2. 云南农业大学 动物科学技术学院, 昆明 650201;
3. 云南农业大学动物医学院, 昆明 650201
, LI Zhuo1,2, KUI Hua2, JIAO Deling1,2, LI Yuying1,2, QING Yubo1,3, GUO Jianxiong1, WEI Yunfang1,2, WEI Hongjiang1,3
2. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
3. College of Veterinary Medicine, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China
乌金猪分布于云南、贵州及四川三省相邻的乌蒙山系和金沙江流域，被毛为黑色，少数为棕黄色(火毛系)，头长且嘴筒粗而直，在额部多有“八卦”形皱纹且多旋毛[1]。因其具有体质结实、体躯较窄、后肢发达、耐粗饲、抗逆性强、胴体瘦肉率高、肌间脂肪含量高等优点，2003年被列为国家级珍贵保护品种[2-3]，是制作腊肉火腿的优质材料[4]。由于生存环境不断恶化及猪肉需求日益增长，各地区大量引进外来优质猪种进行杂交改良，培育了大河乌猪[5]、宣和猪[6]等生产性能和繁殖性能优良的新品种，导致乌金猪原始品种的存栏量不断下降[7-8]。目前，乌金猪(火毛系)品种在原乌金猪分布的云、贵、川境内都已罕见。
为保存乌金猪遗传资源，云南省建立了乌金猪保种场，并同时开展世代选育进行活体保种。但是，活体保种需维持一定的群体数量，饲养管理工作量大，维持保种的成本较高，且面临着动物疫病爆发、自然灾害侵袭的威胁，群体有效数量下降到一定水平后，还易受到遗传漂变、交配体制、近交系数等因素的制约[9-11]。超低温冷冻保种可将精子、卵子、体细胞或胚胎置于-196 ℃液氮中长期保存，是目前广泛应用的动物保种方式[12]。但猪射精量大、精子密度低、精液含水高，在温度急剧下降时易失去活力，导致精液冻存后存活率较低，复苏后精子活力较差[13-15]。猪的胚胎又因胚胎脂质含量较高，低温耐受性差，增加了冷冻保存的难度[16]，因此，活体保种和生殖细胞保种仍存在应用缺陷，加之非洲猪瘟的区域性爆发，给我国地方猪种遗传资源的保护增加了巨大的压力，研究开发新型的猪遗传资源保护的方法和途径已迫在眉睫。
体细胞冷冻保存是最为常用的保种技术，该技术保种成本较低、复苏后细胞活力较高、保存年限较长，可以保存不同日龄、不同性别的种猪资源，与体细胞克隆技术结合后可快速恢复原有种猪资源群体，高效地实现乌金猪遗传资源的保护，为地方猪种遗传资源的保护探索新的方法和途径。本课题组前期已通过体细胞克隆技术成功获得了版纳微型猪近交系克隆猪[17]，结合动物基因编辑技术获得了一系列基因修饰滇南小耳猪[18-22]，但克隆技术普遍面临着效率低的问题，克隆猪的生长性能及繁殖性能也备受关注，且采用体细胞克隆技术实现地方猪种的完整保存和复活的报道较少。
本研究在前期开展大量调查的基础上，选取去势或年龄较大的公、母乌金猪作为保种对象，建立耳组织成纤维细胞系，利用体细胞克隆技术获得克隆乌金猪公、母个体，并对克隆乌金猪的生长发育和繁殖性能指标进行监测和分析，综合评估猪体细胞克隆技术在地方猪种保护应用上的可行性，为优良地方猪种或濒危猪种的遗传资源保护提供新的保种途径。
1 材料与方法 1.1 试验材料及试剂耳组织样品采自云南省昭通市彝良县15头乌金猪火毛系，其中，3头公猪，12头母猪；猪卵巢采自云南省昆明市呈贡鸿腾屠宰场。
胎牛血清(FBS)以及TCM-199培养基购自Gibco公司；其它所用试剂及药品均购自Sigma公司。
1.2 耳组织采样及成纤维细胞建系培养1.2.1 耳组织的采集 用手术刀片刮去耳缘周围的毛，75%酒精充分消毒处理后，灭菌超纯水冲洗，剪下约1 cm2耳缘组织，放入含5%双抗的DMEM培养液中，置于冰盒中带回实验室。
1.2.2 成纤维细胞系的分离及传代培养 用含5%双抗的PBS溶液充分清洗耳组织样品，放入不含双抗的PBS溶液中清洗后将组织充分剪碎并移入12.5 cm2细胞培养瓶中，加入Ⅳ型胶原酶溶液(79% DMEM，20% FBS，1%双抗，0.1%胶原蛋白酶)，放入培养箱中消化2~4 h；通过离心去除胶原酶溶液并收集细胞，加入含10%FBS、1%双抗的细胞完全培养液，放入38 ℃，5%CO2，5%O2，90%N2的培养箱中进行原代培养，待细胞增殖至汇合度达到约60%时，0.25%胰蛋白酶消化，一部分传代培养供体细胞核移植，另一部分细胞冻存备用。
1.3 体细胞核移植及胚胎移植1.3.1 卵母细胞成熟培养 猪卵巢用37 ℃生理盐水清洗后保温，4 h内运回实验室。选取直径3~8 mm大小的卵泡，注射器抽取卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes, COCs)，用TALP(Tyrode’s Albumin Lactate Pyruvate medium)溶液清洗，显微镜下用口吸针挑取COCs。在含0.1 mg·mL-1丙酮酸、0.1 mg·mL-1 L-半胱氨酸盐酸、10%猪卵泡液、10 ng·mL-1 EGF的TCM-199成熟培养液滴中，于38.5 ℃，5% CO2培养箱(APC-30D，ASTEC，日本)中培养38~42 h。
1.3.2 体细胞核移植 供体细胞在含0.5%FBS的培养液中饥饿处理48 h使其处于G0/G1期，核移植开始前约1 h收集细胞备用。
0.1%透明质酸消化COCs，挑取排出第一极体的成熟卵母细胞放入NCSU23预处理液(0.1 μg·mL-1秋水仙胺、0.05 mol·L-1蔗糖及4 mg·mL-1牛血清白蛋白)中处理0.5~1 h。在核移植操作液(10 μmol·L-1 HEPES和0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液，含0.1 μg·mL-1秋水仙胺，5 μg·mL-1细胞松弛素B和10% FBS)中，用显微注射针将第一极体及相邻胞质去除，将供体细胞注射入卵周间隙。
1.3.3 电融合及电激活 在融合液(0.05 mmol·L-1 Mg(C2H3O2)2，0.25 mg·mL-1 D-山梨醇，20 mg·mL-1 BSA和0.5 mmol·L-1 HEPES)中，用电融合仪(ET3，FUJIHIRA，日本)将去核卵母细胞和供体细胞融合，设定参数(脉冲电压25 V·mm-1，脉冲持续时间20 μs，脉冲次数1次)。结束后移入PZM3培养液中平衡2 h。
在激活液(0.25 mol·L-1 D-山梨醇，0.05 mmol·L-1 Mg(C2H3O2)2，0.01 mmol·L-1 Ca(C2H3O2)2，0.1 mg·mL-1 BSA)中对融合后重构胚进行电激活，设定参数(脉冲电压150 V·mm-1，脉冲持续时间100 μs，脉冲次数1次)。结束后移入5 μg·mL-1 CB的PZM3中，置于38.5 ℃，5%CO2，5%O2，90%N2的培养箱中平衡2 h后移入PZM3培养液中进行体外培养。
1.3.4 胚胎移植 选用6头三元杂交母猪(杜洛克♂ ×(长白♂ ×大白♀))、8头滇南小耳母猪、1头滇杜杂交母猪(杜洛克♂ ×滇南小耳猪♀)作为胚胎移植的代孕母猪，在发情期筛选体况中上等母猪进行胚胎移植手术，将克隆胚胎移植入母猪输卵管内。胚胎移植30 d后对代孕母猪进行B超(HS-101V，Honda Electronics Co. Ltd.，Yamazuki，Japan)诊断，记录代孕母猪妊娠与仔猪出生情况。
1.4 克隆乌金猪生长发育性能检测对6、7月龄12头克隆猪进行体重测量，早晨空腹，逐头装于猪笼内称重。使用测杖进行体高、胸宽、胸深、臀宽、前额宽测量，使用皮尺进行体长、头长、胸围、腹围、臀围、尾长、尾围、管围的测量，测量方法参见文献[23]。
1.5 乌金猪繁殖性能检测母猪生长至5月龄开始查情，选择7头克隆母乌金猪(♀)在发情期与4头克隆公乌金猪(♂)进行自然配种，同一头公猪间隔8~12 h后再次配种，其中，1207号公乌金猪配种未成功，30 d后进行B超诊断，记录克隆母猪的妊娠与仔猪的出生情况。
2 结果 2.1 乌金猪火毛系品种现状调查及样品采集研究组在彝良县经18个月先后5次现场调查，遍及龙安乡、小草坝、龙海乡、牛街乡、龙街苗族彝族乡、奎香苗族彝族乡、树林彝族苗族乡7个乡镇，走访农户及养殖户共12户，找到火毛猪近100头，其中大多为杜洛克杂交后代，而符合乌金猪火毛系特征的仅有3头公猪和12头母猪(图 1A、1B)。公猪年龄分别为3、6、11月龄，其中3月龄个体被去势；母猪年龄差距较大，最小的2月龄，最大的10岁，其中3头母猪被去势，10岁母猪已无繁殖能力，研究组成员对15头乌金猪进行耳组织取样，成功建立了乌金猪耳组织成纤维细胞系(图 1C)，并冷冻保存原代和1代细胞共131管备用(表 1)。
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A.去势的乌金猪个体(♂); B.失去繁殖能力的乌金猪个体(♀); C.乌金猪成纤维细胞系; D.克隆乌金猪个体(♂); E.克隆乌金猪个体(♀); F.克隆乌金猪繁殖的部分后代 A. Castrated Wujin pig (♂); B. Wujin pig losing reproductive capacity (♀); C. Wujin pigs fibroblast cells; D. Cloned Wujin pig (♂); E. Cloned Wujin pig (♀); F. Partial breeding offspring of cloned Wujin pigs 图 1 克隆乌金猪个体及交配繁殖后代 Fig. 1 Cloned Wujin pigs and their breeding offspring |
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表 1 乌金猪耳组织成纤维细胞遗传资源保存情况 Table 1 The statistics of ear fibroblast cell conservation of Wujin pigs |
以3月龄去势公乌金猪耳组织(YLC170604P005)成纤维细胞系作为供体细胞构建了1 995枚克隆胚，将克隆胚胎移植入8头代孕母猪中，胚胎移植30 d后经B超诊断7头妊娠，妊娠率87.5%，4头分娩，分娩率50.0%，共获得11头克隆仔猪，单胎最高3头；以10岁成年母猪耳组织(YLC170604P024)成纤维细胞系为供体细胞构建了2 470枚克隆胚，体外分别培养3和7 d，均可正常卵裂并发育至囊胚，共移植8头代孕母猪，胚胎移植30 d后经B超诊断5头妊娠，妊娠率62.5%，4头分娩，分娩率50.0%，共获得14头克隆仔猪，单胎最高出生5头(表 2)。
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表 2 乌金猪体细胞克隆胚胎移植情况统计 Table 2 The statistics of somatic cell clone embryo transfer of Wujin pigs |
为分析乌金猪火毛系克隆个体(图 1E、1F)的生长发育情况，分别在6、7和8月龄对4头克隆公猪和8头克隆母猪进行体重和体尺的测定(表 3)，结果表明，克隆猪个体生长发育状态正常，母猪较公猪体型更大，生长速度更快。
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表 3 不同月龄乌金猪克隆个体生长指标统计 Table 3 The growth indexes of cloned Wujin pigs with different month ages |
7头参与配种的克隆母乌金猪均成功妊娠，6头母猪产下F1代仔猪共49头，1头产下5头木乃伊胎。其中，活仔39头，25头母猪，14头公猪，平均总产仔数为(8.17±4.22)头，平均产活仔数为(7.80± 3.27)头，平均断奶仔猪数为(5.80±1.79)头，平均初生窝重为(6.05±2.16) kg。F1代仔猪生长至7月龄，母乌金猪(耳号: 8006W2, ♀)在发情期与公乌金猪(耳号: 8006W1, ♂)进行自然交配，妊娠并成功分娩F2代仔猪5头，成活5头，3头公猪，2头母猪，平均初生重为(0.73±0.1) kg(表 4，图 1G)。结果表明，克隆乌金猪及后代均具有正常繁殖能力。
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表 4 克隆乌金猪繁殖性能 Table 4 The reproductive performance of cloned Wujin sows |
乌金猪因具有肉质好的特性，是制作宣威火腿的重要原材料，对其生长性能、遗传繁育性能及种质资源保护方面的研究也逐渐增多。因地理、气候及人文的种种差异，致使乌金猪的保护与开发利用途径不一致，在乌金猪分布的云南、四川、贵州等地区，主要通过建设乌金猪(大河猪)原产地保种场(区)或以农户保种为主，保种方式较为单一，保种场经济效益较低、成本高，维持长期保种的难度大[24]，此外，活体保种存在非洲猪瘟等重大动物疫病爆发等不可控的缺陷。在当前国内非洲猪瘟大爆发流行且缺乏特效药和疫苗的背景下，若只以单一的活体保种对地方猪种进行保护，一旦感染非洲猪瘟疫情，极其可能导致群体灭绝，永久失去宝贵种质资源，损失不可估量，因此, 开展细胞冷冻等保种策略，作为活体保护的重要补充方式，对于应对非洲猪瘟疫情威胁、降低种猪资源灭绝风险具有重要现实意义和长远战略意义[25]。猪精子冷冻保存技术目前也尚未成熟，且只能针对公猪进行保种，冷冻后精子活力低，推广应用范围较为局限，Wongtawan等[26]报道，猪精液分别用0.5 mL细管和2.8 mL多聚平管(4个0.7 mL平管组成)冷冻，冻后精子活力仅为42.8%和44.3%。猪胚胎因其脂肪含量较高，致使猪胚胎冷冻保存的技术难度增大。本试验通过建立15头乌金猪火毛系体细胞系并进行冷冻保存共131管(106个·mL-1)，复苏后细胞成活率≥90%，远远高于精子冷冻的成活率(一般 < 50%)，本研究进一步通过体细胞克隆技术分别获得去势的3月龄公乌金猪和失去繁殖能力的10岁母乌金猪克隆重构胚胎1 995(♂)和2 470枚(♀)，各移植8头代孕母猪，成功生下公、母仔猪各11头和14头，与所报道的精子冷冻及胚胎冷冻相比，体细胞克隆技术高效地实现了地方乌金猪种的保护和复活，同时，通过该技术也成功实现了地方家畜优良品种的培育和快速扩繁[27]。
3.2 体细胞克隆技术对乌金猪生长发育性能及繁殖性能的影响因云南具有独特的地理、气候环境及人文习俗，地方猪种种质资源较为丰富, 各品种间生长发育性能和繁殖性能存在较大的差异。郭海涛等[1]测定了云南省威信县10~13月龄的健康乌金猪30头(均为阉猪)，其平均体高为53.7 cm，平均体长为94.6 cm，平均胸围为83.6 cm，平均体重为48.2 kg。与本研究8月龄克隆乌金猪的平均体高(60.80±2.10) cm(♂)和(60.4±4.20) cm(♀)相差不大，但胸围和体重与本研究获得的克隆乌金猪胸围(95.60±5.30) (♂)、(104.00±12.60) cm(♀)及体重(70.50±9.70) (♂)、(90.20±23.60) kg(♀)相比，克隆乌金猪的胸围和体重增重更快，表明克隆乌金猪与自然繁殖乌金猪相比，克隆乌金猪也能获得正常的生长发育能力。本研究分别选择已去势的3月龄公乌金猪与10岁已无繁殖能力的母乌金猪为供体进行体细胞克隆，共获得11头克隆公乌金猪和14头克隆母乌金猪，各选择4头公猪与7头母猪进行自然交配，获得49头F1代仔猪，F1代初产仔数平均为(8.17±4.22)头，与鲁绍雄等[6]所报道的乌金猪初产仔数为(8.54±3.04)头的结果基本相一致。本研究获得的克隆猪自然交配F1代平均初生重为(0.79±0.12) kg，与尤如华和余宗寿[7]报道的乌金猪平均初生重为0.96 kg结果相差不大，这表明，已去势的公猪或已失去繁殖能力的母猪通过体细胞克隆技术能获得具有正常生长发育能力和繁殖性能的个体，且克隆猪自然交配后能获得生长发育良好的F1代个体，表明体细胞克隆技术可使无繁殖能力的地方优良品种猪个体恢复繁殖性能并正常生长发育，是实现濒危灭绝乌金猪等优质地方品种遗传资源种群扩繁及保护的有效途径。
4 结论本研究成功分离了不同年龄、性别(包括已去势公猪和失去繁殖能力母猪)共15头乌金猪的成纤维细胞，并进行传代培养及冻存，实现了乌金猪遗传资源的长期保存，进一步利用体细胞克隆技术分别构建了公、母乌金猪克隆胚胎各1 995和2 470枚，共移植16头代孕母猪后获得25头克隆乌金猪，克隆乌金猪生长发育正常，性成熟后进行交配繁殖获得39头F1代活仔，并能正常生长发育。本研究通过体细胞克隆技术成功实现了地方优良猪种的保种和扩繁，且克隆的乌金猪火毛系具备正常的生长发育和繁殖性能，表明体细胞克隆技术可为地方猪种的保护和应用提供新的途径。
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