2. 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室, 龙岩 364012;
3. 预防兽医学与生物技术福建省高校重点实验室, 龙岩 364012
, LI Jianlei1, ZHU Yuting1, CHEN Yu1, LIN Ze1, WU Qiong1,2,3, LI Yan1,2,3, SUN Yanfa1,2,3
2. Key Laboratory of Fujian Province Livestock Epidemic Prevention and Control and Biological Technology, Longyan 364012, China;
3. Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology(Longyan University), Longyan 364012, China
Apelin是由脂肪细胞产生和分泌的一种细胞因子[1]。Apelin前体由77个氨基酸组成，转录后在体内被血管紧张素转化酶2剪接成为Apelin-36、Apelin-17、Apelin-13和Apelin-12等多种活性肽，其中Apelin-13的活性最强[2]。Apelin是G蛋白偶联受体血管紧张素Ⅱ受体样蛋白-J(APJ)的内源性配体，两者在人和动物体内广泛表达[3]。Apelin已被证明参与调节心血管和体液内环境平衡、食物摄入、细胞增殖和血管生成等过程，也参与脂肪代谢的调控[4]。在细胞水平上，Apelin-13可以抑制3T3-L1前体脂肪细胞的增殖和分化，从而减少脂肪细胞脂质聚集和甘油三酯含量[5]；提高3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取能力从而改善胰岛素抵抗[6]；增强3T3-L1脂肪细胞水-甘油通道蛋白7(AQP7)基因的表达水平，从而影响细胞的脂肪代谢[7]。在体内试验中，经Apelin-13酰胺的酰化类似物的长期治疗，可改善糖尿病和高脂喂养小鼠的血脂状况[1]；提高糖尿病大鼠肝和骨骼肌糖脂代谢基因的表达水平[8]。
探索细胞因子调控血脂代谢及其机理，可以更加有效地降低畜禽高血脂症的发生，提高畜牧生产效率和经济效益。Apelin作为脂肪细胞因子，参与血脂代谢的调控，但其对血脂代谢调控的机理鲜见报道。肝作为脂肪代谢的主要器官，在对脂肪的消化、吸收、转运以及合成与分解代谢中发挥重要作用。因此，本研究通过对小鼠皮下注射Apelin-13，进行肝组织转录组测序，探索Apelin-13调控小鼠脂肪代谢及其可能的机理。
1 材料与方法 1.1 动物与处理动物试验方案经龙岩学院伦理委员会批准。试验用昆明小白鼠购自闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司。Apelin-13肽由强耀生物科技有限公司合成。试验选取日龄为18 d、体重相近的小鼠96只，公母各半。试验分为4个处理，每个处理4个重复，每个重复6只。对照组和3个试验组小鼠每天早晨腹腔皮下分别注射100 μL 0.9%的生理盐水、10、20和50 μg·kg-1的Apelin-13，试验期为14 d。注射剂量参考前人的试验研究[9-10]。
1.2 测定指标1.2.1 生长性能 每天早晨记录小鼠的采食量，每7 d空腹12 h后测定小鼠的体重。计算试验期间小鼠的平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(F/G)。试验期结束，进行断头处死后剖取小鼠腹部脂肪称重，计为腹脂量(AFW)，以体重为基础计算腹脂率(AFP)。
1.2.2 Apelin-13和血脂含量 小鼠禁食12 h后断头采血，经2 000 r·min-1离心5 min后分离血清，-80 ℃保存备用。使用北京方程生物科技有限公司血清Apelin-13试剂盒测定血清Apelin-13含量，具体测定方法参照试剂盒说明书。使用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、高密度载脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度载脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，具体测定方法参照试剂盒说明书。
1.3 转录组测序试验结束后，取小鼠肝组织，液氮保存，进行RNA提取、RNA-seq及荧光定量PCR(qPCR)验证。
1.3.1 RNA-seq 按照张敏等[11]的方法提取肝组织样品总RNA并检测总RNA纯度和完整性，对照组和试验组各3个样品总RNA量≥39.3 μg，RIN≥8.7，28S/18S≥1.4，符合建库和测序要求。RNA-seq文库构建和测序均由百迈客生物有限公司完成。共构建6个文库，使用Illumina Novaseq高通量测序平台进行测序。原始测序数据(raw reads)经过质量控制后获得clean reads。得到clean reads之后，使用HISAT2软件[12]将clean reads比对到小鼠参考基因组序列(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-95/fasta/mus_musculus/)。
1.3.2 DEGs筛选、GO功能富集和通路富集分析 对各样本中基因的表达量进行统计，并用FPKM算法对表达量进行归一化处理。采用edgeR软件[13]进行差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)的筛选，筛选标准为差异倍数≥1.5且P < 0.05。采用R包clusterProfiler[14-15]对DEGs分别进行GO富集分析和KEGG富集分析。进行GO功能富集分析时，以基因组为背景，统计每个GO分析中基因与背景基因之间的差异，对P值进行校正，定义校正后的P < 0.05为这些基因的功能在该GO类别中显著富集。进行KEGG富集分析时，以基因组为背景，根据注释结果以及功能分类，将DEGs进行生物通路分类，校正后的P < 0.05时，表明DEGs富集在一条通路中。
1.3.3 qPCR验证 对照组和处理组每组各选取3个样本，提取RNA后进行反转录，每个样本设3个重复，以β-actin为内参，进行DEGs相对表达量的测定，与RNA-seq结果进行对比，验证RNA-seq结果的准确性。所用引物由Primer Premier 5.0软件设计。选取脂肪代谢相关的DEGs和引物见表 1，具体按照孙艳发[16]的方法进行。试验结束后，基因的相对表达量采用2-ΔΔCT方法进行计算[17]。其中ΔCT=目的基因的CT值-相应cDNA模板的β-actin内参的CT值，ΔΔCT =目的基因的ΔCT值-参照基因的ΔCT值。本研究中，均以对照组中基因的ΔCT值为参照基因，计算基因的相对表达量。
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表 1 qPCR引物序列 Table 1 qPCR primer sequences |
小鼠生产性能和血液指标数据使用SAS 8.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan’s法进行多重比较，结果以“平均数±标准差”表示，P < 0.05和P < 0.01分别表示差异显著和差异极显著；qPCR采用SPSS 19.0统计软件中的独立样本的T检验对对照组和试验组的基因表达量进行显著性检验。
2 结果 2.1 Apelin-13对小鼠生长性能和腹脂沉积的影响由表 2可知，与对照组相比，每天注射50 μg的Apelin-13降低了小鼠ADG、AFW和AFP, 提高了ADFI和F/G，但未达显著水平(P>0.05)。
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表 2 Apelin-13对小鼠生长性能和腹脂沉积的影响 Table 2 Effects of Apelin-13 on growth performance and abdominal fat deposition in mice |
由表 3可知，与对照组相比，皮下注射Apelin-13极显著提高了各处理组小白鼠血清Apelin-13浓度(P < 0.01)，且随着注射剂量的升高血清Apelin-13浓度也随之升高。Apelin-13显著降低了血清TG含量(P < 0.05)，极显著提高了HDL-C含量(P < 0.01)，对血清T-CHO和LDL-C含量没有显著影响。
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表 3 Apelin-13对小鼠血清Apelin-13和血脂含量的影响 Table 3 Effects of Apelin-13 on serum Apelin-13 and blood lipid contents in mice |
2.3.1 对比率与基因组区域分布 选取对照组和50 μg Apelin-13处理组肝组织进行RNA-seq。将RNA-seq测序结果与参考基因组进行比对，根据参考基因组的区域信息分别为外显子(Exon)区、内含子(Intron)区和基因间隔(Intergenic)区。各测序样本和参考基因组的对比率和部分区域基本一致，比对率在94.61%~96.52%之间，且80%以上的区域位于基因组的Exon区域(图 1)。
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A.测序样本与小鼠参考基因组的对比率。其中C1、C2、C3为对照组小鼠肝组织样本，T1、T2、T3为50 μg Apelin-13处理组小鼠肝组织样本；下同。B.基因组外显子(Exon)区、基因间(Intergenic)区、内含子(Intron)区在所有Mapped Reads中所占的百分比 A. The ratio of the sequencing samples mapped to the mice reference genome. C1, C2 and C3 samples from control and T1, T2 and T3 samples from 50 μg Apelin-13 treatment; the same as below. B. The ratio of mapped reads of exon(Exon), intergenic(Intergenic) and intron(Intron) regions in genomic 图 1 测序样本的对比率与基因组不同区域的比例图 Fig. 1 Histogram of mapped ratio of samples and mapped reads of genomic regions ratio |
2.3.2 Apelin-13处理小鼠肝组织中DEGs 本研究共检测到690个DEGs，其中包括340个上调基因和350个下调基因。根据FPKM值进行聚类分析表明，对照组和处理组DEGs明显地聚为两组(图 2)。
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横坐标代表样品名称及样品的聚类结果，纵坐标代表的差异表达基因及其聚类结果。颜色代表基因表达水平，红色代表上调表达，绿色代表下调表达 The abscissa represents the sample name and the clustering result of the samples, and the ordinate represents the differentially expressed genes and their clustering result. The color represents the expression level of the gene in the samples, red indicates the gene up-regulation expression, while green indicates gene down-regulation expression 图 2 Apelin-13处理小鼠肝组织差异表达基因的聚类热图 Fig. 2 Heatmap of differentially expressed genes in mouse liver tissue under Apelin-13 treatment |
2.3.3 Apelin-13处理小鼠DEGs的GO和KEGG富集分析 对485个完全注释的DEGs进行GO富集分析。这些基因显著(P < 0.05)富集在37个生物学过程、14个分子功能和3个细胞组分GO项中。其中生物学过程、分子功能前10个GO项和细胞组分GO分析结果见图 3。这些GO相包括睾酮刺激的细胞反应(cellular response to testosterone stimulus)、对二苯乙烯的反应(response to stilbenoid)、葡萄糖代谢过程的正调控(positive regulation of glucose metabolic process)、生热(heat generation)、细胞对食物的反应(cellular response to food)、脂质代谢过程的正调控(positive regulation of lipid metabolic process)、脂质生物合成过程的负调控(negative regulation of lipid biosynthetic process)、葡萄糖刺激下细胞胰岛素分泌的负性调节(negative regulation of insulin secretion involved in cellular response to glucose stimulus)、糖异生的负调控(negative regulation of gluconeogenesis)、脂肪贮存负调节(negative regulation of lipid storage)、小分子结合(small molecule binding)、胰岛素激活受体活性(insulin-activated receptor activity)、转运活性(transporter activity)、信息素活性(pheromone activity)、信息素结合(pheromone binding)、肽抗原结合(peptide antigen binding)、视黄酸结合(retinoic acid binding)、β-2-微球蛋白结合(beta-2-microglobulin binding)、血红素结合(heme binding)、磷酸吡哆醛结合(pyridoxal phosphate binding)、MHC Ⅰ类蛋白复合物(MHC class Ⅰ protein complex)、细胞器膜(organelle membrane)和细胞器膜的组成成分(integral component of organelle membrane)。这些DEGs富集的GO项主要与膜组分、物质结合以及脂质代谢密切相关。
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图 3 Apelin-13处理小鼠肝组织差异表达基因的GO富集分析结果 Fig. 3 The plot of GO enrichment analysis for differentially expressed genes in mouse liver tissue under Apelin-13 treatment |
Apelin-13处理后小鼠肝组织DEGs显著富集(校正的P < 0.05)于27条信号通路中(资料未显示)。其中6条信号通路与脂肪代谢、糖代谢密切相关(表 4)，最显著富集的信号通路为视黄醇代谢(retinol metabolism)，该通路参与发育、分化、增殖和凋亡等多种生物过程的正常调节。这些通路中的DEGs大多数为细胞色素P450基因(Cyp)家族和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因(Ugt)家族基因，分别参与内源性底物的氧化代谢与脂肪酸的形成、降解。为了验证RNA-seq的准确性，选取Cyp3a13、Cyp26b1、Cyp4a31、Cyp2c55、Ugt1a6a、Ugt1a8、Ugt1a5和Ugt1a10 8个基因进行qPCR验证。结果显示，qPCR中基因表达量的变化趋势与RNA-seq的结果基本一致(表 5)，说明RNA-seq结果是准确的。
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表 4 脂肪和糖类代谢相关的信号通路和差异表达基因 Table 4 The pathways and differentially expressed genes related to lipid and glucose metabolism |
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表 5 RNA-seq数据qPCR验证结果 Table 5 qPCR results for verification of RNA-seq data |
肝在脂肪的消化、吸收、合成、分解与运输等脂肪代谢中起关键的作用[18]。肝组织合成的TG、CHO等在肝细胞中贮存，一部分则释放到血液中。过多的TG和CHO在血液中形成高血脂症，可引起一些严重危害人体和动物健康的疾病，如动脉粥样硬化[19]、脂肪肝[20]等。Apelin作为脂肪因子，在能量和脂肪代谢[21-22]中发挥重要的作用。Apelin可以促进胰岛素的分泌，并通过AMPK依赖途径提高葡萄糖的转运；Apelin可以通过降低脂肪细胞游离脂肪酸的释放抑制脂肪分解作用[21]。Higuchi等[23]研究表明，连续每天注射0.1 μmol·kg-1的Apelin两周可以不同程度降低标准小鼠和高脂日粮小鼠脂肪组织中TG含量和脂肪组织沉积。在人类组织和细胞的研究中，Apelin可以提高葡萄糖的转运，但对脂肪组织和细胞没有促进脂肪分解的作用[24]。本研究中，注射10~50 μg·kg-1 Apelin-13对小鼠腹脂的沉积没有显著影响，这可能是注射的剂量不同造成的。综合童国相等[5]的研究，Apelin对脂肪的调控作用可能与物种、组织和细胞类型有关。
Apelin血浆含量与血脂含量密切相关[4]，不同研究结果不尽相同。Tapan等[25]研究发现，肥胖儿童血浆Apelin和HDL胆固醇含量降低，而TG含量较高。Soriguer等[26]发现，糖尿病患者血清的Apelin含量与葡萄糖、TG含量呈正相关。Tasci等[27]研究表明，LDL胆固醇升高患者血浆中Apelin水平较低。而给予载脂蛋白E基因缺失的小鼠每天2 mg·kg-1体重Apelin-13处理，可以降低T-CHO、TG、LDL胆固醇水平和游离脂肪酸水平，对TG水平和HDL胆固醇水平没有显著影响[28]。本研究中，小鼠皮下注射Aplein-13后显著提高了血清Apelin-13含量，同时降低了血清TG，提高了HDL-C含量，可能有助于缓解心血管病的风险。
Apelin作为脂肪因子，可以通过不同的信号途径调节能量和脂肪代谢[29]，但具体的机理尚未被阐明。本研究发现，最显著富集的信号通路为视黄醇代谢。该信号通路参与发育、分化、增殖和凋亡等多种生物过程的正常调节[30]。视黄醇可以调控哺乳动物组织的脂肪代谢，通过促进脂肪的动员和分解代谢，降低小鼠体内脂肪，改善胰岛素敏感性；在人和动物模型中经常用于诱导高甘油三酯血症[31]。该信号通路中，富集了细胞色素P450(Cyp)家族和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(Ugt)家族2个超家族基因。细胞色素P450(CYP450)是微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族氧化酶，广泛分布在各种组织和器官中，参与固醇类生物合成、脂肪酸和类固醇激素等内源性底物的氧化代谢[32]。CYP450参与脂肪酸形成和降解，在脂肪代谢中具有重要的作用[33-34]。UGT主要负责生物转化Ⅱ期途径，即葡萄糖醛酸化过程[35]。同时，在短链脂肪酸代谢、糖脂的生物合成中发挥重要的生理功能[36]。Apelin-13处理小鼠后，这两个超基因家族中的大部分基因表达上调，说明Apelin-13可能通过视黄醇代谢中Cyp和Ugt两个超家族基因调控小鼠的血脂代谢，降低血清中TG含量并提高HDL-C含量。
4 结论 4.1皮下注射Apelin-13显著降低了血清TG含量(P < 0.05)，极显著提高了HDL-C含量(P < 0.01)；
4.2Apelin-13处理后, 肝组织共检测到690个DEGs，包括340个上调和350个下调表达基因；
4.3DEGs最显著富集的信号通路为视黄醇代谢，其中Cyp和Ugt两个超家族基因大部分上调表达；
4.4pelin-13可能通过调控视黄醇代谢中的Cyp和Ugt两个超家族基因的表达调控小鼠的血脂代谢。
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