2. 甘肃省新兽药工程重点实验室, 兰州 730050;
3. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所, 兰州 730050
2. Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province, Lanzhou 730050, China;
3. Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730050, China
沙拉沙星(sarafloxacin, SAR)是继恩诺沙星之后又一新的喹诺酮类动物专用药[1]，其对革兰阳性菌、阴性菌及支原体具有极强的杀灭作用。临床试验表明，沙拉沙星对鸡的多种细菌性疾病和霉形体病防治效果显著，对猪实验性感染链球菌病和大肠杆菌病的治疗也有良好效果。沙拉沙星还可用于鱼虾细菌性疾病的防治，在兽医临床上具有广泛的应用价值[2-7]。目前，已有的沙拉沙星注射制剂pH较高，对肌肉刺激性大，普通粉剂存在溶解度较低，引湿性强，遇光颜色变深等缺点，在药物的临床应用中具有很大的局限性。沙拉沙星的常见剂型为普通粉剂，临床常采用饮水给药方式，存在药物性质不稳定、溶解度和口服生物利用度低的缺点[8-10]，而采用分子包合技术可以解决这些问题。环糊精(cyclodextrin, CD)是通过分子间弱相互作用形成的主客体包合物微胶囊，可以部分包裹具有合适分子尺寸和极性的疏水药物分子，它们通过非共价相互作用形成主客体类型的包合物微囊[11-13]。该包合物可提高药物的化学稳定性、膜通透性、适口感、表观水溶性、溶出度和生物利用度[14-16]。针对沙拉沙星在水中的溶解度较低，不利于扩展临床给药途径及临床药效发挥的缺点[17-18]，作者制备了沙拉沙星/β-环糊精(SAR/β-CD)包合物微囊，采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)、透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)和粉末X光衍射技术(powder X-ray diffraction，PXRD)对SAR/β-CD包合物微囊进行表征，并研究沙拉沙星/β-环糊精包合物微囊在磷酸盐缓冲液(pH6.8)中的释放特性，评价SAR/β-CD包合物微囊在鸡体内的药物代谢动力学特性，以期为喹诺酮类药物的推广使用和新制剂的开发提供参考[19-25]。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器沙拉沙星(SAR，相对分子质量385.3 g·mol-1，含量>98%，批号20180111)购自广州杨叶生物科技有限公司。β-环糊精(β-cyclodextrin, β-CD，相对分子质量1 135 g·mol-1，25 ℃时溶解度18.5 mg·mL-1，批号201804017)购自上海源叶生物科技有限公司。沙拉沙星粉剂购自安徽奥力欣生物科技有限公司。沙拉沙星标准品(10 mg，批号20171019)购自中国兽医药品监察所。恩诺沙星标准品(10 mg，批号20171211)购自中国兽医药品监察所。四丁基溴化铵(AR，99%，批号20180319)购自上海源叶生物技术公司。磷酸(GR，98%，批号20180311)购自Kermel公司。乙腈(GR，99.98%，批号20171009)购自Fisher Chemical公司，氢氧化钠(AR，含量>96%，批号20161113)购自西安化学试剂厂，甲醇(GR，含量>99.98%，批号20171201)购自美国Fisher公司。
HPLC分析系统(1290 Infinity II)购自安捷伦技术公司。溶出仪(USP-II型)购自德国PHARMA公司。冷冻干燥机购自Edwards公司。扫描电子显微镜(JSM-6701F型)购自日本电子光学株式会社。透射电子显微镜(TECNAIG2型)购自美国FEI公司。高分辨X射线衍射仪(D8Discovery型)购自德国Bruker公司。
1.2 SAR/β-CD包合物微囊及其物理混合物的制备将9.63 g沙拉沙星原药用饱和碳酸钠溶液溶解，然后缓慢加入到56.75 g β-环糊精饱和水溶液中，在恒温(50±1) ℃的条件下搅拌4 h，得到SAR/β-CD包合物微囊。制备完成后，将SAR/β-CD包合物微囊溶液放入-80 ℃的冰箱中冷冻过夜，然后迅速放入冷冻干燥器中干燥，48 h后取出[11, 14, 23]。将SAR(9.63 g)和β-CD(56.75 g)按照处方比例混合研磨得到物理混合物[23, 26-27]。
1.3 理化表征1.3.1 扫描电子显微镜(SEM)法 样品用薄金涂层包裹，在5.0 kV的工作电压下使用JSM-6701F型扫描电子显微镜扫描成像，观察沙拉沙星原料药、β-环糊精、SAR/β-CD包合微胶囊及其简单物理混合物的形貌[14, 17, 20]。
1.3.2 透射电子显微镜(TEM)法 分别取SAR/β-CD包合物、SAR原料药、β-环糊精和简单物理混合物适量，溶于超纯水中并不断搅拌得到澄清溶液，随后用特殊网状材料取出少许，再置于场发射透射电子显微镜下观察其微观形态[18, 22, 28]。
1.3.3 粉末X-射线衍射(PXRD)法 用高分辨X射线衍射仪研究SAR/β-CD包合物、SAR、β-CD及其物理混合物，设置扫描范围2θ=5°~50°，步长为2θ=0.02°，光管功率为2.2 kw(铜靶)[11-12, 14]。
1.3.4 溶出试验 磷酸盐缓冲液(pH6.8)按《中华人民共和国兽药典》(2015版) 8004、0931配制，溶解介质经过超声脱气后使用。参照溶出度测定法《中国兽药典》(2015版)一部附录0931第二法(桨法)测定，溶出介质保持在(37.0±0.5) ℃，搅拌速度为75 r·min-1。分别在900 mL的两种溶出介质中加入适量物理混合物和SAR/β-CD包合物微囊。分别在第0、5、10、15、25、35、50、70、110分时用注射器取样，以预定的间隔收集和过滤样品(5 mL)，自取样至过滤应在30 s内完成。每次收集样品，取出的液体用等体积的预热新鲜溶解介质代替，用流动相适当稀释，过滤后注入液相色谱仪进行分析[29-32]。
1.4 含量测定的液相色谱方法将参比物质精确称量，放入棕色容量瓶中，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液溶解，制成沙拉沙星质量浓度为0.099 4 g·L-1的参比溶液，4 ℃冷藏储存。按照处方比例和样品溶液的制备方法制备无沙拉沙星的阴性样品即得阴性参照液。制备质量浓度分别为9.94、19.88、29.82、39.76、49.70、59.64、69.58、79.52、89.46和99.40 mg·L-1的一系列参比溶液，用于液相色谱标准曲线的测定与绘制，以峰面积(A，mAU·s)为纵坐标，以SAR质量浓度(C，mg·L-1)为横坐标进行线性回归。分别制备高(89.46 mg·L-1)、中(59.64 mg·L-1)、低(29.82 mg·L-1)不同浓度的参比溶液(n=6)，过滤后注入液相色谱仪进行精密度和回收率试验。
1.5 包封率与增溶倍数的测定1.5.1 增溶倍数测定 分别将过量的SAR/β-CD包合物和沙拉沙星原药加入到超纯水中，在(25±2) ℃下搅拌12 h以达到稳定状态，过滤后注入高效液相色谱仪中，包合物微囊溶解度(25 ℃)与原料药溶解度的比值即为增溶倍数[29-30]。
1.5.2 包封率测定 取适量的纯净水，加入准确称量的SAR/β-CD包合物，在(25±2) ℃下振荡12 h达到平衡，过滤注入高效液相色谱仪检测，代入沙拉沙星标准曲线计算。样品一式3份。对SAR/β-CD包合物的载药量按照以下公式进行计算[30-33]。
包封率(%)=(包合物中沙拉沙星的质量/加入的沙拉沙星总质量)×100%
1.6 药代动力学试验1.6.1 动物 成年艾维茵健康鸡24只，雌、雄各半，体重(2.5±0.3) kg，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所实验站提供，动物证书编号2019001。所有试验动物均在正常条件下单独饲养，试验前12 h禁食，不禁水[10, 34]。
1.6.2 色谱条件与样品制备 色谱条件为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱，柱温30 ℃，流动相为乙腈-2%四丁基溴化铵(13:87)，检测波长280 nm，进样量20 μL[10, 27, 35]。将采集的血液离心后保留血浆待测，样品的制备方法为取血浆(500 μL)于离心管中，加入500 μL甲醇，涡旋2 min后，混合物以15 000 r·min-1的转速离心10 min，上清液通过0.22 μm过滤器过滤，将20 μL滤液注入高效液相色谱仪分析[10, 23, 35]。
1.6.3 液相色谱方法建立 用流动相配制10.00 μg·mL-1的SAR标准品原液。根据样品制备方法，将配制的SAR溶液与空白血浆混合制成标准曲线的梯度液(0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg·mL-1)。采用内标法，以沙拉沙星与恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)的峰面积比为纵坐标，沙拉沙星的浓度为横坐标，建立标准曲线。准确度和精密度的方法学研究为制备低浓度(0.50 μg·mL-1)、中浓度(1.00 μg·mL-1)和高浓度(2.50 μg·mL-1)的质控样品，分别在1 d(批次)和连续6 d(批次)，测定3种浓度标准液的响应值。分别把3种浓度的质控样品冻融3次，按照“1.6.2”中描述的方法进行处理并注入高效液相色谱仪分析[10, 27, 34]。
1.6.4 血样采集 将鸡随机分成两组，雌雄各半。一组灌胃给药SAR/β-CD微囊，另一组灌胃给药SAR粉剂，剂量均为10 mg·kg-1 (以SAR计)，分别在给药后0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、9、12和16 h采集血样，血样按照第“1.6.2”中描述的方法进行处理[23, 37]。
1.6.5 数据分析和统计 用Winnonlin(5.2.1版，CA，USA)软件进行药代动力学数据分析，用GraphPad Prism(7.0)软件作图[27, 37]。
2 结果 2.1 含量测定的液相色谱方法经验证，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流动相为乙腈-2%四丁基溴化铵(13:87)，检测波长为280 nm，进样量5 μL[1, 19]，标准曲线的典型线性方程为A=34.66C-15.867，其中A(mAU·s)为峰面积，C(mg·L-1)为浓度，R2=0.999 9, 线性关系优良。液相色谱的最低检出浓度为0.004 mg·L-1 (S/N≥3)，最低定量浓度为0.066 mg·L-1 (S/N≥10)，低(29.82 mg·L-1)、中(59.64 mg·L-1)、高(89.46 mg·L-1)3种浓度的方法学回收率分别为100.21%、99.17%和101.67%，且精密度RSD值均小于5%，表明此方法高效可行。
2.2 固态表征2.2.1 扫描电子显微镜 在扫描电镜同样的放大倍数下观察到SAR原料药为大小不一的小颗粒(图 1C)。β-CD则呈现出示规则的颗粒聚集(图 1B)。物理混合物与游离态的SAR晶体有一些相似之处，显示出两种类型的晶体组成(图 1A)。而SAR/β-CD包合物微胶囊(图 1D)呈现出致密均匀的块状结构，没有观察到β-CD或SAR两种成分的原始形态[14, 17, 20]，说明包合物制剂中β-CD与SAR存在一种新的相互作用。
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图 1 沙拉沙星(SAR)、β-环糊精(β-CD)物理混合物(A)、β-CD(B)、SAR(C)和包合物微囊(D)的扫描电镜图像 Fig. 1 SEM images of the physical mixture of sarafloxacin (SAR) and β-cyclodextrin (β-CD) (A), β-CD (B), SAR (C) and the inclusion microcapsules of SAR and β-CD (D) |
2.2.2 透射电子显微镜 在200 nm标度下，SAR原药的试验结果显示为规则的多面体结构(图 2a)。而空白β-CD是一个空泡结构(图 2b)，其中没有SAR状结构存在。同时，物理混合物(图 2c)中的不规则SAR晶体覆盖了β-CD的囊泡壁，而不是进入囊泡中的包合物。与SAR、β-CD及其物理混合物所不同的是，在图 2d的SAR/β-CD包合物微囊的囊泡中可以看到棒状的SAR结晶体存在[22, 28]。
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图 2 SAR(a)、β-CD(b)、物理混合物(c)和包合物(d)的TEM图像 Fig. 2 TEM images of sarafloxacin (SAR, a), β-cyclodextrin (β-CD, b), their physical mixture (c) and their inclusion complex (d) |
2.2.3 粉末X-射线衍射 PXRD试验结果显示SAR(图 3a)中有大量尖锐而强烈的峰，这表明药物处于结晶状态。其物理混合物(图 3c)的图谱是SAR和β-CD峰值的简单叠加，在13.22、18.30、24.08和35.28 °处有高强度峰。与以上不同的是，包裹体中的衍射图完全扩散，图 3d中SAR/β-CD包合物的衍射谱图纵坐标峰值均小于5 000，峰形变宽，峰值明显降低，而图 3中SAR(a)、空白β-CD(b)、物理混合物(c)的衍射谱图纵坐标峰值均大于8 000，且SAR(a)和物理混合物(c)的纵坐标峰值中的极大值超过12 000。而SAR/β-CD包合物微胶囊(图 3d)中13.2和26.9°的衍射峰消失，24.06和35.28°衍射峰强度明显降低，多个峰型明显变宽，即SAR和β-CD原有的强衍射峰消失表明SAR/β-CD包合物的结晶态发生了转变。
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图 3 沙拉沙星(SAR，a)、β-环糊精(β-CD，b)、物理混合物(c)和包合物(d)的PXRD谱图 Fig. 3 PXRD images of sarafloxacin (SAR, a), β-cyclodextrin (β-CD, b), their physical mixture (c) and their inclusion complex (d) |
由表 1可知，3个试验批次的SAR/β-CD包合物微胶囊的平均增溶倍数和平均包封率分别为(25.33±1.15)倍和90.33%±0.15%。
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表 1 增溶倍数和包封率 Table 1 Solubilization ratio and entrapment efficiency |
在磷酸盐缓冲液(pH6.8)中SAR/β-CD包合物微胶囊(n=6)的平均溶出率为95.6%，而普通粉剂(n=6)的平均溶出率仅为72.2%，如图 4所示，SAR/β-CD包合物微囊的溶出度明显高于SAR粉剂。
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图 4 SAR/β-CD包合物(▲)和普通粉剂(●)的溶出曲线(n=6) Fig. 4 Dissolution curve of the SAR/β-CD inclusion complex (▲) and common powder (●)(n=6) |
2.5.1 血药浓度检测的标准曲线 建立的沙拉沙星血药浓度检测标准曲线方程为y=1.563 2x-0.189 6，R2=0.999 3，其中y为SAR与恩诺沙星(ENR)的峰面积比值，x(μg·mL-1)为沙拉沙星的质量浓度(图 5)。药动学标准曲线在0.25~10.00 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系，检测限为0.05 μg·mL-1 (S/N≥3)，定量限为0.25 μg·mL-1 (S/N≥10)。
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A1. SAR峰面积；A2. ENR(恩诺沙星)峰面积 A1. Peak area of SAR; A2. Peak area of ENR (enrofloxacin) 图 5 沙拉沙星(SAR)血药浓度标准曲线 Fig. 5 Standard curve for sarafloxacin(SAR) |
2.5.2 检测方法的精密度和准确度 如表 2所示，低(0.50 μg·mL-1)、中(1.00 μg·mL-1)、高(2.50 μg·mL-1)3种质量控制浓度的药代动力学高效液相色谱分析方法日内精密度的RSD值分别为5.17%、4.00%和3.13%，日间精密度的RSD值分别为7.18%、5.20%和2.90%，均小于10%。方法学研究结果良好，符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。
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表 2 方法的精密度和准确度(n=6) Table 2 Precision and accuracy of the methodology (n=6) |
2.5.3 检测方法的回收率 回收率分析结果(表 3)表明，低质控对照组(0.50 μg·mL-1)回收率为90.55%±3.81%，中质控对照组(1.00 μg·mL-1)回收率为93.85%±3.14%。高质控对照组(2.50 μg·mL-1)回收率为98.19%±5.41%，均在90%~110%。冻融试验(n=3)表明冻融稳定性符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)规定，说明药代动力学方法学研究结果优良，满足试验要求。
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表 3 血浆中药物的回收率和稳定性(n=6) Table 3 Recovery and stability of drugs in plasma (n=6) |
2.5.4 药代动力学参数 基于体外溶出试验的研究结果，用SAR/β-CD包合物微囊和SAR粉剂分别将靶动物鸡灌胃给药，采集血样并测定血药浓度，药代动力学分析表明，SAR粉剂的AUC0-t (mg·h-1·L-1)、Tmax(h)、Cmax(μg·mL-1)值分别为17.27±0.30、0.98±0.07、1.19±0.10，而SAR/β-CD包合物微囊的AUC(mg·h-1·L-1)、Tmax(h)、Cmax(μg·mL-1)值分别为43.59±0.50、2.18±0.09、5.99±0.30(表 4)。
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表 4 药代动力学参数(x±s, n=12) Table 4 Pharmacokinetic parameters (x±s, n=12) |
2.5.5 口服生物利用度 口服SAR/β-CD包合物微囊和SAR粉剂的平均血药浓度-时间曲线如图 6所示。与SAR粉剂相比，SAR/β-CD包合物微囊的AUC0-t和Cmax均显著增加，分别是普通粉剂的2.52和5.03倍，可归因于体外溶出度研究中，包合物微囊制剂溶解度和溶出度的增加。与沙拉沙星普通粉剂相比，制备的SAR/β-CD包合物微囊提高了SAR在鸡体内的生物利用度。
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图 6 SAR/β-CD包合物(●)和普通粉剂(▼)的血药浓度 Fig. 6 Plasma concentration of the SAR/β-CD inclusion complex (●) and common powder(▼) |
本研究采用透射电镜、扫描电镜和粉末X光衍射技术对沙拉沙星/β-环糊精包合物微胶囊进行表征，从透射电镜试验结果中，可以看到SAR以棒状结晶体的形式存在于SAR/β-CD包合物微囊的空腔内，说明客体分子SAR的结晶态由规则的多面体转变为棒状并被成功包裹在β-CD中；由扫描电镜的试验结果可知，SAR/β-CD包合物微囊的表面形貌与物理混合物的完全不同，说明SAR和β-CD是以一种新的固相形态存在于包合物微囊中。由粉末X光衍射结果可知，β-CD与SAR形成包合物微囊后，衍射图呈晕状且大部分结晶衍射峰消失，说明包合物在一定程度上改变了SAR分子的取向，证明了SAR/β-CD包合物与原料药、β-环糊精和其物理混合物有本质上的区别，即成功获得了SAR/β-CD包合物微囊[20, 22]。这与同类制剂研究中张弘课题组[28]对漆酸A与β-环糊精及其衍生物包合物和杨丽娟等[35]对鬼臼毒素/羟丙基-β-环糊精超分子体系的物质确证试验结论相似, 即包合物微囊微观形貌和客体分子的取向都发生改变。较高的包封率是包合反应完成程度的重要指标之一，SAR/β-CD包合物微囊的包封率和增溶倍数结果显示，3个试验批次的平均包封率和增溶倍数分别为90.33%和25.33倍，因为较高的包封率使增溶效果明显增强。在磷酸盐缓冲液(pH6.8)中，SAR/β-CD包合物微囊的溶出率为95.60%，而普通粉剂的溶出率仅为72.20%，普通粉剂在溶解介质中的溶解效率较低，包合物新制剂的溶解度和溶出度的明显提高，意味着更多的药物在肠道中释放，这种变化归因于SAR/β-CD包合物微囊形成后药物原有结晶态的改变，与同类制剂研究中，阿里安娜·佐皮亚团队对硝苯地平/β-环糊精-天冬氨酸超分子体系[36]和佐尔坦·菲洛普对磺丁醚-β-环糊精/壳聚糖纳米及微米粒子[37]的溶出试验结论相似，即包合物微囊的溶解度和溶出效率明显提高，试验结果完全可以满足工业生产与临床使用的要求。
沙拉沙星/β-环糊精包合物微囊的药代动力学评价结果表明，口服SAR/β-CD包合物微囊后，药物的AUC0-t是粉剂的2.52倍，Cmax是粉剂的5.03倍，与同类制剂研究中Devasari等[33]对厄洛替尼/磺丁基醚-β-环糊精的包合物的体内评价结论类似，即具有更大的AUC0-t和Cmax值，口服生物利用度得到提高，且体内清除率降低为原药的0.39倍，说明包合物微囊中的药物在生物体内的驻留时间得到了延长。与SAR/β-CD包合物微囊相比，普通粉剂吸收缓慢、程度低且不规则，而包合物微囊的药时曲线符合房室开放模型且吸收迅速，使药物的体内生物利用度得到明显提高，可用于全身感染性疾病的防治。
4 结论将沙拉沙星与β-环糊精相结合，成功制备了沙拉沙星/β-环糊精包合物微囊，制备方法简单，制备过程中无有害物质残留，达成了提高药物的溶解度、溶出度和生物利用度的目的。在同样的药物剂量下, 该方法可以提高抗生素的药效，有利于减量化使用的推广、扩展临床给药途径和保障临床药效的发挥，研究结果对药物新剂型的开发和临床应用具有积极意义。
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