维持睾丸内适宜的含氧微环境，对保护发育中的精子免受氧化或缺氧损伤至关重要，而长期生活在高海拔低氧环境中的牦牛早已形成了独特的适应机制。HIF-1α作为动物适应低氧环境的核心转录因子，在能量代谢、血管生成、细胞凋亡等方面发挥着重要作用[1-3]。Duan等[4]研究发现，IL-17在正常男性睾丸中呈低水平表达，其参与了睾丸免疫反应及精子正常发生。为初步探讨HIF-1α与IL-17在睾丸组织中的表达差异性，本研究以成年牦牛、犏牛和黄牛为研究对象，采用Western-blot、实时荧光定量PCR法检测HIF-1α及IL-17在3种牛睾丸组织中的表达，为研究低氧环境对牦牛和犏牛睾丸发育的调控机制提供参考，同时也为研究低氧刺激雄性生殖系统的应激和损伤机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物及材料试验动物(4岁，牦牛、犏牛和黄牛各5头)于2018年9月购自甘肃省甘南藏族自治州高海拔牧区，运输到临夏市屠宰。动物经颈动脉放血致死后迅速采集睾丸样品于液氮中，次日移至－80 ℃冰箱中保存待用。
1.2 RT-qPCR检测采用Trizol法提取三种牛睾丸组织的总RNA，按照GoScriptTM Reverse Transcription System反转录试剂盒(Promega, 美国)说明书合成cDNA。引物序列为HIF-1α-R: 5′-TATCCAAATCACCAGCATCCAG-3′, HIF-1α-F: 5′-TAGAGATGCAGCCAGATCTCGT-3′; IL-17-R:5′-TGCGGGAAGTTCTTGTCCTCAG-3′, IL-17-F: 5′-AGTCTGGTGGCTCTTGTGAAGG-3′; β-actin-R: 5′-GCTCGGCTGTGGTGGTAAA-3′, β-actin-F: 5′-AGGCTGTGCTGTCCCTGTATG-3′。用1%琼脂糖凝胶电泳检测HIF-1α和IL-17基因PCR扩增产物。采用SYBR Green I染料法检测目的基因的表达，反应体系和反应条件参照TB Green® Fast qPCR Mix荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa，日本)的说明进行。经验证β-actin内参在3种牛睾丸组织中无差异，故采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，数据均采用“平均值±标准误”表示。
1.3 Western-blot分析将3种牛的睾丸组织研磨成粉状，各称取100 mg，按比例加入RIPA组织/细胞裂解液(索莱宝，北京)和PMSF，匀浆2 h，至组织充分裂解后离心收集上清。按比例加入4×SDS上样缓冲液后置于沸水浴中加热10 min, -20 ℃保存。依次进行制胶、电泳、转膜、封闭、孵育抗体和化学发光等操作，以β-actin作为内参，将目的条带与其灰度值相比得到相对量。
1.4 统计分析用SPSS19.0软件对所有数据进行统计学处理。采用样本t检验和单因素方差法分析HIF-1α和IL-17在3种牛睾丸表达量的差异，以 P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 3种牛睾丸组织HIF-1α和IL-17基因PCR扩增用1%琼脂糖凝胶电泳检测HIF-1α和IL-17基因PCR扩增产物，结果均为单一条带，与预期结果相符(图 1)。
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A.HIF-1α基因PCR扩增结果；B. IL-17基因PCR扩增结果；M. DL600 DNA相对分子质量标准；1.牦牛睾丸；2.犏牛睾丸；3.黄牛睾丸 A. PCR amplification of HIF-1α gene; B. PCR amplification of IL-17 gene; M. DL600 DNA marker; 1. Yak testes; 2. Cattle-yak testes; 3. Yellow cattle testes 图 1 PCR扩增结果 Fig. 1 Results of PCR amplification |
实时荧光定量PCR结果显示，HIF-1α mRNA在犏牛睾丸组织量表达量最高，黄牛中表达量最低，且在3种牛睾丸组织中的表达彼此间均呈极显著差异(P＜0.01，图 2A)。IL-17 mRNA在犏牛睾丸组织中表达量最高，极显著高于牦牛和黄牛(P＜0.01)；而牦牛睾丸中表达量最低，与黄牛差异不显著(P＞0.05，图 2B)。
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不同字母表示差异极显著(P < 0.01)，字母相同表示差异不显著(P＞0.05)。图 4同 Different letters mean extremely significant difference(P < 0.01), same letter means no significant difference(P > 0.05). The same as figure 4 图 2 HIF-1α和IL-17 mRNA的相对表达水平 Fig. 2 Relative expression levels of HIF-1α and IL-17 mRNA |
蛋白免疫印迹结果显示，HIF-1α和IL-17蛋白在3种牛睾丸组织均有表达。HIF-1α在犏牛睾丸组织中表达量最高，黄牛中表达量最低(图 3A)。数据统计分析表明，犏牛睾丸组织中HIF-1α表达量极显著高于牦牛和黄牛(P＜0.01)，而牦牛也显著高于黄牛(P＜0.05，图 3B)。IL-17同样在犏牛睾丸组织中表达量最高，在黄牛睾丸组织中表达量最低(图 4A)。数据统计分析表明，犏牛睾丸组织中IL-17表达量极显著高于牦牛和黄牛(P＜0.01)，牦牛极显著高于黄牛(P＜0.01，图 4B)。
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不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) Different capital letters mean extremely significant difference(P < 0.01), different lowercase letters mean significant difference(P < 0.05) 图 3 HIF-1α蛋白的相对表达水平 Fig. 3 Relative expression levels of HIF-1α |
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图 4 IL-17蛋白的相对表达水平 Fig. 4 Relative expression levels of IL-17 |
本研究发现，HIF-1α在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达均高于黄牛，可能与牦牛和犏牛对高原低氧环境的适应有关，说明HIF-1α是动物适应低氧环境的一个重要调节因子。HIF-1α在大鼠睾丸中主要表达于睾丸间质细胞，可能在调控3β-羟基类固醇脱氢酶I型基因的表达中发挥促进作用[5-6]。此外，低氧环境通过刺激HIF-1α/VEGF轴促进血管生长、增加血流量，也能通过NO等间接参与调节血管与生精小管的通透性[7-8]。本试验对IL-17基因和蛋白在3种牛睾丸组织的表达进行了检测，结果显示，IL-17基因和蛋白在3种牛睾丸组织中均有表达，这与赵凯等[9]的试验结果相符，其表达差异也说明IL-17的表达具有种属特异性。Duan等[4]研究发现，IL-17在正常男性睾丸中呈低水平表达，并参与了睾丸免疫反应及精子正常发生。有研究表明，HIF-1α持续的高表达会促进IL-17的产生，而IL-17信号传导可反馈维持HIF-1α的稳定存在[10]，这或许是HIF-1α和IL-17在犏牛睾丸组织中呈显著性高表达的一种解释。
4 结论HIF-1α和IL-17在不同牛睾丸组织中的表达差异说明其具有种属特异性；牦牛和犏牛睾丸组织中HIF-1α和IL-17蛋白表达水平都高于黄牛，推测其在低氧环境的适应中有着重要的调控作用。
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