2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用国家教育部重点实验室, 成都 610041;
3. 红原县科学技术和农业畜牧局, 阿坝 624400;
4. 四川省阿坝州畜牧科学研究院, 阿坝 623000
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education, Chengdu 610041, China;
3. Agriculture and Animal Husbandry Science and Technology Bureau of Hongyuan County, Aba 624400, China;
4. Animal Husbandry Science Institute of Aba Autonomous Prefecture, Aba 623000, China
牦牛(Bos grunniens)是主要分布在我国青藏高原及其毗邻海拔3 000 m以上高寒牧区的特有牛种资源之一。与平原牛种相比，牦牛的生长速度慢、性成熟晚、繁殖效率低，这些是限制高原畜牧业发展的主要因素[1-2]。雄性生殖功能及其高质量的精子是提高牦牛繁殖效率和现代繁殖技术推广的前提基础。睾丸支持细胞(sertoli cell)在精子发生和成熟过程中具有支持、保护以及为生精细胞提供营养等作用，同时促进雄激素结合蛋白(androgen binding protein, ABP)的合成，ABP又可与雄激素结合，对精子发生具有重要的调控作用[3-4]。
胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)在细胞生长、增殖、分化和存活的调控中起着至关重要的作用，与机体的器官和系统密切相关，其家族成员包括IGF-I、IGF-II、胰岛素3个细胞表面受体(IGF-I受体、IGF-II受体和胰岛素受体)及6个IGF结合蛋白[5]。前期研究显示，IGF对生殖器官功能的调控起重要作用，尤其是对睾丸的正常发育和功能维持至关重要[6-8]。Pitetti等[4, 8]研究报道，敲除IGF-I基因、沉默胰岛素受体和胰岛素样生长因子受体的小鼠，其睾丸支持细胞的增殖率显著降低，精子数量也显著降低，性成熟后睾丸比正常小鼠的小75%，甚至出现雄性不育现象。2018年王亚营等[9]研究发现，IGF-I可通过调节支持细胞中Cyclin D1的表达来影响睾丸发育，从而调控雄性胚胎的生殖发育和成年动物的精子质量。目前，关于IGF-II的研究主要集中在其对早期胚胎发育、癌细胞分化、体细胞分裂增殖等的影响[10-11]。IGF-II对乳腺上皮细胞、软骨细胞、成纤维细胞等具有促进分裂增殖的作用，且IGF-II的表达具有发育和组织特异性[12]。其次，IGF-II是控制等位基因表达的经典表观遗传机制[13-14]，对于哺乳动物的正常发育和生殖至关重要。Tang等[15]研究表明，IGF-II与雄性生殖障碍密切相关，主要通过靶向印迹IGF-II而改变精子的发生过程。刘振山等[16]发现，犏牛睾丸组织中IGF-II的表达量显著低于其亲本，推测其参与了犏牛精子发生过程的阻断，导致雄性犏牛不育。此外，IGF作为细胞凋亡的抑制调控因子，通过与特异性的靶细胞表面受体结合，引起细胞内一系列的信号途径和基因转录表达发生改变，尤其是凋亡调控因子(Bax)和B细胞凋亡调节因子2(B cell apoptosis regulator, Bcl-2)[17-18]。由此可见，IGF-II在睾丸发育和功能中可能发挥着重要的作用。然而，IGF-II是否参与调控牦牛睾丸支持细胞的分裂增殖尚不清楚，IGF-II在雄性牦牛睾丸支持细胞分裂增殖活动中的作用及其调控机制等也未见相关报道。
为此，本研究以牦牛的支持细胞为研究对象，通过构建IGF-II的干扰载体，研究IGF-II对牦牛睾丸支持细胞分裂增殖的影响。本研究结果将为探讨IGF-II对牦牛睾丸支持细胞的分裂增殖调控提供基础数据，为进一步探索提高牦牛精子质量和雄性生殖效率奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂二氧化碳培养箱(Thermo, 美国)，荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)，细胞生长分析仪ECIS CP96 (Applied BioPhysics, 美国)；DMEM/F-12 (Gibco)，胰蛋白酶(Thermo, 美国)，IGF-II抗体(Abcam, 美国)，质粒pLKO.1(重庆拓世众合生物有限公司)。
1.2 牦牛支持细胞的分离与培养在成都周边的牦牛屠宰场，健康的雄性牦牛被屠宰后，立即用灭菌剪刀、镊子取下牦牛的睾丸组织，用含双抗的生理盐水清洗后，放入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)中，置于冰盒中2 h内带回实验室处理。牦牛支持细胞的分离与培养参照王亚营等[9]与Bernardino等[19]的操作方法并进行了优化。取出睾丸将表面白膜剥离，用PBS清洗3次后转移至培养皿中加入浓度为1 g·mL-1Ⅰ型胶原酶和0.25%(w/v)透明质酸酶，置于37 ℃培养箱中消化20 min。然后将组织取出，再次重复上述消化程序。将消化下来的细胞先后通过200和400目过滤筛，收集过滤液，1 500 r·min-1离心5 min，用PBS清洗2遍，加入含10% FBS的培养液制成单细胞悬液。待细胞生长融合至80%时，用胰酶消化细胞，接种细胞至新培养皿中，使其密度约为104个·mL-1。放入爬片，继续培养48 h，采用Feulgen染色法鉴定细胞。
1.3 pLKO.1-shRNA-IGF-II载体的构建采用质粒提取试剂盒(北京百迈客)提取质粒pLKO.1，对其使用EcoR I进行酶切处理，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。再利用Omega的凝胶回收试剂盒对载体进行回收，具体步骤按照产品说明书进行。回收产物-20 ℃保存备用。通过NCBI中的GenBank数据库查找牛IGF-II基因序列，运用两个在线shRNA设计软件Clontech和Sigmaaldrich设计3对干扰片段和1对阴性对照干扰片段(表 1)，3对shRNA干扰序列经过Blast比较，与山羊基因库无明显的同源性，交由南京金斯瑞公司合成。shRNA的退火产物与pLKO.1载体酶切回收大片段按比例用T4 DNA连接酶4 ℃连接过夜。将构建的质粒进行双酶切电泳、测序鉴定。对验证无误的质粒菌液进行扩增，使用无内毒素质粒提取试剂盒(北京百迈客)进行抽提与纯化。
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表 1 干扰引物序列 Table 1 RNAi primer sequences |
将睾丸支持细胞接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2培养。通过添加不同梯度浓度的嘌呤霉素(0.5、1、2、3、4、5 μg·mL-1)，筛选出最适细胞筛选的嘌呤霉素浓度。根据PolyJetTM In Vitro DNA Transfection Reagent(Sigma, 美国)试剂使用说明进行细胞转染，24 h后换液并加入嘌呤霉素(1.2 μg·mL-1)筛选7 d。将剩余的少量细胞进行扩增培养，待细胞生长融合至80%时，即可用于后续试验。
1.5 qRT-PCR检测干扰效率提取牦牛睾丸支持细胞的总RNA，反转录得到cDNA，以此作为模板进行qRT-PCR。根据GenBank公布的基因序列，用Primer 5.0进行引物设计(表 2)，采用TaKaRa公司的SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒检测各组的干扰效率。反应体系为cDNA 1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL，SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL。qRT-PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s共40个循环。所有qRT-PCR反应至少重复3次，用2-ΔΔCt法计算比较分析目的基因相对表达量。
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表 2 qRT-PCR引物信息 Table 2 Primers information of qRT-PCR |
确定干扰效率后，选择转染后干扰效率最高组的牦牛睾丸支持细胞，用RIPA裂解液提取其蛋白质，用PBS进行梯度稀释，加入BCA工作液，37 ℃避光孵育30 min，利用酶标仪测定波长570 nm的标准品和待测蛋白的吸光度，根据标准曲线相关回归方程得到蛋白的浓度。取样品总蛋白约50 μg进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。一抗孵育IGF-II(1:500，ab9574)4 ℃过夜，二抗羊抗兔(1:10 000，ab6721)室温2 h，然后加化学发光剂，压片显影。
1.7 细胞生长检测利用Applied Biophysics公司的ECIS CELL Proliferation Measurement System分析仪(CP96)，通过细胞底物阻抗传感法(ECIS)检测在IGF-II基因干扰后睾丸支持细胞的生长情况。将96孔电阻板在37 ℃放置30 min，使孔板与培养箱温度相同，孔中依次加入100 μL 10 mmol·L-1半胱氨酸电极平衡液和200 μL细胞悬液(3.75×105个·mL-1)，每1 h检测一次细胞生长情况，共检测72 h。
1.8 数据统计与分析所有组别的试验至少重复3次，SPSS 19.0进行ONEWAY ANOVA检验，用SSR法进行多重比较，P＜0.05时即认为差异显著，P＜0.01时即认为差异极显著。
2 结果 2.1 pLKO.1-shRNA-IGF-II载体的构建及鉴定对提取的重组质粒pLKO.1-shRNA-IGF-II进行双酶切鉴定，经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 1A所示，可看见两条带。将重组质粒在pLKO.1的特定引物下PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图 1B所示，预期空载体得到的一个247 bp的片段，而相应的干扰载体将得到片段大小为299 bp的片段。通过plko F：5′-CGATACAAGGCT-GTTAGAGAGAT -3′分别与shRNA1、shRNA2和shRNA3的反义引物配对进行PCR反应鉴定，获得大小为250 bp的片段(图 1C)，由此表明，pLKO.1-shRNA-IGF-II干扰载体构建成功。
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M. DNA相对分子质量标准；1. pLKO.1-shRNA1质粒；2. pLKO.1-shRNA2质粒；3. pLKO.1-shRNA3质粒；NC.空载体 M. DL2000 marker; 1. pLKO.1-shRNA1 plasmid; 2. pLKO.1-shRNA2 plasmid; 3. pLKO.1-shRNA3 plasmid; NC. pLKO.1 图 1 pLKO.1-shRNA-IGF-II载体的鉴定 Fig. 1 Identification of pLKO.1-shRNA-IGF-II plasmid |
利用qRT-PCR对转染后的牦牛睾丸支持细胞中的IGF-II mRNA的表达水平进行检测。结果显示，与对照组相比，pLKO.1-shRNA1、pLKO.1-shRNA2和pLKO.1-shRNA3转染组睾丸支持细胞中IGF-II基因的表达量分别下调至41.2%、19.1%和35.6%，干扰效果明显(图 2)。由此表明，shRNA1、shRNA2和shRNA3均能显著抑制牦牛睾丸支持细胞IGF-II的表达，其中shRNA2干扰效果最佳。
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不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，下同 The different lower case letters showed significant differences (P < 0.05), the same lower case letter showed no significant difference (P>0.05), the same as below 图 2 qRT-PCR检测IGF-II mRNA表达水平 Fig. 2 Detection of IGF-II mRNA expression level by qRT-PCR |
将干扰效率最高的shRNA2质粒转染牦牛睾丸支持细胞后，使用嘌呤霉素筛选稳定细胞株，然后用Western blotting检测IGF-II蛋白的表达(图 3)。pLKO.1-Control只是使核苷酸序列错乱，对IGF-II的表达无干扰作用。利用Image-Pro Plus 6.0对免疫印迹条带进行灰度值分析，结果显示，与对照组相比，pLKO.1-shRNA2可使内源性IGF-II的表达量减少76.3%(P < 0.05)，表明pLKO.1-shRNA2能够有效抑制牦牛睾丸支持细胞中IGF-II蛋白的表达。
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图 3 pLKO.1-shRNA2干扰IGF-II表达的效果 Fig. 3 Interfering effect of pLKO.1-shRNA2 on IGF-II expression |
将pLKO.1-Control和pLKO.1-shRNA2质粒转染及筛选后形成的稳定细胞株使用CP96细胞增殖仪器检测细胞的分裂增殖情况(图 4)。通过特制的96孔板培养细胞后，对96孔板底电阻的测定转化为细胞的覆盖率，截取不同时间点的数据，分析发现，空白组与pLKO.1-Control组在72 h内的细胞生长情况无显著差异，pLKO.1-shRNA2干扰组与其它两组在培养48 h后出现显著差异(P < 0.05)。
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Control. pLKO.1-Control质粒转染组；shRNA2. pLKO.1-shRNA2质粒转染组；NC.未处理组。*.表示同一时间点比较差异显著(P < 0.05) Control. pLKO.1-Control group; shRNA2. pLKO.1-shRNA2 group; NC. Untreated group. *. Indicate the significant difference at the same time point (P < 0.05) 图 4 干扰IGF-II对支持细胞增殖的影响 Fig. 4 Effects of IGF-II interference on sertoli cells proliferation |
对转染及筛选后形成的稳定细胞株进行相关家族基因及凋亡相关基因表达丰度的qRT-PCR检测(图 5)。干扰IGF-II的表达后，IGF-I和IGF-IIR基因表达出现了显著的上调(P < 0.05)，Bax无显著变化，IGF-IR与Bcl-2出现显著的下调(P < 0.05)。Bax/Bcl-2比值显著增加，由此表明，干扰IGF-II对牦牛睾丸支持细胞具有促凋亡的作用。
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Control. pLKO.1-Control质粒转染组；shRNA2. pLKO.1-shRNA2质粒转染组。*.表示差异显著(P < 0.05) Control. pLKO.1-Control group; shRNA2. pLKO.1-shRNA2 group. *. Indicate the significant difference (P < 0.05) 图 5 干扰IGF-II后对支持细胞基因表达的影响 Fig. 5 Effects of IGF-II interference on genes expression in sertoli cells |
睾丸支持细胞是位于哺乳动物雄性生殖细胞周围最重要的组成部分，其数量是决定睾丸大小和血睾屏障的关键因素[20-21]。本试验利用质粒pLKO.1构建IGF-II干扰载体，载体上携带有Puromycin抗性基因，便于转染细胞后的筛选[22-23]。在嘌呤霉素的筛选下，获得了转染后的阳性细胞株。酶切及RT-qPCR检测显示成功构建了IGF-II干扰载体，且能有效抑制牦牛支持细胞中IGF-II的表达。比较干扰效率发现，shRNA2显著高于其它组，为此选用该组进行后续试验。
在大鼠精子发生过程中，IGF-II具有选择性旁分泌或自分泌调节精原细胞增殖的作用[24-25]；在犏牛睾丸中，IGF-II mRNA表达水平极显著低于其亲本，作为印记基因在犏牛睾丸组织中IGF-II基因的DNA甲基化程度与其亲本比较无显著差异[9]。可见，IGF-II的异常可能影响到雄性生殖发育过程，本研究通过干扰IGF-II探究其对于牦牛支持细胞的影响，对后续研究犏牛雄性生殖的调控有着重要的意义。本试验结果发现，干扰IGF-II后支持细胞的细胞覆盖率显著下降，表明IGF-II对支持细胞的分裂增殖出现了抑制作用。IGF-I和IGF-II可以调节多种细胞活动，包括细胞存活、刺激细胞增殖、分化和代谢[26]。在成肌细胞、肝细胞、内皮细胞以及多种癌细胞的研究中发现，IGF-II对于细胞的增殖有正调控作用[27-28]，虽然目前有关IGF-II对于睾丸支持细胞影响的研究较少，但是，IGF-II对于普通细胞增殖调控的作用明显，并且对支持细胞的增殖也有明显的调控作用。通过体外培养小鼠支持细胞条件性的使IGF-IR失活，发现小鼠支持细胞有增殖减少、死亡细胞增加的情况[29]，IGF-IR作为IGF-I、IGF-II的受体可以与其结合后磷酸化共同的底物，并激活下游效应物网络中包括磷脂酰肌醇3-激酶和丝裂原活化蛋白激酶通路，这些通路都与细胞的增殖、分化和存活相关。
Zhang等[30]通过超表达和干扰发现，IGF-II可通过调控IGF-IR的表达来影响成纤维细胞增殖。本研究中，干扰IGF-II后睾丸支持细胞的分裂增殖受阻，可能是由于IGF-IR的下调引起的。siRNA介导的IGF-IIR下调可以进一步增强IGF-II作用于细胞的分裂增殖，从而引起IGF-II介导拯救细胞的凋亡[31]。IGF-II在抑制细胞凋亡方面发挥着至关重要的作用[32]。小鼠卵巢细胞和人乳腺癌细胞体外培养过程中，IGF-II通过抑制Bax基因的表达调控细胞凋亡[33]，揭示了Bax和Bcl-2为IGF-II调节细胞凋亡的重要信号通路，IGF-II能够抑制各种类型细胞凋亡，通过多种信号通路调控相关基因转录表达，从而发挥抑制凋亡的生物学效应[34]。Bcl-2作为抗凋亡基因，在细胞中主要结合Bax而抑制凋亡发生[35]。而Bax是促凋亡基因，过表达Bax蛋白将加速细胞凋亡进程。Bax/Bcl-2比值决定凋亡的启动与终止，在细胞的凋亡过程中起重要调控作用[36]。本研究中，Bax/Bcl-2比值有升高趋势，表明干扰IGF-II促进了牦牛睾丸支持细胞的凋亡。
本试验发现，干扰IGF-II后IGF-IIR出现了明显的上调，并且促进了凋亡。表明在IGFs信号中，IGF-II与IGF-IIR对于细胞凋亡的拯救并非是双向的，IGF-IIR并不能拯救单因素IGF-II干扰下的细胞凋亡[37]。本试验揭示，IGF-II对于牦牛睾丸支持细胞的分裂增殖调控有重要的影响，其具体作用机制有待进一步研究。本研究为探讨牦牛犏牛生殖差异提供了新思路和研究方向，为后续研究IGF-II在精子发生和雄性生殖中的作用奠定了理论基础。
4 结论本研究通过pLKO.1慢病毒载体包装系统成功构建了IGF-II干扰载体。干扰IGF-II显著抑制了牦牛睾丸支持细胞的增殖。此外，IGF-II可能是通过调控牦牛睾丸支持细胞中同家族基因(IGF-I和IGF受体)和相关凋亡基因的表达来影响睾丸的生长发育，具体的作用机制有待进一步的研究。
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