调表达的ENO蛋白经比对分析，与T. gondii的ENO2具有90.5%的相似性，表明C. suis中也存在ENO2，且在孢子化卵囊中呈高丰度表达，提示ENO2可能在C. suis孢子化卵囊发育中起重要作用；与 E. tenella ENO仅有73.7%的相似性，也进一步明确了C. suis属于肉孢子虫科的重新分类地位。
ENO除了具有经典的糖酵解功能外，还位于各种病原体表面，越来越多的证据表明这类在细胞表面或分泌的烯醇化酶参与了病原生物与寄主的互作，在病原生物侵染寄主的过程中起到了重要的作用[27]。E. tenella中的ENO在子孢子发育阶段能被检测到，在裂殖子阶段其表达量得到进一步提高，在激活条件下，显微观察表明，这些糖酵解酶重新定位(relocalised)在子孢子上，另外一部分分泌出来，定位显示ENO不仅存在于细胞质中，参与糖酵解过程；部分位于核上，可能具有核活性，参与转录调控；部分分泌到细胞外，还可能会参与细胞侵袭过程[28]。杨晓娇[29]研究发现，ENO存在于微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)的整个卵囊壁上，卵囊壁的破裂是子孢子黏附、侵袭宿主细胞的很重要的一步。伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)和恶性疟原虫(P. falciparum)卵囊表面也被证实存在ENO，该酶似乎有助于卵囊附着在蚊子的中肠上皮上，并通过与内部烯醇化酶基序(DKSLVK)结合来招募纤维溶酶原(plasminogen，PLG)，这种相互作用对于寄生虫的入侵和卵囊的形成是必不可少的[30]。
磷酸丙糖异构酶(TPI)被发现存在于几乎所有的生物体，包括哺乳动物、昆虫、真菌、植物和大多数细菌，在糖酵解、糖原异生、脂肪酸生物合成以及磷酸戊糖代谢中都发挥着重要的作用，对于有效的能量生成是必不可少的。此外，TPI可引起宿主产生强烈的免疫反应，在疫苗研究和免疫诊断中受到极大关注，尤其在血吸虫的研究中较为深入，已有大量文献报道血吸虫TPI对于血吸虫感染具有显著的免疫保护作用[31]，在其他寄生虫(如微小牛蜱、捻转血矛线虫、弓形虫等)也有相关报道[32-34]。TPI作为顶复门原虫糖酵解过程中催化磷酸二羟基丙酮转化为3-磷酸甘油醛的关键酶，对于原虫的生长、发育、侵袭宿主及繁殖尤为重要。本研究中TPI-I在猪囊等孢球虫的孢子化卵囊中呈上调表达，KEGG分析表明，TPI-I不仅参与代谢通路，糖酵解/糖异生过程，还参与抗生素的生物合成、次生代谢产物的生物合成、碳代谢、氨基酸的生物合成、果糖和甘露糖的代谢及磷酸肌醇代谢等代谢途径，利用荧光定量qRT-PCR也进一步验证了该基因在孢子化卵囊中呈高丰度表达，说明TPI-I在猪囊等孢球虫孢子化过程及进一步的入侵宿主方面可能起到关键作用。
丙酮酸激酶(PYK)是糖酵解的3大关键酶之一，在糖酵解中扮演着重要的角色，控制着整个糖酵解的进行。在糖酵解的最后一步，丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸将高能磷酸基转移给ADP生成ATP和丙酮酸。T. gondii存在两种类型丙酮酸激酶(PYK1和PYK2)，分别定位在细胞质和顶质体[22]。Xia等[22]通过对弓形虫PYK的研究，发现维持丙酮酸稳态对弓形虫碳代谢平衡及生长非常关键，PYK1抑制导致碳代谢紊乱，降低ATP水平，积累大量支链淀粉，造成严重的生长缺陷，这些生长缺陷能够通过外源添加乳酸和丙氨酸进行拯救。单独敲除PYK2对虫体生长影响不大，但同时缺失PYK1和PYK2导致T. gondii顶质体丢失和虫体死亡。研究还发现，T. gondii除了能够利用葡萄糖和谷氨酰胺，也能够利用乳酸和丙氨酸作为碳源，具有代谢灵活性，所有的这些碳源均需转化为丙酮酸，丙酮酸处于T. gondii碳代谢的中心。这些结果表明，糖酵解途径中至少生成丙酮酸这一步对虫体非常关键。本研究中，PYK1在C. suis孢子化卵囊中呈高丰度表达，分别与牛孢子虫(Besnoitia besnoiti)和T. gondii的PYK1具有92.8%和90.6%的相似性，提示PYK1在孢子化发育过程中扮演着重要角色。
ADP核糖基化因子和延长因子Tu(elongation factor Tu)在本研究中呈下调表达，ADP-核糖基化因子属蛋白翻译后修饰类型，在细胞增殖、转录调控、DNA损伤修复、基因组稳定性、细胞分化与信号转导和肿瘤的发生发展等生理和病理生理过程起着十分重要的作用。ADP-核糖基化可通过激活E3泛素连接酶RNF146，参与抑癌蛋白PTEN的泛素化和降解，促进肿瘤形成[35]，还可干扰E3泛素连接酶TRAF6激活核转录因子-κB信号通路，从而参与炎症反应、免疫应答和防御病毒感染[36]。延长因子Tu在各组织中不同发育期的表达水平不同，表达调控与能量代谢水平有着密切的联系，其功能和调控对细胞的生长发育有重要意义[37]。在蛋白质翻译过程中，Tu可催化延伸反应中氨酰t-RNA的结合，与结合有氨酰t-RNA和GTP的核糖体形成四元复合物[38]。有研究表明延长因子的过表达引发293T细胞的Gl期阻滞及生长抑制[39]，延长因子Tu在癌组织与肿瘤细胞中也呈现出表达异常[40]。本研究中，ADP核糖基化因子和延长因子Tu在孢子化卵囊发育中均呈现低表达，也提示其在卵囊发育中起调控作用。
此外，热休克蛋白HSP70、HSP90、组蛋白H4、晚期胚胎发生丰富的结构域蛋白等其他功能蛋白在C. suis孢子化卵囊中均呈现上调表达。本试验通过比较和分析这些差异表达蛋白质，为进一步研究C. suis孢子化发育机制，及发现新的生物标志物提供了参考依据。本研究结果为猪囊等孢球虫的发育生物学、感染与免疫应答机制的研究奠定基础。
4 结论以猪囊等孢球虫(C. suis)为研究对象，运用iTRAQ技术，结合LC-MS/MS分析其在孢子化卵囊和未孢子化卵囊之间的差异表达蛋白质，结果共鉴定出有效蛋白174个，其中，差异表达蛋白40个；差异表达蛋白中，38个蛋白在孢子化卵囊中呈上调表达，2个蛋白在孢子化卵囊中呈下调表达。这些差异蛋白主要包含小分子代谢过程、碳水化合物代谢相关、离子结合、氧化还原酶活性相关的蛋白，参与含蛋白复合物、核糖体、细胞核、胞外结构、细胞质等的形成；涉及代谢通路、抗生素的生物合成、次生代谢产物的生物合成和糖酵解/糖异生过程等代谢功能；大部分差异蛋白至少与其中一个蛋白之间存在互作。
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