2. 西藏农牧学院动物科学学院, 林芝 860000;
3. 西藏高原饲料加工工程研究中心, 林芝 860000
2. College of Animal Science, Tibet Agricultural and Animal Husbandry University, Linzhi 860000, China;
3. Tibetan Plateau Feed Processing Engineering Research Center, Linzhi 860000, China
藏猪是青藏高原的主要猪种，主要分布在海拔高度为2 900~4 100 m的高山、峡谷、树林及草地等场所[1-3]。传统的藏猪养殖以放牧为主，藏猪食物主要由富含纤维的青草、树叶、树根等组成，精料摄入有限，虽然藏猪生长缓慢，却形成了良好的耐粗饲与抗病力强等特性[4-5]。随着对藏猪资源需求的增大，藏猪养殖逐渐向规模化发展[6]。目前，西藏高原饲养的猪主要包括放牧藏猪、舍饲藏猪与瘦肉型猪(杜×长×大，DLY猪)。
肠道微生物特别是盲肠与结肠微生物对动物机体十分重要，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是猪肠道中丰度最高的门[7]。在低海拔地区的研究表明，藏猪与瘦肉型生长肥育猪盲肠微生物具有较高的相似性[8]，但在高海拔地区，尚未见有关报告。猪消化道中存在的微生物，有很大一部分在体外不能培养[9]，而采用16S rRNA高通量测序技术可确定微生物的分类地位[10]。本研究以饲喂在西藏高原的放牧藏猪、舍饲藏猪和DLY猪为研究对象，采用Illumina Miseq测序平台[11]通过16S rRNA高通量测序技术检测了3个类型猪盲肠微生物的群落组成与多样性的差异，为更好地研究藏猪肠道微生物特性及藏猪资源开发提供了参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物5头160日龄放牧藏猪购买于西藏林芝市巴宜区布久乡，平均海拔3 000 m，藏猪自然状态下全年放牧不补饲，食物主要是青草、果实、树叶与树根等。
舍饲藏猪与DLY猪各5头，30日龄断奶后圈养于西藏农牧学院教学实习牧场消化代谢室内，海拔2 980 m，按阶段饲喂相同的玉米-豆粕型无抗饲粮至160日龄。消化代谢室内温湿度维持在适宜的范围内，温度16~21 ℃，相对湿度65%~80%。自由采食与饮水，饲养管理按照常规程序进行。
1.2 屠宰采样将放牧藏猪、舍饲藏猪与DLY猪各5头分别采用前腔静脉放血致死法屠宰，立即剖开腹腔，取出肠道，结扎盲肠与回肠交界处，无菌条件下用眼科剪在盲肠闭合段开一小口，将盲肠食糜挤进无菌的冻存管，放入液氮中速冻后转入－80 ℃冰箱中保存。
1.3 总DNA提取在无菌条件下，使用粪便基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)从盲肠食糜中提取总基因组DNA，食糜重量为200 mg。用1%琼脂糖凝胶(Invitrogen公司)检测DNA浓度和纯度。使用NanoDrop NC 2000(Thermo Scientific公司)测定DNA的总量。
1.4 PCR扩增选择16S rRNA基因的V3-V4区域作为扩增目的片段，前引物序列为：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)，后引物序列为：806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。样品统一稀释到20 ng·μL-1作为模板，进行PCR扩增。扩增体系(25 μL)为：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1 μL，下游引物(10 μmol·L-1) 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。扩增参数为：预变性98 ℃ 2 min；变性98 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对约500 bp大小目标片段进行切胶回收，回收采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒。
1.5 文库制备及测序采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit试剂盒制备测序文库。首先对上述扩增产物进行序列末端修复，通过试剂盒中的End Repair Mix2切除DNA序列5′端的突出碱基，同时添加一个磷酸基团，补齐3′端的缺失碱基。在DNA序列的3′端添加A碱基以防止DNA片段自连，同时保证目标序列能与测序接头相连(测序接头3′端有一个突出的T碱基)。在序列5′端添加含有文库特异性标签(即Index序列)的测序接头，使DNA分子能被固定在Flow Cell上。采用BECKMAN AMPure XP Beads，通过磁珠筛选去除接头自连片段，纯化添加接头后的文库体系。对上述连上接头的DNA片段进行PCR扩增，从而富集测序文库模板，并采用BECKMAN AMPure XP Beads再次纯化文库富集产物。最后通过2%琼脂糖凝胶电泳，对文库做最终的片段选择与纯化。
上机测序前，先对文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit试剂盒。之后，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit试剂盒在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量。将合格的各上机测序文库梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序。使用MiSeq PE250测序仪进行2×300 bp的双端测序，试剂为MiSeq Reagent Kit V3。
1.6 测序信息分析首先对高通量测序的原始下机数据根据序列质量进行初步筛查；通过质量初筛的序列按照引物和Barcode信息，识别分配入对应样本，并去除嵌合体等疑问序列。使用QIIME1软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，version 1.8.0，http://qiime.org/)[12]，调用UCLUST这一序列比对工具[13]，对前述获得的序列按97%的序列相似度进行归并和分类操作单元(OTU)划分[14]，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，采用Greengenes数据库(Release 13.8，http://greengenes.secondgenome.com/)[15]进行比对，获取每个OTU所对应的分类学信息，根据获得的OTU丰度矩阵，使用R软件(version 2.15.3)计算各样本共有OTUs的数量，并通过Venn图直观地呈现各样本所共有和独有OTU所占的比例。使用QIIME1软件(version 1.8.0)，对OTU丰度矩阵中每个样本的序列总数在不同深度下随机抽样，以每个深度下抽取到的序列数及其对应的OTU数绘制稀释曲线。为了比较不同样本的多样性，首先对OTU丰度矩阵中的全体样本根据最低测序深度样本的90%统一进行随机重抽样(即“序列量拉平处理”)，从而校正测序深度引起的多样性差异；随后，使用QIIME1软件(version 1.8.0)分别对每个样本计算4种alpha多样性指数:辛普森指数(Simpson)，Chao1指数(Chao1)、ACE指数(ACE)和香农指数(Shannon)。使用QIIME1软件(version 1.8.0)获取各样本在门、纲、目、科、属五个分类水平上的组成和丰度分布表，并通过柱状图呈现分析结果。使用R软件(version 2.15.3)，对丰度前50位的属进行聚类分析并绘制热图。
为深入挖掘3个类型猪微生物群落结构及多样性差异，采用IBM SPSS 21.0软件对各项数据进行方差分析，方差分析显著则采用Duncan’s法进行多重比较，结果采用“平均数±标准差”表示，P < 0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。
2 结果 2.1 盲肠微生物群落的丰富度及多样性分析通过高通量测序技术，在15个样本的16S rRNA基因V3-V4区测序共获得了659 904条有效序列，其中放牧藏猪213 031条、舍饲藏猪219 417条、DLY猪227 456条，平均长度为413.7 bp。去除丰度值低于全体样本测序总量0.001%的OTUs，并按97%的序列相似度进行归并和OTU划分后，3个类型猪OTUs数量结果见表 1。可见，放牧藏猪盲肠微生物OTUs总数显著高于舍饲藏猪和DLY猪(P < 0.05)，舍饲藏猪与DLY猪无显著差异(P>0.05)。
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表 1 盲肠微生物群落的OTUs数量与alpha多样性指数 Table 1 The quantity of OTUs and alpha diversity indices in the cecal microbiota |
通过Venn图(图 1)发现，3个类型猪的共有OTU 1 789个。放牧藏猪与舍饲藏猪的共有OTU 2 456个，放牧藏猪与DLY猪的共有OTU 2 468个，舍饲藏猪与DLY猪的共有OTU 2 397个。独有OTUs显示，放牧藏猪908个，舍饲藏猪886个，DLY猪772个。
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图 1 OTUs韦恩图 Fig. 1 Venn diagram of OTUs |
通过R软件(version 2.15.3)绘制的稀释曲线(图 2、图 3)显示，当每个样本的测序深度达到10 000 reads时，所有曲线均到达了平台期，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，继续增加测序深度已无法检测到大量尚未发现的新OTUs。Alpha多样性指数分析显示(表 1)，除Simpson外，放牧藏猪Chao1、ACE及Shannon均显著高于舍饲藏猪与DLY猪(P < 0.05)，而舍饲藏猪与DLY猪无显著差异(P>0.05)。以上说明放牧藏猪盲肠微生物群落丰富度与多样性均高于舍饲藏猪与DLY猪，而饲养方式相同的情况下，舍饲藏猪与DLY猪盲肠微生物群落丰富度与多样性是一致的。
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图 2 样品稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction curves of different samples |
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图 3 样品香农-威纳曲线 Fig. 3 Shannon-Wiener curves of different samples |
使用RDP classified对所有序列进行分类，比较不同样本在各分类水平所含有的微生物类群数量(表 2)，结果表明，在属水平上，放牧藏猪的微生物类群数量显著高于DLY猪(P < 0.05)，舍饲藏猪与二者无显著差异(P>0.05)；其他分类水平3个类型猪微生物类群数量趋于一致(P>0.05)。
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表 2 各分类水平的微生物类群数 Table 2 The number of microbiota at each taxonomic level |
在门水平上，3个类型猪盲肠微生物被划分为13个门(图 4)。放牧藏猪盲肠微生物群落的98.19%是由相对丰度超过1%的门组成，分别是厚壁菌门(Firmicutes)84.75%、拟杆菌门(Bacteroidetes)5.91%、变形菌门(Proteobacteria)2.35%及放线菌门(Actinobacteria)5.18%；舍饲藏猪盲肠微生物群落的97.92%是由相对丰度超过1%的门组成，分别是厚壁菌门(Firmicutes)72.24%、拟杆菌门(Bacteroidetes)16.68%及螺旋体门(Spirochaetes)9.00%；DLY猪盲肠微生物群落的98.78%是由相对丰度超过1%的门组成，分别是厚壁菌门(Firmicutes)79.01%、拟杆菌门(Bacteroidetes)2.93%、螺旋体门(Spirochaetes)7.84%及变形菌门9.00%。厚壁菌门(Firmicutes)是在3个类型猪中相对丰度最高的门，其中放牧藏猪相对丰度显著高于舍饲藏猪(P < 0.05)，DLY猪与前两者差异不显著(P>0.05)；舍饲藏猪拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度显著高于放牧藏猪与DLY猪(P < 0.05)，但变形菌门(Proteobacteria)相对丰度显著低于DLY猪(P < 0.05)；放线菌门(Actinobacteria)与疣微菌门(Verrucomicrobia)在放牧藏猪盲肠微生物中的相对丰度显著高于舍饲藏猪与DLY猪(P < 0.05)；其他菌门的相对丰度在3个类型猪上没有显著差异(P>0.05)。
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图 4 门水平的微生物群落组成及相对丰度 Fig. 4 Composition of the microbiota and the relative abundance at phylum level |
在属水平上，图 5列举了3个类型猪相对丰度大于0.1%的属。放牧藏猪盲肠微生物群落被划分为56个属，其中88.37%是由相对丰度大于1%的4个属与未分类菌属构成的，分别是乳杆菌属(Lactobacillus)8.54%、苏黎士杆属(Turicibacter)4.80%、双歧杆菌属(Bifidobacterium)4.67%、梭菌属(Clostridium)1.72%及未分类属(Unclassified)68.67%。舍饲藏猪盲肠微生物群落被划分为50个属，其中91.31%是由相对丰度大于1%的6个属与未分类属构成的，分别是乳杆菌属(Lactobacillus)4.32%、密螺旋体属(Treponema)8.58%、苏黎士杆属(Turicibacter)4.36%、梭菌属(Clostridium) 1.35%、瘤胃球菌属(Ruminococcus)1.25%、布劳特氏菌(Blautia)1.15%以及未分类属(Unclassified)70.21%。DLY猪盲肠微生物群落被划分为56个属，其中91.64%是由相对丰度大于1%的4个属与未分类属构成的，分别是乳杆菌属(Lactobacillus)16.26%、密螺旋体属(Treponema)7.79%、苏黎士杆属(Turicibacter)2.47%、梭菌属(Clostridium)1.79%以及未分类属(Unclassified)63.33%。显著性分析表明，放牧藏猪共11个属相对丰度显著高于舍饲藏猪与DLY猪(P < 0.05)，分别是双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Dehalobacterium、YRC22、萨特氏菌属(Sutterella)、费氏刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、Shuttleworthia、艰难杆菌属(Mogibacterium)、Allobaculum、贪铜菌属(Cupriavidus)、草酸杆菌属(Oxalobacter)与丛毛单胞菌属(Comamonas)，差异显著的属分别来自于厚壁菌门(Firmicutes，5个)、变形菌门(Proteobacteria，4个)、放线菌门(Actinobacteria，1个)与拟杆菌门(Bacteroidetes，1个)。
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图 5 属水平的微生物群落组成及相对丰度 Fig. 5 Composition of the microbiota and the relative abundance at genus level |
在属水平下，将所有样品的群落组成数据根据分类单元的丰度分布或样本间的相似程度加以聚类，根据聚类结果对分类单元和样本分别排序，并通过热图加以呈现(图 6)。结果显示，3个类型猪共聚类了50个属，微生物群落一致性均较好，相对较清晰地分成了3个组。舍饲藏猪与DLY猪相似度更高，被聚类到1个大分支，放牧藏猪单独聚为1支，与前两者相似度较低。
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图 6 属水平的微生物群落丰度聚类图 Fig. 6 Microbiota abundance heatmap at genus level |
肠道微生物与饲粮养分利用和动物机体健康有重要关系[16]。Niu等[17]研究发现，饲粮粗纤维表观消化率与变形菌门、软壁菌门和TM7成正相关。Quan等[18]研究表明，高饲料转化效率(FCR)猪盲肠的Shannon指数明显高于低FCR猪，在毛螺菌科、瘤胃球菌科、理研菌科及普雷沃氏菌科中聚集了多个OTUs。Yang等[19]研究发现，疣微菌科、克里斯滕森菌科、毛螺菌科与艾克曼菌中的OTUs与猪饲料高转化效率成正相关，普氏菌属和粪杆菌属中的OTUs与猪饲料高转化效率成负相关。肠道微生物的稳定性与机体健康有直接联系[20]，变形菌门与胃肠道疾病密切相关[7]。藏猪是我国特有的高原放牧型猪种，具有耐粗饲、抗病力强等特点[21-22]。本研究中，放牧藏猪厚壁菌门、放线菌门与疣微菌门丰度以及与菌群丰富度和多样性有关的Chao1指数、ACE指数及Shannon指数均显著高于舍饲藏猪与DLY猪，变形菌门丰度仅为DLY猪的26.1%，说明放牧藏猪具有更佳的饲粮纤维利用率与机体健康状况。藏猪不仅自身具有较强的抗病力，也可以将自身抗病力通过粪便微生物传导至其他动物(小鼠[23]、仔猪[24])，还可以提高仔猪肠道吸收酶的活性[25]；从藏猪肠道提取的抗菌肽可以抑制大肠杆菌的生长[26]。在本研究中，萨特氏菌属(Sutterella)与炎症呈负相关，但只有放牧藏猪有这个属，表明放牧藏猪抵抗力强于其他两个类型猪。
养殖环境、饲粮类型等对猪肠道微生物有重要影响。仔猪在断奶后，食物由猪乳变成了植物性为主的饲料，肠道微生物alpha多样性、乳杆菌科、疣微菌科、韦荣球菌科与普雷沃氏菌科相对丰度显著升高，拟杆菌科和肠杆菌科相对丰度显著降低[27-28]。饲粮中淀粉类型、纤维类型均会影响肠道微生物，同时，肠道菌群的组成会根据碳水化合物的来源发生变化[16]。Sun等[29]研究发现，与玉米淀粉组相比，饲喂土豆淀粉后，生长肥育猪肠道微生物在门水平并无显著变化，但是在属平上，梭菌属和八叠球菌相对丰度显著降低，粪球菌属有升高的趋势。
Tian等[30]研究表明，非淀粉多糖(NSP)的摄入，提高了仔猪变形菌门的相对丰度及厚壁菌门与拟杆菌门的比值，在属水平降低了乳杆菌属与瘤胃球菌属的相对丰度，同时，葡聚糖组普氏菌属、罗氏菌属与梭菌属相对丰度最高。本试验中，放牧藏猪食物中的碳水化合物主要以纤维类为主，而舍饲藏猪与DLY猪主要摄入淀粉类来源的饲料，饲养方式不同带来食物摄入差异，放牧藏猪与舍饲藏猪在多个检测指标差异显著，而舍饲藏猪与DLY猪差异多不显著，因此，食物中碳水化合物来源的不同可能是造成本试验中3个类型猪盲肠微生物差异性的主导因素。
藏猪肠道微生物与饲粮纤维降解具有重要的相关性，Yang等[31]、Meng等[32]与Ma等[33]从采食含有90%牧草日粮的藏猪肠道中鉴定和培养了分泌降解纤维类物质的菌种BY-2、BY-3与BY-4，发现，分离出的菌株迅速生长并产生纤维素酶。Yang等[7]进一步研究表明，藏猪抗病性及其对高纤维植物的消化能力可能与核心菌群丰度高以及大量未知、未分类的细菌有关。而本研究发现，放牧藏猪在属水平未分类属的相对丰度占到73.76%，高于DLY猪(66.40%)11.08%，这与前人研究结果是一致的。
本研究发现，放牧藏猪盲肠微生物OTUs数量及alpha多样性指数均高于舍饲藏猪，说明饲养方式对藏猪盲肠微生物具有显著影响；舍饲藏猪与DLY猪OTUs数量及alpha多样性指数差异不显著，说明在相同的舍饲条件下，品种(藏猪与DLY猪)对盲肠微生物无显著影响，饲养条件才是影响盲肠微生物结构与多样性的决定性因素。但也有研究表明，不同猪种间在肠道微生物上各有特点。有研究者比较了杜洛克猪、长白猪、约克夏猪与汉普夏猪粪便微生物的异同发现，在门水平上，汉普夏猪的厚壁菌门丰度显著低于长白猪和约克夏猪，而拟杆菌门呈相反趋势；在纲水平上，汉普夏猪梭菌纲丰度最低，而拟杆菌纲显著高于长白猪与约克夏猪；在属水平上，汉普夏猪链球菌属和普氏菌属相对丰度最高，杜洛克猪的乳杆菌属丰度最高，梭菌属在约克夏猪丰度最高而在汉普夏猪丰度最低[34]。Pajarillo等[35]研究发现，长白猪与约克夏猪在微生物组成上相似，而与杜洛克猪区别明显，具体表现在，在门水平上，长白猪厚壁菌门丰度更高，约克夏猪变形菌门丰度最高；在纲水平上，拟杆菌纲在杜洛克猪中丰度最高，而变形菌纲在约克夏猪中丰度最高；在属水平上，长白猪乳杆菌属丰度最高，杜洛克猪链型杆菌属、考拉杆菌属与罕见小球菌属丰度更高，而约克夏猪小杆菌属丰度更高。可见，在相同猪种的不同研究中，微生物的组成和多样性不完全一致，这可能是饲养环境、饲料构成、抗生素的使用及检测手段等因素造成的。
4 结论本试验首次研究了饲养在西藏高原主要的3个类型猪盲肠微生物的构成及多样性，发现，放牧藏猪盲肠微生物群落结构的丰富度和多样性最高。饲养方式是影响藏猪盲肠微生物的主要因素，相同饲养条件下，品种(藏猪与DLY猪)并不会对盲肠微生物的丰富度和多样性造成显著影响。本研究结果可为进一步研究藏猪肠道微生物的特异性提供参考。
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