2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
3. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所, 武汉 430064
2. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
3. Institute of Animal Sciences, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China
2019年底,国际糖尿病联盟的统计数据显示,全球糖尿病相关医疗支出高达7 600亿美元,直接因糖尿病死亡的人数超过420万[1]。糖尿病已成为严重危害人类健康的社会问题,不仅给世界各国医疗支出带来巨大负担,也是死亡率高的疾病。糖尿病患者中,90%以上为2型糖尿病,其主要致病因素是能量慢性富集导致外周组织脂质过氧化、氧化应激和系统性低度炎症等级联反应[2-4];糖脂毒性和淀粉样多肽沉积致β细胞凋亡[5-7];胰岛对肠促胰岛素的调控应答失调[8-9],以及肠道菌群代谢功能异常等[10]。
肠促胰岛素主要包括胰高血糖素样肽-1(glucagons like peptide-1,GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose dependent insulinotropic polypeptide,GIP),在营养物质作用下,分别由回肠L细胞和空肠K细胞分泌,作用于β细胞相应受体GLP-1R和GIPR,进而调控β细胞分化增殖、胰岛素合成与分泌等[11-13]。肠促胰岛素效应降低可能是糖耐量降低的主要原因[14-15],GLP-1类似物及其受体激动剂[16-18]是当前2型糖尿病治疗的主流药物。近年研究发现,在病理状态下,2型糖尿病患者营养刺激的GLP-1和GIP分泌正常,但其受体表达严重下调,基于肠促胰岛素的降糖药没有补充任何缺失[19]。在健康个体的口服糖耐量中,GIP占糖促胰岛素效应的60%~70%[20],GIP及其受体信号通路的重要性逐渐被重视[21],解析胰岛β细胞中GIPR的表达机制已成为当前研究热点。
GIP作用于胰岛β细胞发挥调控功能的主要机制是,G蛋白耦联受体活化cAMP,经PKA-CREB信号转导,促进钙离子内流,介导胰岛素基因的表达和胰岛素释放[22]。对脂肪等细胞的研究显示,GIP/GIPR信号还可通过MAPK、Akt和FoxO1通路降低caspase3和bax基因的活性,发挥促增殖和抗凋亡的作用[23]。GIPR低表达与胰岛素抵抗和肥胖保护相关[20],若直接增进GIP/GIPR轴效应,血糖降低的同时会引起肥胖[24]。病理状态下,FoxO1定位于细胞核内[25-26],转录调控氧化应激和促凋亡基因表达,抑制胰岛素信号通路相关基因PPARγ等的表达,并与TCF4竞争性结合β-Catenin,降低TCF4的转录结合能力[27]。GIP下游的Akt、PKA、MAPK 3条通路是否通过TCF4对GIPR进行表达调控,其作用机制仍不清楚。
本研究的目的是鉴定调控GIPR表达的转录因子及相关信号通路,为药物开发增进胰岛β细胞肠促胰岛素效应奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 细胞株、质粒载体及激素 试验所用小鼠胰岛瘤Min6细胞购自上海子实生物科技有限公司;pcDNA3.1(+)-GFP载体及PRL SV4为本实验室王彦芳研究员惠赠;GIP激素的成熟肽序列由武汉百意欣生物技术有限公司合成。
1.1.2 试验试剂 小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia,瑞典,cat:10-1247-01),双荧光素酶检测试剂盒(Progema),lipofectamine2000(Invitrogen),OPTI-MEM(Gibco),质粒提取试剂盒(天根),Akti(Akt抑制剂,CST),PKAi(PKA抑制剂,CST),CCK8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧波生物),TCF4、GIPR、AKT、pAKT与GAPDH抗体(CST),KRBH(Panera)。
1.2 方法1.2.1 GIP激素活性验证 将8~9周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组(Control)和10、100 nmol·kg-1的GIP处理组,每组8个重复。小鼠禁食16 h,禁食期间正常饮水;称取小鼠体重及测定空腹基础血糖。小鼠适应30 min后,按2 g·kg-1体重注射20%葡萄糖溶液,然后按分组为其注射相应剂量的GIP或生理盐水,在15、30、60、90、120 min分别测定血糖。
1.2.2 GIPR表达调控相关筛选 Min6细胞饥饿过夜后,分别在对照组(第1组)、10 nmol·L-1GIP(第2组)、100 nmol·L-1GIP(第3组),5 μmol·L-1 Akti(第4组)、50 μmol·L-1 PKAi(第5组)、100 nmol·L-1 GIP+5 μmol·L-1 Akti(第6组)、5 μmol·L-1 Akti +50 μmol·L-1 PKAi(第7组)、100 nmol·L-1 GIP+5 μmol·L-1 Akti+50 μmol·L-1 PKAi(第8组)培养基中处理6 h,收取蛋白进行Western blot检测。
1.2.3 双荧光素酶检测 将Min6细胞铺到24孔板中,待细胞长至60%~70%,将含有GIPR不同长度启动子序列(3段序列分别为转录起始点上游1 904、1 442和607 bp)的pGL3-basic GIPR promoter、pcDNA3.1-GFP-TCF4质粒、海肾荧光pRL-SV40共转染。48 h后,吸去培养基,DPBS冲洗,加入PLB裂解细胞,室温15 min。在96孔板中加入混匀后的20 μL PLB裂解液,加入100 μL LARII,读取荧光素酶的活性值。再加入100 μL Stop&Glo Reagent,读取renilla内参荧光素酶活性值。样本的荧光素酶活性值=样本的萤火虫荧光素酶活性值/renilla内参荧光素酶活性值。
1.2.4 过表达载体构建 以Min6和小鼠cDNA为模板,分别用加上酶切位点和kozak序列的目的基因引物进行PCR扩增(上游引物:5′-CGGGATCCATGCATCACCAACAGCGAAT-3′,下游引物:5′-CCGCTCGAGTCACATCTGTCCCATGTGAT-3′),并纯化回收扩增片段。PCR体系:模板2 μL,LA酶10 μL,正、反向引物各0.5 μL,ddH2O 7 μL。PCR扩增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,30个循环;72 ℃ 10 min。分别对质粒pcDNA3.1(+)-GFP、pGL3-basic及PCR回收产物进行双酶切及胶回收,利用T4连接酶将目的片段与目的载体连接;最后通过转化,菌液PCR,测序筛选及鉴定pcDNA3.1-GFP-TCF4重组质粒及GIPR启动子片段与pGL3-basic重组质粒;随后进行细胞转染(步骤同siRNA转染)。
1.2.5 siRNA转染 通过NCBI找到小鼠TCF4转录本,将其CDS序列复制到Thermofisher网站中设计siRNA,选择3条靶点相差25 bp以上的高评分序列进行合成。随后进行siRNA转染,找出沉默效率最高的siRNA。将细胞铺到6孔板中待长至70%~80%时进行转染,将5 μL脂质体lipo2000加入125 μL OPTI-MEM混合;同时将siRNA(2.5 μg)稀释于125 μL OPTI-MEM中,并将其加入上一步混合液中混匀;室温孵育15 min后加入6孔板中培养;48 h后收集蛋白进行检测。
1.2.6 蛋白表达定量检测 提取细胞总蛋白,使用BCA试剂盒测定蛋白浓度;经SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳、转膜后,5%脱脂奶粉封闭2 h;加入按比例稀释好的TCF4、GIPR、Akt、pAkt、GAPDH抗体,4 ℃孵育过夜,TBST洗3次,室温二抗孵育45 min;TBST洗3次后滴加发光液显影。
1.2.7 Min6细胞胰岛素分泌能力测定 细胞铺板贴壁后,在对数生长期处理细胞;分别用Akti和PKAi处理6 h,同时设对照组;无糖KRBH将细胞洗3次后,无糖KRBH培养1 h;随后用葡萄糖含量为16.7 mmol·L-1的KRBH刺激1 h;收集上清,按ELISA试剂盒说明书步骤检测胰岛素含量;为矫正细胞数量等造成的误差,用DPBS清洗2遍,提取总蛋白并测定蛋白浓度;所测胰岛素含量与蛋白总量的比值即为Min6细胞胰岛素相对分泌量。
1.2.8 细胞增殖能力检测 细胞生长至80%,消化并重悬细胞,计算出细胞总数;并将其稀释至每毫升培养基(2~5)×104个细胞。96孔板每孔加入100 μL细胞悬液(含2 000~5 000个细胞),在接种细胞后的12、24、36 h,每孔加入10 μL CCK8溶液,37 ℃孵育2 h,用酶标仪在450 nm检测吸光度。
1.3 统计学分析试验数据经过t-test统计学分析,P < 0.05时认为具有统计学意义;绘图使用GraphPad Prism 6软件。
2 结果 2.1 GIP激素活性检测小鼠的糖耐量检测统计结果显示,10或100 nmol·kg-1 GIP处理组曲线下面积均极显著低于对照组(P < 0.01,图 1A),即注射GIP可抑制小鼠血糖的上升。在GIP刺激Min6细胞试验中,10 nmol·kg-1 GIP刺激1 h后,pAkt水平上调,并持续12 h(图 1B),GIPR蛋白表达量在GIP刺激后4和8 h升高(图 1C),表明合成的GIP激素具有生物活性,可激活Akt磷酸化,并促进GIPR表达。
为确定TCF4为GIPR表达的上游基因,通过GIP激活及Akt、PKA信号通路的阻断,观察GIPR及TCF4表达变化。结果显示(图 2),GIP处理使GIPR和TCF4的表达量显著升高,且具有随浓度增加而升高的趋势(2、3组);Akti在有无GIP情况下均抑制TCF4和GIPR的表达(4、6组);PKAi处理上调TCF4及GIPR表达(5组),但与Akti联合时,即使添加GIP,仍无这种上调作用(7、8组);在上述处理组中GIPR表达趋势与TCF4始终一致。
双荧光素酶报告结果显示,转染GIPR启动子序列为607 bp重组质粒的细胞荧光素强度极显著高于对照组(P < 0.01,图 3),说明TCF4可在此区域与GIPR的启动子结合。在进一步试验中,TCF4过表达组(OE)表达量比对照组(NC)高将近300倍(图 4A),说明过表达载体可高效表达TCF4基因,且在TCF4过表达时,GIPR mRNA表达显著上调(图 4B)。蛋白检测结果显示,OE组GIPR蛋白表达显著高于NC组,且在Akt或PKA通路阻断时,TCF4过表达仍可上调GIPR表达(图 4C、D),表明TCF4可直接上调GIPR表达。瞬时转染结果显示,TCF4干扰组(siTCF4)TCF4 mRNA表达显著下调,干扰效果显著(图 5A);TCF4基因沉默使GIP刺激(GIP+)下的GIPR mRNA表达量显著下调(图 5B);同时siTCF4干扰也使GIPR蛋白表达显著降低(图 5C、D)。
Min6细胞进行TCF4干扰和过表达后,分别在12、24、36 h通过CCK8检测β细胞增殖情况。结果显示(图 6A),TCF4干扰后相比对照组β细胞增殖缓慢,而TCF4过表达则可促进β细胞的增殖。胰岛素分泌测定结果显示,OE组与NC组相比极显著促进胰岛素分泌(图 6B),在Akt或PKA通路阻断时仍具有促进作用。
在2型糖尿病患者中,β细胞分泌功能受损可归因于环境、遗传、免疫等因素之间复杂的相互作用[28-29],β细胞衰竭及肠促胰岛素效应降低的潜在机制仍然存在许多未知。而无论在β细胞还是脂肪细胞,肠促胰岛素受体GIPR/GLP-1R相关转录因子包括TCF/LEF家族(TCF1、TCF4)和PPAR家族(PPARα、PPARβ\δ、PPARγ)。来自全基因组关联研究的结果鉴定了TCF4基因中SNP,并揭示了其与2型糖尿病有很强的关联,TCF4突变可造成胰岛素分泌受损[30-32]。与非糖尿病对照相比,糖尿病肥胖(VDF)Zucker大鼠和高脂肪/高蔗糖饮食处理小鼠的TCF4蛋白水平发生下调;在T2DM患者的胰切片中也观察到类似的病理变化[33]。本研究中,双荧光素酶报告系统检测结果表明,TCF4与GIPR有直接调控关系,过表达TCF4可显著促进GIPR表达,干扰TCF4则下调GIPR表达,且TCF4过表达可显著促进Min6细胞增殖和葡萄糖刺激下的胰岛素分泌。这为TCF4可通过GIPR转录调控来调节β细胞功能提供了进一步的证据。
GIP与GIPR结合后,使得活化的Akt由细胞膜上释放至细胞浆内继续传递生物学信号[34]。在T2DM患者中观察到Akt磷酸化降低[35-36],而PI3K/Akt信号通路是细胞增殖和凋亡的中心介质。FoxO1上游主要受PI3K/Akt信号调控,PI3K/Akt信号使FoxO1发生磷酸化后转位出细胞核,上调PPARγ表达,后者是GIPR、Pdx-1的转录因子[37-38]。本研究中,当Akt通路被阻断时,TCF4蛋白表达下调,GIPR蛋白表达也随之下调;同时GIP对GIPR及TCF4的上调效应也被抑制;但TCF4过表达仍可增加GIPR表达及葡萄糖刺激下胰岛素分泌,干扰TCF4则作用相反。TCF4的缺失导致GIP刺激的GIPR表达下降,这与在T2DM患者分离的胰岛中siTCF4处理的结果一致[39]。因此,本研究结果显示,GIP与GIPR结合后使Akt通路活化,使TCF4表达升高,继而调控GIPR表达及胰岛素分泌,形成一个信号反馈。
GIP和GLP-1与其受体结合后,腺苷酸环化酶(AC)被激活并在β细胞中产生cAMP,进一步激活cAMP依赖的蛋白激酶,使控制胰岛素分泌的PKA关键蛋白质磷酸化[40]。尽管如此,本研究结果表明,在PKA被高度抑制的情况下,GIPR和TCF4蛋白高表达,胰岛素分泌增加,这种相反的表达调控机制尚不清楚。GLP-1可通过经典的Wnt信号通路来调控β细胞功能[41]。在PKA信号阻断条件下,GIP是否也通过Wnt及Akt信号通路的补偿作用来抵抗凋亡而增加GIPR及TCF4的表达,仍需进一步探究。
4 结论本研究以小鼠胰岛瘤Min6细胞为材料,从Akt和PKA通路筛选出调控GIPR表达的转录因子TCF4。荧光素酶报告系统证明,TCF4可与GIPR启动子结合;细胞试验证明,GIP结合GIPR后,经Akt信号通路上调转录因子TCF4表达,再增强GIPR表达,形成正反馈加强GIP信号,提高β细胞增殖和胰岛素分泌的功能,维持血糖稳态。胰岛素抵抗状态下,Akt上游信号通路受阻,激活TCF4信号可能是恢复胰岛β细胞功能,治疗2型糖尿病的一条新途径。
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