2. 西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室, 成都 610041;
3. 四川省畜牧科学研究院, 成都 610066;
4. 阿坝藏族羌族自治州畜牧科学技术研究所, 阿坝 624402;
5. 安康学院现代农业与生物科技学院, 安康 725000
2. Key Laboratory of Ministry of Education for Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China;
3. Sichuan Animal Science Academy, Chengdu 610066, China;
4. Institute of Science and Technology of Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture, Aba 624402, China;
5. School of Modern Agriculture & Biotechnology, Ankang University, Ankang 725000, China
miRNA是一类内源性的长为18~25个核苷酸的单链非编码小分子RNA。由具有发夹结构的长约70~110个核苷酸的miRNA前体剪切加工形成，通常在转录后水平能够与靶基因的特定序列结合，从而发挥其对靶基因的调控作用[1]。研究表明，miRNA参与了生物体内几乎所有的生物学过程，包括细胞的增殖与分化、肌肉及脂肪的形成与发育、新陈代谢、激素的分泌、免疫应答、疾病的发生和肿瘤的形成等[2]。越来越多的miRNA被证实对肌肉发育有重要影响，这些miRNA中仅有几个是在肌肉中特异表达的，大部分在各个组织内广泛表达。miR-1、miR-133和miR-206是较早发现的肌肉特异表达的miRNA(muscle-specific miRNAs, myomiRs)，随着研究深入，miR-208、miR-486和miR-499也被归为myomiRs[3-5]。已有研究表明，并不是所有的myomiRs都只在肌肉组织中表达，其中一些myomiRs也会在其它组织中表达，只是表达丰度较低，因而也被归为myomiRs[6]。
miR-499-5p是肌球重链蛋白(myosin heavy chain 7b，Myh7b)基因内含子表达的miRNA，在骨骼肌和心肌中特异表达[7]。越来越多的研究表明，作为myomiRs，miR-499-5p在肌肉增殖、分化和再生过程中发挥重要的作用。Van Rooij等[7]发现，敲除miR-208b和miR-499-5p的小鼠与野生小鼠相比，比目鱼肌的Ⅰ型肌纤维的数目明显减少；MCK-miR-499-5p转基因小鼠与野生型相比，慢肌的表达显著提高，耐力也有所提高，表明miR-499-5p在肌纤维转化过程中的重要调控作用；miR-499-5p可通过靶向SOX6、Purβ、Sp3、Med13、Cbx1及HP-1β等基因，从而激活慢肌肉发育相关基因的程序，在肌纤维转化成Ⅰ型肌纤维时起关键作用。SOX6基因是SOX转录因子家族的成员，小鼠SOX6基因有7个miR-499-5p的靶位点，其中3个靶位点在人、小鼠、大鼠、狗和鸡上都是保守的。在新生大鼠心肌细胞中过表达miR-499-5p之后，SOX6基因表达量显著下降。在心肌细胞分化后期miR-499-5p和SOX6表达量均较高，推断SOX6作为细胞周期蛋白D1抑制剂，阻遏心肌细胞增殖并加快细胞周期结束，而miR-499-5p下调SOX6蛋白的表达，从而抑制心肌细胞凋亡。MAPK6和MSTN基因是肌肉生长的负调控因子，也被证实是miR-499-5p的靶基因[8]。Zhang等[9]在miR-499-5p通过Wnt/β-catenin信号通路诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌分化研究中发现，上调大鼠骨髓间充质干细胞miR-499-5p的表达后，能使某些心的特定基因表达增加，同时还能降低Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的磷酸化/去磷酸化比率，从而激活该信号通路。本实验室在前期研究中发现，miR-499-5p在藏鸡不同发育时期的肌肉组织中差异表达显著，推测miR-499-5p在藏鸡肌肉的发育过程中具有一定的调控作用[10]，但是miR-499-5p对肌肉转录组学的影响尚未见报道。
因此，为进一步了解miR-499-5p对肌肉发育的影响，本研究以14日龄大恒肉鸡为研究对象，研究外源注射miR-499-5p对肉鸡骨骼肌发育的影响。利用苏木精-伊红(HE)染色从形态学上观察注射miR-499-5p对骨骼肌肌纤维直径的影响；利用RNA-seq技术进行高通量测序，通过数据注释和生物信息学分析，筛选对照组和处理组中的差异表达基因，并与预测到的miR-499-5p靶基因进行比较分析，从转录组学的角度探讨外源注射miR-499-5p对肉鸡骨骼肌发育的影响，为进一步完善miR-499-5p对骨骼肌发育的调控机制提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物与处理选取体重接近的14日龄健康大恒肉鸡公鸡16只，随机分为2组，每组8个重复，2组之间体重差异不显著。agomiR-NC和agomiR-499-5p由广州瑞博生物科技有限公司合成。对照组注射agomiR-NC作为阴性对照，处理组注射agomiR-499-5p用来模拟体内高表达的miR-499-5p，每3 d注射1次，共注射6次，注射部位均为右侧腓肠肌部位。试验在国家肉鸡核心育种场四川大恒家禽育种有限公司(四川大邑)进行。在整个试验期间，保证鸡自由采食与饮水，所有操作严格遵守西南民族大学动物福利相关标准。在试验开始与结束时，2组16只鸡空腹过夜后称重。
1.2 屠宰与样品采集在试验期的最后1 d，禁食12 h后将2组16只鸡放血屠宰。每只鸡采集10 mm×10 mm×2 mm大小的腓肠肌组织，置于浓度为4%的多聚甲醛固定液中固定。同时，每组随机采集3只鸡的腓肠肌组织，剪成黄豆大小迅速置于液氮中冻存，所有样品带回实验室备用。
1.3 肌纤维直径测定固定的腓肠肌组织经全自动脱水机脱水，进行石蜡包埋、切片及常规HE染色，用BA410 Digital显微镜(Motic，中国)观察切片并利用图像分析软件Motic Images Advanced(v3.2)测量肌肉样本的肌纤维直径，每个样本采集3张图片，共测量并获得20个腓肠肌肌纤维直径数据。
1.4 文库构建与转录组测序选择2组采集的各3个冻存样本，利用Trizol提取试剂盒提取总RNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本是否降解和污染，利用Qubit® RNA Assay Kit in Qubit® 2.0 Flurometer (Life Technologies，美国)检测RNA样本的浓度，利用RNA Nano 6000 Assay Kit of the Bioanalyzer 2100 system (Agilent Technologies，美国)检测RNA样本的完整性。RNA样本质量检测合格后可构建文库，共构建6个文库并进行转录组测序(文库构建和转录组测序工作由天津诺禾致源生物信息科技有限公司完成)。采用去除核糖体RNA的方法构建特异性文库[11]。每个样本准备3 μg RNA，利用带有oligo(poly T)的磁珠富集mRNA；富集完成后，利用二价阳离子将mRNA在第一链cDNA合成反应缓冲液中进行高温裂解；采用6碱基随机引物和反转录酶合成第一链cDNA，再利用DNA聚合酶和dNTPs合成第二链cDNA；纯化后的cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头；利用AMPure XP beads筛选200 bp左右的cDNA，最后进行PCR扩增并获得文库。
文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至1.5 ng·μL-1，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段大小进行检测，大小符合预期后，使用实时荧光定量PCR方法对文库的有效浓度(文库有效浓度高于3 nmol·L-1)进行准确定量。文库质检合格后进行Illumina PE150测序。
1.5 转录组数据分析为保证数据分析的质量及可靠性，对测序获得的raw reads进行过滤，去除带接头和碱基无法确定比例大于0.2%的reads，以及单条read低质量碱基数超过该条read长度50%的成对reads，最终得到clean reads。利用HISAT2(v2.1.0)[12]软件将clean reads比对到鸡参考基因组(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/gallus_gallus/dna/)；再利用HTSeq(v0.5.3)[13]软件进行基因表达水平分析，表达结果以FPKM(fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced)为基本单位；最后利用DESeq(v1.12.0)软件进行差异表达分析，以P value < 0.05和log2(fold change)≥ 1作为显著差异表达基因的筛选标准。利用GOseq(v2.12)[14]软件对获得的差异表达基因进行GO(gene ontology)富集分析，再利用KOBAS(v2.0)[15]软件对差异表达基因进行KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，最后用超几何分布检验的方法计算每个通路条目中差异基因富集的显著性。
1.6 miR-499-5p注射结果和转录组测序结果的实时荧光定量PCR验证为验证miR-499-5p的注射结果和转录组测序结果，本研究分别以5S rRNA和GAPDH作为内参，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-499-5p注射组与对照组中miR-499-5p和4个差异表达基因的表达量。利用Primer Premier(v5.0)软件设计引物，引物相关信息见表 1。取与转录组测序相同的腓肠肌组织样品，利用Trizol(TaKaRa，Japan)试剂提取总RNA，并利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，Japan)试剂盒反转录成cDNA，miR-499-5p和5S rRNA采用特异性反转录引物合成cDNA。利用SYBR Premix ExTaq(TaKaRa，Japan)进行qRT-PCR验证。反应体系为10 μL：上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase free H2O 2.2 μL，SYBR Premix ExTaq(2×)6 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃(根据引物实际退火温度进行调整)退火15 s，72 ℃延伸30 s，循环39次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。
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表 1 实时荧光定量PCR引物信息 Table 1 The primer information of qRT-PCR |
利用miRNA靶基因预测软件TargetScan[16]和miRDB[17]预测与miR-499-5p具有靶标关系的基因，利用Venny(v2.1)软件对2个靶基因预测软件得出的结果做韦恩图，取其交集，获得较为可信的靶基因。
1.8 数据统计分析利用SPSS(v20.0)软件对肌纤维直径数据进行单因素方差分析，在数据分析中，P < 0.05认为差异显著。
2 结果 2.1 miR-499-5p注射对肉鸡肌纤维直径的影响miR-499-5p注射组(agomiR-499-5p)与对照组(agomiR-NC)肉鸡在试验开始与结束时体重差异不显著(图 1)。两组腓肠肌组织样本HE染色结果如图 2所示，miR-499-5p注射组肉鸡腓肠肌肌纤维直径显著小于对照组(P < 0.05)。利用qRT-PCR检测注射组与对照组肉鸡中miR-499-5p的表达水平，结果显示，注射组中miR-499-5p的表达水平极显著高于对照组(P < 0.01，图 3)。
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A.试验开始时对照组和注射组肉鸡体重；B.试验结束时对照组和注射组肉鸡体重 A. Body weight of chicks in control group and treated group at the beginning of the experiment; B. Body weight of chicks in control group and treated group at the end of the experiment 图 1 对照组和miR-499-5p注射组肉鸡试验开始和结束时体重变化 Fig. 1 Body weight of chicks in control group and agomiR-499-5p treated group at the beginning and the end of the experiment |
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A.对照组和注射组肉鸡腓肠肌肌纤维直径；B.对照组和注射组肉鸡腓肠肌HE染色结果。*.P < 0.05, **.P < 0.01, 下同 A. Muscle fiber diameter of gastrocnemius of chicks in control group and treated group; B. HE staining of gastrocnemius of chicks in control group and treated group. *. P < 0.05, **.P < 0.01, the same as below 图 2 对照组和miR-499-5p注射组肉鸡腓肠肌肌纤维直径 Fig. 2 Muscle fiber diameter of gastrocnemius of chicks in control group and agomiR-499-5p treated group |
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图 3 对照组和miR-499-5p注射组肉鸡腓肠肌组织中miR-499-5p的表达水平 Fig. 3 Expression level of miR-499-5p in gastrocnemius of chicks in control group and agomiR-499-5p treated group |
通过去除核糖体RNA法构建文库，并进行Illumina PE150测序，miR-499-5p注射组和对照组共得到6.4亿条raw reads，过滤后共获得6.3亿条clean reads，序列有效率为98.00%，测序碱基错误率为0.02%，两组样本GC含量均为52.3%。其中，miR-499-5p注射组获得308 263 164条clean reads，对照组获得316 696 152条clean reads。与鸡的参考基因组进行比对，注射组和对照组的总比对率分别为90.29%和89.57%，高比对率说明测序所获得的序列可信度高，可用于下一步的分析，其中有5.19%的序列在基因组上比对到多个位置，84.74%的序列在参考基因组上具有唯一的比对位置。
2.3 miR-499-5p注射组与对照组差异表达基因的筛选miR-499-5p注射组与对照组检测到共有表达基因23 377个，对照组特有基因1 280个，miR-499-5p注射组特有基因1 166个。使用FPKM值来表示基因的表达量，总体来看，miR-499-5p注射组与对照组全部基因表达量变化不明显(图 4)。RNA-seq相关性结果表明，各样本间基因表达水平Pearson相关系数均大于0.97(图 5)，表明两组样品之间表达模式的相似度较高，测序结果更可靠。
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CG代表对照组；TG代表miR-499-5p注射组。下同 CG denote control group; TG denote agomiR-499-5p treated group. The same as below 图 4 对照组和miR-499-5p注射组肉鸡腓肠肌基因FPKM箱线图 Fig. 4 The box plot of FPKM value of genes expressed in gastrocnemius in control group and agomiR-499-5p treated group |
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图 5 对照组和miR-499-5p注射组6个样本之间的相关性分析 Fig. 5 Correlation analysis between 6 samples in control group and agomiR-499-5p treated group |
利用DESeq筛选miR-499-5p注射组与对照组的差异表达基因，结果显示，miR-499-5p注射组共有18个差异表达基因，其中包含12个上调基因，6个下调基因(图 6)。上调最显著的两个基因分别是原癌基因FOS(fos proto oncogene，FOS)和早期生长应答蛋白基因(early growth response gene-1，EGR1)，表明这两个基因可能参与了腓肠肌肌纤维性状形成的调控。
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图 6 对照组和miR-499-5p注射组差异表达基因火山图 Fig. 6 Volcano plot for differentially expressed genes between control group and agomiR-499-5p treated group |
为了验证转录组测序结果的可靠性，选取了4个差异表达基因进行qRT-PCR验证。结果显示，虽然差异表达基因qRT-PCR结果和转录组测序结果差异倍数存在一定的偏差，但是差异表达基因的上调和下调表达趋势相同(图 7)，qRT-PCR和转录组测序结果中基因表达量的Pearson相关系数平均为0.982 9，表明转录组测序结果准确可靠。
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图 7 转录组测序中差异表达基因的qRT-PCR验证 Fig. 7 Validation of differentially expressed genes in RNA-seq by qRT-PCR |
GO富集分析可以用来对差异表达基因进行注释和基因功能分类，可分为生物过程(biology process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)。对miR-499-5p注射组与对照组差异表达基因进行GO富集分析(图 8)，在差异表达基因富集的前40个条目中，生物过程有36个，分子功能有4个。生物过程中富集到的包括跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路以及信号转导，富集的基因包括FOS、EGR1和富半胱氨酸61基因((cysteine-rich 61，CYR61)，与分子功能相关的富集条目包括脂质合成和骨骼肌再生等过程，富集的基因包括EGR1基因和Wnt家族成员7A基因(wnt family member 7A，WNT7A)。在KEGG富集分析中，FOS、EGR1和WNT7A基因被显著富集到丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和Wnt信号通路(图 9)。
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图 8 差异表达基因的GO富集分析 Fig. 8 GO enrichment analysis of differentially expressed genes |
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图 9 差异表达基因的KEGG富集分析 Fig. 9 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes |
利用TargetScan和miRDB 2个在线软件预测得到与miR-499-5p具有靶标关系的基因分别有161和438个。做韦恩图取其交集，结果如图 10所示。2个软件共同预测出78个靶基因。对miR-499-5p的78个靶基因进行GO富集分析，在miR-499-5p靶基因富集的24个条目中，生物过程有14个，细胞组分有3个，分子功能有7个(图 11)。生物过程中富集到的包括以DNA为模板的转录调控、丝氨酸/苏氨酸激酶活性的负调控、细胞分化以及蛋白质磷酸化。与分子功能相关的富集条目包括丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂活性、转录因子活性、DNA结合、RNA结合和mRNA结合等过程。
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图 10 TargetScan和miRDB软件预测的miR-499-5p的靶基因 Fig. 10 Target genes of miR-499-5p predicted by TargetScan and miRDB |
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图 11 miR-499-5p靶基因的GO富集分析 Fig. 11 GO enrichment analysis of target genes of miR-499-5p |
肌纤维性状主要包括肌纤维直径、密度和类型等，是影响肌肉品质的重要因素[18]。根据肌球蛋白三磷酸腺苷酶对pH预孵化的敏感程度，骨骼肌肌纤维可分为慢速氧化性肌纤维(Ⅰ型)、快速氧化性肌纤维(Ⅱ a型)、中间型(Ⅱ x型)、快速酵解型肌纤维(Ⅱ b型)4种类型[19]。不同类型的肌纤维在代谢、生理和形态学特性等方面均存在差异，Ⅰ型肌纤维主要以氧化形式供能，含有较多脂类物质，代谢和贮存脂肪能力强，肌纤维直径较细；Ⅱ型肌纤维则主要以糖酵解的形式供能，肌纤维直径较粗[20]。当肌肉中含有较高比例的Ⅰ型肌纤维时，肌肉嫩度、肉色好，肌内脂肪含量高，品质更好。本研究结果显示，注射miR-499-5p可显著降低肉鸡肌纤维直径，表明miR-499-5p可通过改良肌纤维性状提高肌肉品质。
作为Myh7b基因内含子表达的myomiRs，miR-499-5p在肌肉增殖、分化和再生过程中发挥重要的作用。已有研究表明，miR-499-5p可通过靶向SOX6、Purβ、Sp3、Med13、Cbx1及HP-1β等基因，从而激活慢肌肉发育相关基因的程序，在肌纤维转化成Ⅰ型肌纤维时起关键作用[7, 21]。敲除miR-499-5p的小鼠与野生小鼠相比，比目鱼肌的Ⅰ型肌纤维的数目明显减少，MCK-miR-499-5p转基因小鼠与野生型相比，慢肌的表达显著提高[7]。本研究中，miR-499-5p注射组肉鸡的肌纤维直径显著减小，可能是骨骼肌中的部分肌纤维的类型在miR-499-5p的调控作用下发生改变，由Ⅱ型肌纤维转化为Ⅰ型肌纤维导致的。对miR-499-5p的靶基因进行预测，共预测到78个可与miR-499-5p结合的靶基因。对这些靶基因GO富集分析发现，这些靶基因主要富集在以DNA为模板的转录调控、丝氨酸/苏氨酸激酶活性的负调控、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂活性以及转录因子活性等过程。本研究中，差异表达最显著的FOS和EGR1基因均属于转录因子，被检测到的差异表达基因中FOS、EGR1、CYR61也同样富集于丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路和转录调控等过程，表明差异表达基因可能通过上述条目参与了肉鸡腓肠肌肌纤维相关性状的调控。
FOS蛋白作为一种核蛋白转录因子，在调节细胞的增殖、分化和程序性死亡等方面均具有重要作用[22]。研究发现，FOS基因的表达量在肌纤维直径较小的马身猪要显著高于大白猪[18]，本研究中，FOS基因同样在肌纤维直径更小的注射组中表达量更高。FOS基因家族的转录因子被认为是导致肌肉特异性基因差异调控的关键原因[23]。此外，FOS基因的遗传变异也被证实对肌纤维性状存在显著的影响[24]。
EGR1蛋白作为一种转录因子，同样在细胞增殖、分化及凋亡等许多生物学过程中都扮演着重要角色。肌肉的生长主要依赖骨骼肌卫星细胞的增殖分化，使肌纤维长度增加，直径增粗。研究发现，转录因子EGR1可调控牛骨骼肌卫星细胞分化过程中肌细胞生成素基因(MYOG)的表达[25]。MYOG是骨骼肌发育和肌肉再生的关键调控因子，在骨骼肌细胞的形成过程中起中心调控作用，EGR1基因的表达升高，可正向调控MYOG基因的表达。EGR1基因也被证实可通过MYOG蛋白和肌球蛋白重链2(MYH2)促进体外小鼠成肌细胞的分化[26]。本研究中，miR-499-5p注射组中EGR1基因的表达显著升高，表明miR-499-5p可提高肉鸡肌肉组织中EGR1基因的表达，从而提高肉产量，这可能是注射组肌纤维直径虽然显著减小但体重却与对照组差异不显著的原因之一。
CYR61基因是结缔组织生长因子家族成员之一。CYR61蛋白是一种重要的分泌性、细胞基质调节因子，可调节细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等生物学过程。研究表明，CYR61基因可促进血管、软骨生成和肿瘤形成，更多的研究也集中在CYR61基因的表达变化与肿瘤的发生和发展[27]。本研究中，CYR61基因被富集于跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶和信号转导信号通路，推测CYR61基因通过这些信号通路调控肌肉发育。WNT7A基因属于WNT基因家族，研究发现，WNT7A基因可通过其受体激活骨骼肌合成代谢相关通路，可用来作为治疗杜氏肌营养不良症的候选基因[28]。WNT7A基因还可以通过刺激肌源性干细胞提高肌肉力量[29]。本研究中，WNT7A基因显著富集于Wnt信号通路。Wnt信号通路在骨骼肌的发育、再生和肌纤维类型的调控过程中具有重要的功能[30]，表明WNT7A基因通过Wnt信号通路参与了肉鸡肌纤维相关性状的调控。
4 结论本研究发现，注射miR-499-5p可导致肉鸡腿肌的肌纤维直径显著减小，通过RNA-seq在miR-499-5p注射组与对照组中共检测到18个差异表达基因，其主要与脂质合成和骨骼肌再生相关。预测到的78个miR-499-5p靶基因则主要与丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路和转录调控相关。综合分析发现，差异表达基因中的FOS、EGR1、CYR61和WNT7A基因在miR-499-5p的作用下可能参与调控了肉鸡肌纤维性状的改变，提高了鸡肉的品质，可作为进一步功能验证的关键基因。
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