畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (8): 2027-2031. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.08.029    PDF    
引用本文
姚大伟, 林立山, 朱旭, 李四豪, 孙欢, 邓益锋, 赵艳兵, 周振雷. 新冠疫情期间我国部分地区猫冠状病毒感染状况调查[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(8): 2027-2031.  
YAO Dawei, LIN Lishan, ZHU Xu, LI Sihao, SUN Huan, DENG Yifeng, ZHAO Yanbing, ZHOU Zhenlei. Investigation on the Infection of Feline Coronavirus in Partial Areas of China during the Novel Coronavirus Outbreak[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(8): 2027-2031.  
新冠疫情期间我国部分地区猫冠状病毒感染状况调查
姚大伟1, 林立山1, 朱旭2, 李四豪3, 孙欢4, 邓益锋1, 赵艳兵1, 周振雷1     
1. 南京农业大学动物医学院, 南京 210095;
2. 上海基灵生物科技有限公司, 上海 200335;
3. 郑州瑞派小俏皮动物医院, 郑州 450000;
4. 爱贝宠物诊所, 江阴 214400
收稿日期：2020-07-02
基金项目：中央高校基本业务费资助项目（KYZ202002）
作者简介：姚大伟(1979-), 男, 山东枣庄人, 副教授, 博士, 主要从事小动物疾病诊断研究, E-mail:yaodawei@njau.edu.cn, Tel:025-84395505.
通信作者：周振雷, 主要从事临床兽医学研究, E-mail:zhouzl@njau.edu.cn.
摘要：旨在了解新冠疫情期间我国部分地区猫是否携带新型冠状病毒以及猫冠状病毒的感染状况。从我国14个城市的宠物医院收集表现呼吸道症状和或腹泻症状猫的鼻拭子和直肠拭子样品，提取样品中的总RNA，反转录后进行PCR检测，检测样品是否携带新型冠状病毒和猫冠状病毒核酸。结果显示，在收集的269只猫的鼻拭子和直肠拭子样品中没有检测到新型冠状病毒核酸，检测到35只猫携带猫冠状病毒。这些结果说明在新型冠状病毒肺炎疫情期间，上述14个城市宠物医院就诊猫未携带新型冠状病毒。
关键词：冠状病毒    猫    感染状况    
Investigation on the Infection of Feline Coronavirus in Partial Areas of China during the Novel Coronavirus Outbreak
YAO Dawei1, LIN Lishan1, ZHU Xu2, LI Sihao3, SUN Huan4, DENG Yifeng1, ZHAO Yanbing1, ZHOU Zhenlei1     
1. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Shanghai Glinx Intelligent Technology Co., Ltd, Shanghai 200335, China;
3. Ruipai Xiaoqiaopi Animal Hospital, Zhengzhou 450000, China;
4. Aibei Pet Clinic, Jiangyin 214400, China
Corresponding author: ZHOU Zhenlei, E-mail:zhouzl@njau.edu.cn.
Abstract: The aim of this study was to investigate the infection of feline coronavirus (FCoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in partial areas of China during the novel coronavirus outbreak. Nose swabs and rectal swabs were collected from cats presented with respiratory disease symptoms and gastrointestinal disease symptoms in pet hospitals of 14 cities in China. Total RNAs were extracted from the samples and then were transcribed to cDNA. The FCoV and SARS-CoV-2 were detected by the reported PCR methods. As a result, no SARS-CoV-2 case has been detected in 269 cats, while there were 35 cats infected with feline coronavirus. It was suggested that there was no case infected with SARS-CoV-2 in fourteen cities in China during novel coronavirus outbreak.
Key words: coronavirus    feline    infection status    

自2019年12月以来，世界各地先后暴发新型冠状病毒肺炎疫情[1]，病原为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV-2)，该病毒属于β属冠状病毒，其基因特征与严重急性呼吸综合征冠状病毒和中东呼吸综合征冠状病毒有明显的差异，与蝙蝠来源的冠状病毒有96%的相似度[2]。目前，有研究结果表明，蝙蝠是新型冠状病毒的天然宿主，但尚不清楚其如何将病毒传播给人类。猫作为与人类密切接触的伴侣动物，是否携带该病毒目前尚没有明确的结论。本研究收集了14个城市宠物医院就诊的269只患猫的呼吸道和粪便样品，以调查样品中是否携带新型冠状病毒以及猫冠状病毒(feline coronavirus，FCoV)。样品来源城市均曾报告新冠肺炎确诊病例。其中，来自北京、上海、重庆、杭州、南京、合肥、西安、郑州等重点城市猫的数量为187只，占比为70%。

1 材料与方法 1.1 试验材料

病毒转运培养基(灭活款)购自深圳逗点医疗科技有限公司；RNAiso Plus、PrimeScrip RT Master Mix(Perfect Real Time)、TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)，Premix Ex Taq(Probe qPCR)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；新型冠状病毒阳性质粒CDC-阳性质粒V2以及引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；猫冠状病毒样品来源于临床及RT-PCR诊断阳性病例，本实验室保存。

1.2 样品采集

2020年3-4月，收集临床上有呼吸道疾病症状(咳嗽、流鼻涕、发热)或者消化道疾病症状(腹泻)的病猫的鼻拭子和直肠拭子，样品由经过课题组培训的动物医院的医生负责采集。鼻拭子：将拭子轻轻插入鼻腔内，停留片刻，旋转3圈后退出，将拭子插入病毒转运培养基中。直肠拭子：取样前应用棉签蘸取少许生理盐水以润湿棉签头部，于肛门处轻轻旋转进入，采集粪便(也可采集新鲜粪便)，将拭子插入病毒转运培养基中。将采集的样品置于泡沫箱内，冷链运输送检。

1.3 病毒检测

1.3.1 样品中RNA的提取 　　取100 μL样品置于1.5 mL离心管中，加入800 μL RNAiso Plus裂解，然后按照RNAiso Plus试剂说明书所述方法提取样品中总RNA，最后采用20 μL无RNase的水溶解RNA。

1.3.2 冠状病毒RT-PCR检测 　　采用PrimeScript RT Master Mix试剂按照说明书所述方法将提取的RNA反转录成cDNA。FCoV检测参考肖霞[3]发表论文合成引物Fcov F和Fcov R(表 1)。PCR扩增后采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。SARS-CoV-2检测参考中国疾病预防控制中心公布的实时荧光RT-PCR检测方法[4]，合成引物Hcov119 F、Hcov119 R和探针orflab-p(表 1)。反应在7500 Real-Time PCR System中进行，根据Ct判断结果。

表 1 引物信息 Table 1 Information of primers
2 结果 2.1 样品信息

共收集了269只猫的呼吸道样品和粪便样品，这些猫或表现为咳嗽、流鼻涕、发热症状，或表现为腹泻症状。样品信息如表 2所示，其中，北京12只，重庆25只，常州12只，杭州23只，合肥5只，江阴15只，上海49只，苏州22只，泰州25只，无锡3只，西安6只，厦门5只，郑州44只，南京23只。

表 2 FCoV阳性样品统计 Table 2 Statistic of FCoV positive samples
2.2 猫冠状病毒检测

琼脂糖凝胶电泳显示，采集的部分猫的样品中能够扩增出223 bp的目的条带，与理论设计值相符(图 1)。在269只猫的病例中，共检测到35只猫携带FCoV，平均阳性率为13.0%，阳性率最高为20%(表 2)。35只FCoV阳性猫的具体信息如表 3所示，其中，34只猫的直肠拭子样品中检测到FCoV，仅有1只猫的鼻拭子和直肠拭子中同时检测到FCoV。除了4只猫的年龄在1岁以上以外，其余的猫均在1岁以内。接种疫苗(猫细小病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒)猫的FCoV阳性率显著低于未接种疫苗的猫(疫苗接种13只，未接种疫苗22只)；性别(雄19、雌16)对该病毒的携带率没有显著影响。在35只猫中有12只猫仅表现为腹泻的症状，11只猫仅表现为呼吸道的症状，11只猫既表现腹泻症状又表现呼吸道症状，1只猫只表现腹水症状。

M. DNA相对分子质量标准；1.阳性对照；2.空白对照；3~8.待检样品 M. DNA marker; 1. Positive control; 2. Blank control; 3-8. Samples 图 1 猫FCoV RT-PCR检测结果 Fig. 1 RT-PCR detection of FCoV
表 3 猫FCoV阳性病例信息 Table 3 Information of FCoV cases
2.3 新型冠状病毒检测

采用中国疾病预防控制中心推荐的SARS-CoV-2荧光定量RT-PCR检测方法，所有269只猫共计538份呼吸道和粪便样品中均未检测到新型冠状病毒核酸，表明本试验采集的猫的呼吸道和消化道样品中并不携带新型冠状病毒。

3 讨论

冠状病毒是单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科，正冠状病毒亚科，分为α、β、γ和δ四个属，可感染人和多种动物，2019年12月以来，流行的SARS-CoV-2为β属冠状病毒。猫自然条件下也会感染冠状病毒，然而猫的冠状病毒和新型冠状病毒存在较大的差异，猫冠状病毒为α属冠状病毒，病毒感染后主要表现为腹泻等消化道症状，基因与新型冠状病毒的相似性约49.88%(FcoV DQ010921与SARS-CoV-2 MT019529比较)。本文SARS-CoV-2 PCR检测针对orf1ab基因，引物与FCoV基因比较显示该引物在FCoV基因组上无碱基配对的位点，无扩增产物。同样FCoV引物对SARS-CoV-2基因也无扩增产物，二者之间不存在交叉反应。猫冠状病毒分为两种生物型，一种是猫传染性腹膜炎病毒，主要导致猫浆膜腔积液及肉芽肿；一种是猫肠道冠状病毒主要导致轻度的腹泻症状[5]。

研究表明，在试验接种条件下，猫对SARS-CoV-2易感，SARS-CoV-2可以在猫的呼吸系统及消化系统高效复制[6]。另有研究调查显示，包括犬、猫在内的35种动物1 914份血清中未发现SARS-CoV-2特异性抗体存在[7]。对来自武汉疫区的102份猫血清样品检测显示有15份SARS-CoV-2抗体阳性，鼻咽和肛门拭子未发现SARS-CoV-2病毒[8]。本文采集了269只猫共计538份呼吸道和粪便样品，经过检测所有样品中均未检测到SARS-CoV-2，表明本试验采集的猫呼吸道和消化道中并不携带SARS-CoV-2。

本文从采集的269只猫的样品中检测到35只猫FCoV阳性，均从直肠拭子中检测到FCoV，仅有1只猫的鼻拭子和直肠拭子中同时检测到FCoV，说明FCoV主要从消化道排除病毒，表现为腹泻症状的占多数(23只)。同时也有仅表现出呼吸道症状的猫携带FCoV，由于猫感染FCoV临床症状较轻或者并不表现任何临床症状，因此，表现为呼吸道症状的猫可能并非由FCoV感染所致，而是其他病因导致呼吸道症状。

4 结论

新型冠状病毒疫情期间，收集了的14个城市宠物医院就诊的269只患猫的呼吸道和粪便样品，所有样品均未检测到新型冠状病毒核酸，有35只猫直肠拭子中检测到猫冠状病毒，主要表现为腹泻症状。

参考文献
[1] ZHU N, ZHANG D Y, WANG W L, et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019[J]. N Engl J Med, 2020, 382(8): 727–733. DOI: 10.1056/NEJMoa2001017
[2] ZHOU P, YANG X L, WANG X G, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin[J]. Nature, 2020, 579(7798): 270–273. DOI: 10.1038/s41586-020-2012-7
[3] 肖霞.含扩增内标的PCR技术在犬、猫5种病毒检测中的应用研究[D].南京: 南京农业大学, 2017.
XIAO X. Application of PCR technology included with IAC in the detection of dogs and cats five viruses [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2017. https://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&filename=1019150586.nh
[4] 国家卫生健康委员会.新型冠状病毒感染的肺炎防控方案(第二版): 新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南[EB/OL]. 2版.(2020-01-22)[2020-07-02]. http://www.nhc.gov.cn/jkj/s3577/202001/c67cfe29ecf1470e8c7fc47d3b751e88.shtml.
National Health Commission of the People's Republic of China. Prevention and control of novel coronavirus pneumonia(2ed): Laboratory testing guideline on novel coronavirus pneumonia [EB/OL]. 2ed. (2020-01-22)[2020-07-02]. http://www.nhc.gov.cn/jkj/s3577/202001/c67cfe29ecf1470e8c7fc47d3b751e88.shtml.
[5] JAIMES J A, MILLET J K, STOUT A E, et al. A tale of two viruses: the distinct spike glycoproteins of feline coronaviruses[J]. Viruses, 2020, 12(1): 83.
[6] SHI J Z, WEN Z Y, ZHONG G X, et al. Susceptibility of ferrets, cats, dogs, and other domesticated animals to SARS-coronavirus 2[J]. Science, 2020, 368(6494): 1016–1020. DOI: 10.1126/science.abb7015
[7] DENG J H, JIN Y P, LIU Y X, et al. Serological survey of SARS-CoV-2 for experimental, domestic, companion and wild animals excludes intermediate hosts of 35 different species of animals[J]. Transbound Emerg Dis, 2020, 67(4): 1745–1749. DOI: 10.1111/tbed.13577
[8] ZHANG Q, ZHANG H, HUANG K, et al. SARS-CoV-2 neutralizing serum antibodies in cats: A serological investigation [EB/OL]. BioRxiv, 2020, (2020-04-03)[2020-07-02]. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.01.021196v1.