猪霍乱沙门菌是引起仔猪腹泻的主要细菌性病原之一，可加重腹泻的严重程度，增加腹泻仔猪的死亡率，给养猪业带来巨大损失[1]。国内外学者对猪场的沙门菌调查显示，猪群粪中沙门菌的分离率达4%~17%[2-3]，而腹泻粪样品中检出率达18%~35%[4-5]。目前，仍主要采用饲料添加抗生素防治该病原菌感染，但其负面效应日益凸显。中国将在2020年实行饲料全面禁抗，因此，人们应该在替抗上进行探索和储备，为饲料全面禁抗做好准备。近年，噬菌体作为抗生素替代品防治细菌性疾病的研究工作得到广泛关注[11-13]。噬菌体是一类感染细菌的病毒，可特异且高效地裂解细菌，噬菌体的宿主谱直接影响噬菌体对机体的保护效果，Wommack等[10]统计其在自然界中的丰度约为1031。本研究从健康猪肠道黏膜和食糜中分离得到1株可跨属感染猪霍乱沙门菌(S. choleraesuis)和大肠杆菌(E. coli)的烈性噬菌体，测定其裂解谱发现其同时还可裂解1株产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，并进一步测定该噬菌体的生物特性和抑菌效力，为进一步开发噬菌体作为新型抗菌剂提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 菌株及噬菌体来源 用于噬菌体分离的菌株为猪霍乱沙门菌(S. choleraesuis)，购自美国模式培养物集存库ATCC，编号为ATCC 13312。其他用于测定裂解谱以及感染谱的89株大肠杆菌(E. coli)均为本实验室此前从猪粪中分离得到(菌株信息详见OSID服务附表S1)，本研究所用菌株信息见表 1，其中，包括1株产肠毒素大肠杆菌(ETEC)。
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表 1 沙门菌噬菌体L6jm的宿主谱以及感染特性 Table 1 Host range and infecting characteristics of phage L6jm |
用于噬菌体分离的20份样品来源于江苏镇江某猪场5头猪肠道空肠和结肠的黏膜与食糜样品。
1.2 噬菌体分离纯化采用双层平板法进行噬菌体的分离纯化。将样品加SM液匀浆过滤后，与S. choleraesuis 13312菌液铺双层平板。37 ℃孵育5 h后，挑取平板上均匀透亮的单个噬菌斑于SM液中，重复上述步骤3次[6]，可获得均一的噬菌斑，即获得纯化的噬菌体。
1.3 噬菌体基因组的提取和酶切鉴定参照《分子克隆实验指南》[7]提取噬菌体基因组。限制性核酸内切酶HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ均购自TaKaRa公司，酶切后，凝胶电泳观察成像并分析。
1.4 噬菌体全基因组测序噬菌体基因组送至上海凌恩生物科技有限公司进行全基因组测序，测序结果上传至GenBank。
1.5 噬菌体在大肠杆菌上的宿主谱测定为检测该噬菌体是否可以跨属感染大肠杆菌，以实验室此前分离得到的89株大肠杆菌为指示菌，用点滴法和双层平板法测定宿主谱。
点滴法：将细菌均匀涂布于LB平板上，待干后取5 μL噬菌体悬液滴在涂布范围中央，37 ℃孵育6 h后，若菌苔上出现透亮的空斑即为可裂解的菌。
双层平板法：选择噬菌体可裂解的细菌作为可能的宿主菌，将噬菌体梯度稀释成103~109 PFU·mL-1，用双层平板法观察成斑情况，出现噬菌斑的菌视为可感染细菌。
1.6 噬菌体浓缩与透射电镜观察用SM液洗脱双层平板扩增的噬菌体，0.22 μm滤器过滤后，加入100 KD超滤管中4 ℃，4 800 g离心10 min，用SM液洗下超滤管中的噬菌体。浓缩后的噬菌体于南京农业大学电镜(日立HITACHI，SU8010)室观察。
1.7 噬菌体生物学特性分析1.7.1 热稳定性、pH稳定性测定 取1 mL滴度为108PFU·mL-1的噬菌体置于30~80 ℃水浴锅中作用1 h后，将样品迅速冰浴冷却，测定噬菌体滴度。
取100 μL滴度为108PFU·mL-1的噬菌体纯培养液与900 μL不同pH(2~13)的SM液混合后，于37 ℃水浴作用2 h，测定噬菌体滴度。
1.7.2 最佳感染复数(MOI)测定 将S. choleraesuis 13312以及E. coli 244培养至对数期，以MOI分别为1、0.1、0.01、0.001、0.000 1分别接种S. choleraesuis 13312和E. coli 244以及噬菌体至液体LB中，37 ℃震荡培养4.5 h后测定噬菌体滴度，以获得最高噬菌体滴度的接种比为最佳感染复数。
1.7.3 成斑率(efficiency of plating, EOP)测定 以相同量噬菌体分别与S. choleraesuis 13312和E. coli 244铺双层平板后计噬菌斑数，以在S. choleraesuis 13312上出现斑的数为1，计算噬菌体L6jm在E. coli 244中的成斑率。
1.7.4 噬菌体的一步生长曲线测定 将噬菌体与S. choleraesuis 13312和E. coli 244按各自最佳MOI分别接种于液体LB中，37 ℃孵育15 min后，4 000 r·min-1离心5 min，弃上清，以液体LB重悬置于37 ℃震荡培养6 h，于不同时间点取样检测噬菌体浓度，以感染时间为横坐标，以噬菌体滴度的对数为纵坐标，绘制噬菌体的一步生长曲线。
1.7.5 噬菌体裂解S. choleraesuis 13312和ETEC 104效力测定 将噬菌体以MOI=0.000 1、0.001、0.01、0.1与S. choleraesuis 13312在液体培养基中共孵育，和以MOI=1、10、100与ETEC 104在液体培养基中共孵育，37 ℃震荡培养，每隔1 h测定各共孵育液体在600 nm处的吸光值，以仅接种细菌的组OD600 nm为对照，测定不同MOI接种时噬菌体的裂菌效力。
1.7.6 数据统计分析 利用SPSS 17.0软件中单因素ANOVA的Ducan检验分析热稳定性、pH稳定性及抑菌效力的差异性，P < 0.05时为差异显著。
2 结果 2.1 噬菌体的分离鉴定2.1.1 噬菌体的分离纯化及鉴定 将处理过的猪肠道10份空肠食糜和黏膜样品及10份结肠食糜和黏膜样品分别与S. choleraesuis 13312铺双层平板，其中，3份结肠和4份空肠黏膜样品以及1份空肠和1份结肠食糜出现噬菌斑。将各样品里出现噬菌斑的平板分别挑取单个噬菌斑进行纯化，纯化后的噬菌体经提基因组酶切鉴定，发现酶切图谱相同(图 1B)，故认定为是同一株噬菌体，将其命名为沙门菌噬菌体L6jm(Salmonella phage L6jm)，其噬菌斑直径为1~2 mm，如图 1A。
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A.噬菌斑形态；B.基因组酶切图谱(泳道1和2分别为15000和5000相对分子质量标准，泳道3和4分别为食糜和黏膜中分离得到的噬菌体)；C.电镜形态；D.热稳定性；E. pH稳定性；F.一步生长曲线；图中所标字母相异代表各处理组差异显著(P < 0.05)，字母相同代表各处理组差异不显著(P≥0.05)，下图同 A. Plaques of phage L6jm; B. Electrophoresis of phage L6jm's genome digested with restriction endonucleases (1. 15000 marker; 2. 5000 marker; 3. phage isolated from chyme; 4. The phage isolated from mucosal); C. Electron micrograph of phage L6jm; D. Thermal stability of phage L6jm; E. pH stability of phage L6jm; F. One-step growth curve of phage L6jm. Different letters denotes significant difference between the treatments (P < 0.05), the same letter denotes no significant difference between treatments (P≥0.05), the same as below 图 1 沙门噬菌体L6jm的生物学特性 Fig. 1 Biological characteristics of phage L6jm |
2.1.2 噬菌体分类鉴定 将噬菌体L6jm测序结果上传至NCBI，登录号为MN956514。测序结果显示，L6jm全长118 452 bp，比对结果显示，与L6jm同源性高的均是T5样噬菌体，也无任何基因比对到细菌组上，且其基因组注释显示无整合酶基因，故判定为烈性噬菌体。
电镜结果(图 1C)表明，L6jm为正二十面体头部，直径约75 nm，及一个非收缩性的尾部，大小约9 nm×190 nm，末端有长的扭曲尾丝。
根据形态观察并结合基因测序结果可推断L6jm属于T5样噬菌体属(T5-likeviruses)，长尾病毒科[9]。
2.1.3 噬菌体在大肠杆菌上的宿主谱 用点滴法和双层平板法分别测得L6jm在大肠杆菌上的宿主谱不同(表 1)，L6jm可裂解9株大肠杆菌(包括1株ETEC)，却仅可感染1株E. coli 244。
2.2 噬菌体的生物学特性2.2.1 噬菌体的热稳定性及pH稳定性 噬菌体L6jm，经40、50 ℃处理后效价仍然稳定；经60、70 ℃作用后，效价显著(P < 0.05)下降，经80 ℃处理时完全丧失活性(图 1D)。
噬菌体L6jm在pH为2和13时丧失活性(图 1E)。
2.2.2 噬菌体的最佳感染复数 噬菌体L6jm在以S.choleraesuis 13312为宿主菌时，最佳MOI为0.01，子代噬菌体滴度为4.11×109PFU·mL-1。当噬菌体L6jm以E. coli 244为宿主菌时，最佳MOI为0.001，子代噬菌体滴度为4.09×109PFU·mL-1。
2.2.3 噬菌体成斑率 噬菌体L6jm在S. choleraesuis 13312和E.coli 244上的成斑率如表 1所示，接种相同数量的噬菌体L6jm，在E. coli 244中产生的子代噬菌体数量更多。
2.2.4 噬菌体的一步生长曲线 以噬菌体L6jm在S. choleraesuis 13312和E. coli 244上的最佳MOI 0.01和0.001接种测得的生长曲线如图 1F所示，L6jm在S. choleraesuis 13312和E. coli 244中的潜伏期均为15 min，暴发时间在S. choleraesuis 13312中约为145 min，暴发量63 466.67，在E. coli 244中暴发时间约为125 min，暴发量160 476.19。
2.2.5 噬菌体裂菌效力 测定了L6jm在S.choleraesuis 13312、E. coli 244以及ETEC 104 3株菌上的裂菌效力。如图 2A所示，以最佳MOI接种时，L6jm对S. choleraesuis 13312和E. coli 244有显著(P < 0.05)的抑菌效果。L6jm对ETEC 104裂菌结果如图 2B所示，当MOI为10时，L6jm即能抑制ETEC 104的增殖，当MOI达到100时，L6jm可显著(P < 0.05)抑制ETEC 104的生长。
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图 2 沙门菌噬菌体L6jm对S. choleraesuis 13312、E. coli 244(A)和ETEC104(B)的抑菌曲线 Fig. 2 Bacteriostatic curves of phage L6jm against S. choleraesuis 13312, E. coli 244 (A) and ETEC 104 (B) |
本研究自健康猪肠道10份食糜和10份黏膜样品中分离出1株可裂解S.choleraesuis 13312的烈性沙门菌噬菌体L6jm，且在黏膜中检测到该噬菌体阳性率更高，说明肠道黏膜的黏液层可能有利于噬菌体黏附；Barr等[14]发现噬菌体能黏附于上皮细胞黏液层保护上皮细胞抵抗细菌侵袭，因此，推测L6jm在分离猪的肠道内起到了重要的保护作用。
L6jm不仅可以感染S.choleraesuis 13312，还可以跨属感染E. coli 244，且在最佳MOI L6jm能极显著抑制S.choleraesuis 13312和E. coli 244的生长。噬菌体感染细菌具有严格的宿主特异性，1株噬菌体只能感染某个细菌种属下的细菌菌株，但肠杆菌科除外，此前有研究表明，有些肠杆菌科噬菌体可以跨属感染细菌[15-17]。肠道噬菌体的种类和数量直接影响肠道区系及生理状态[18-20]，相较只能感染单一种属细菌的噬菌体，可能跨属感染的噬菌体，在肠道中的作用更加复杂，对肠道菌群和肠道健康的影响更大。
本研究分别用点滴法和双层平板法测定了L6jm在大肠杆菌上的宿主谱，但得到的结果不一致，因此，仅用“宿主谱”来描述噬菌体的杀菌范围是不准确的。导致噬菌体裂解却不能感染细菌的原因可能有噬菌体的外溶菌作用(lysis from without)，感染流产，或噬菌体扩增液中含有裂解酶、解聚酶和穿孔素等物质[21-24]。L6jm虽然无法感染ETEC 104，但在高MOI时仍可显著抑菌，说明其在肠道可通过其他宿主菌增殖达到较高的浓度后发挥抑制ETEC 104增殖的作用，对肠道提供一定的保护作用。
耐酸和耐温度试验结果表明，噬菌体L6jm在不高于50 ℃，pH为3~11时均能稳定维持效价，较前人已报道的多株噬菌体[25-28]更为稳定，说明L6jm在实际应用中的适用范围更广。此外，噬菌体L6jm的感染复数较低，潜伏期短暴发量高，易于制备。在耐药性日益严重而走向全面禁抗的大环境下，噬菌体L6jm这些生物特性使它可能具有防治沙门菌和大肠杆菌感染应用潜力。
4 结论分离到1株猪霍乱沙门菌噬菌体——L6jm(Salmonella phage L6jm)，可跨属感染S. choleraesuis和E. coli，且能裂解1株ETEC，有防治沙门菌和大肠杆菌感染的应用潜力。
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