布鲁菌(Brucella)是一类革兰阴性、兼性胞内寄生菌,可造成人和动物的布鲁菌病(简称布病)[1]。感染布鲁菌后,可引起人发热、关节炎、感染性心内膜炎、子宫内膜炎、脾脓肿和败血症[2-4],引起公畜睾丸炎和附睾炎,母畜不孕和流产[5]。目前,控制布病传播和感染的主要方式为预防。布病的预防主要通过接种疫苗来实现[6]。现有的疫苗种类主要有弱毒苗、突变株疫苗、活载体异源表达疫苗和亚单位疫苗等,但其应用效果各有利弊[7]。弱毒苗虽然保护效果较好,但其无法区分自然感染和疫苗免疫[8]。突变株疫苗虽然可以用于鉴别诊断,但有些疫苗仍然存在一定毒力,可造成怀孕母畜流产[9]。活载体异源表达疫苗虽然无毒力、安全性高,但其保护效果较差[10]。亚单位疫苗可以消除安全隐患,且在多种布鲁菌间存在交叉免疫性,保护效果好[11]。因此,疫苗的未来研究方向是毒力弱,免疫原性强,能诱导机体产生较强的细胞免疫、体液免疫和保护力。
在布鲁菌中HFQ是一种介导RNA-RNA相互作用并在转录后水平调节基因表达的蛋白[12]。HFQ影响VirB IV型分泌系统和LuxR型调控子BabR的表达[13]。此外,研究发现,布鲁菌hfq突变株的毒力减弱[14-15]。因此,hfq是布鲁菌毒力的重要毒力基因[16]。目前,对HFQ的研究主要集中于转录调控和缺失株疫苗上,对HFQ蛋白诱导机体产生免疫反应的研究还未见报道。
一个好的候选抗原应该能够刺激机体产生较高的体液免疫水平和细胞免疫水平[17]。体液免疫主要是通过产生抗体,增强吞噬细胞的吞噬作用,中和细菌毒素[18]。细胞免疫通过产生细胞因子,杀灭入侵和胞内寄居的病原体[19]。其中,IFN-γ和IL-4是重要的细胞因子,在防控布病中发挥重要作用。以IFN-γ为特征的Th1型细胞免疫反应与抵抗布鲁菌的保护性免疫有关[20],IFN-γ可杀伤被布鲁菌感染的巨噬细胞,起到保护宿主的作用[21]。IFN-γ在清除胞内的布鲁菌中发挥重要作用[22],是布鲁菌免疫的关键细胞因子和巨噬细胞杀菌活性所必需的细胞因子[23]。布鲁菌感染宿主后可诱导宿主细胞分泌IFN-γ,从而上调巨噬细胞的吞噬作用[24]。因此,IFN-γ是评价抗原刺激或免疫后体内外免疫应答的主要细胞因子之一。IL-4是Th2型细胞因子,介导细胞免疫应答[25]。因此,IFN-γ和IL-4的表达水平表示Th1/Th2混合免疫反应的能力。
为此,本研究为了筛选鉴定布鲁菌新的疫苗候选抗原,对布鲁菌HFQ进行原核表达,并对重组蛋白的细胞免疫反应和体液免疫反应进行检测,为确定HFQ蛋白成为布鲁菌重组亚单位疫苗候选抗原提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 主要试验材料M5-90疫苗株为本研究室保存;大肠杆菌E. coli DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自Novagen公司;pMD 19-T simple载体、限制性内切酶、T4连接酶、DNA Marker均购自TaKaRa公司;pET-32a载体、蛋白Marker均购自Promega公司;Taq DNA聚合酶、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司;IPTG诱导剂、氨苄青霉素、NC膜均购自北京索莱宝科技有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG购自美国EarthOx公司;小鼠布鲁菌IgG ELISA检测试剂盒、细胞因子ELISA检测试剂盒均购自美国RD公司;热灭活布鲁菌S2308、布鲁菌M5-90和PBS免疫绵羊的血清由石河子大学张辉教授馈赠;RAW 264.7小鼠巨噬细胞系购自北京协和细胞资源中心。
1.2 重组质粒的构建与鉴定根据GenBank登录的布鲁菌S2308的hfq基因序列(BAB1_1134),利用Primer 5.0软件设计引物(表 1),引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以热灭活布鲁菌S2308为模板,以HFQ-N、HFQ-C为引物扩增hfq基因。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测回收纯化后克隆至pMD 19-T simple载体,转化至E. coli DH5α感受态细胞。提取质粒后,以HFQ-N/C引物鉴定阳性质粒,采用限制性内切酶SalⅠ/XhoⅠ酶切后克隆至pET-32a质粒,构建重组质粒pET HFQ-32a。重组质粒经限制性内切酶SalⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定和PCR验证,鉴定正确的质粒由上海生工生物工程股份有限公司测序鉴定。将鉴定正确的质粒,转化至E. coli BL21感受态细胞。对照组转化pET-32a空质粒。
将含pET HFQ-32a重组质粒的克隆菌或含pET-32a空质粒的克隆菌培养至OD600nm为0.4~0.6时,取2 mL细菌悬液作为对照,在剩余菌液中加入终浓度1 mmol·L-1的IPTG分别于诱导2、4和6 h时取样,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
利用AKTAxpress智能多维纯化系统对表达蛋白进行纯化,将纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳,检测蛋白的纯化效果。
进一步以布鲁菌M5-90和PBS免疫绵羊的血清(1:300)为一抗,以HRP标记的兔抗羊IgG(1:2 000)为二抗,经Western blot检测rHFQ的反应原性。
1.4 小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的细胞因子检测培养单层小鼠巨噬细胞RAW 264.7(约1×106细胞·孔-1),采用1 mL含终质量浓度为20 μg·mL-1 rHFQ或pET-32a空载体的DMEM刺激细胞,对照组只加PBS。在刺激4、8、12和24 h时分别收集细胞上清液,过滤后12 000 r·min-1离心15 min,利用小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒测定IFN-γ和IL-4的水平。
按照文献报道,以100:1的侵染复数(100个细菌侵染1个细胞)侵染小鼠巨噬细胞RAW 264.7[26]。在侵染4、8、12和24 h时分别收集细胞上清液,按上述方法测定IFN-γ和IL-4的水平。
1.5 rHFQ蛋白免疫小鼠后诱导细胞因子水平分析将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组5只。以纯化后的rHFQ重组蛋白和pET-32a空载体作为免疫原,经弗氏完全佐剂乳化后以皮下注射方式首免小鼠,首免两周后,用弗氏不完全佐剂乳化rHFQ和pET-32a空载体后进行加强免疫。二免两周后, 再用弗氏不完全佐剂乳化rHFQ和pET-32a空载体加强免疫一次。每次免疫蛋白量为50 μg。对照组小鼠注射PBS。三免疫后35 d颈椎脱臼处死小鼠,按照文献报道的方法分离脾细胞[27]。免疫rHFQ的小鼠脾细胞用rHFQ、刀豆蛋白或培养液进行刺激。免疫PBS和pET-32a空载体的小鼠脾细胞用rHFQ、热灭活M5-90、刀豆蛋白或培养基进行刺激。利用小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒测定IFN-γ和IL-4的水平。
按照文献报道,将100 μL含1×106 CFU M5-90的PBS腹腔注射BALB/c小鼠[28]。免疫后35 d处死小鼠,分离脾细胞,用热灭活M5-90、刀豆蛋白或培养液刺激脾细胞,测定IFN-γ和IL-4的水平。
1.6 血清学分析按上述方法免疫小鼠,按照文献报道的方法于rHFQ重组蛋白和pET-32a空载体三免后,以及M5-90免疫后第7、14、21、28、35、42和49天采集小鼠外周血,分离血清[29]。利用ELISA检测试剂盒测定小鼠血清中IgG水平。
1.7 统计分析细胞因子水平的表达用平均细胞因子浓度±标准差(s)表示。抗体水平用平均OD450nm±s表示。用t检验方法统计显著性(P值)。用SPSS 17.0软件对各组间的差异进行方差分析。P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 重组质粒(pET HFQ-32a)的构建与鉴定利用PCR的方法,以热灭活的布鲁菌S2308为模板,扩增hfq基因,获得大小为237 bp的基因片段,与预期大小相符(图 1),表明扩增获得hfq基因。
将重组质粒pET HFQ-32a经SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,结果显示,获得两条目的条带,一条为pET-32a载体片段,另一条为目的基因条带(图 2A),且测序结果与GenBank登录的序列相似性为100%。重组质粒pET HFQ-32a经PCR验证发现,扩增出大小为237 bp的基因片段(图 2B),表明重组质粒pET HFQ-32a构建正确。
将重组质粒pET HFQ-32a转化至DE3表达菌,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,结果显示,在25.8 ku处出现了目的蛋白条带,与预期相符(图 3A)。表明rHFQ表达正确,且在诱导6 h时蛋白表达量最高。
表达蛋白经AKTAxpress智能多维纯化系统纯化后进行SDS-PAGE检测,结果显示,在相应位置出现单一蛋白条带,rHFQ的纯化效果较好(图 3A)。对纯化蛋白进行Western blot分析,结果显示,在大约25.8 ku处出现特异性反应条带(图 3B),表明rHFQ具有良好的反应原性。
2.3 小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的细胞因子检测利用pET-32a空载体,rHFQ和M5-90刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7,刺激后不同时间取样,检测细胞中IFN-γ和IL-4的水平。结果显示,当rHFQ刺激细胞4 h时,IFN-γ的表达量为183.37 pg·mL-1,IL-4的表达量为152.25 pg·mL-1,表达水平显著高于对照组(PBS和pET-32a)(P < 0.05),并且这种差异随着刺激时间的延长而增加(图 4)。rHFQ刺激细胞后,IFN-γ和IL-4的水平略低于M5-90组,两组差异不显著(P>0.05)。表明rHFQ刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7后,可诱导细胞因子IFN-γ和IL-4的产生。
为了检测rHFQ诱导的细胞免疫反应,pET-32a空载体、rHFQ和M5-90免疫BALB/c小鼠35 d后,无菌分离脾细胞,检测脾细胞中细胞因子IFN-γ和IL-4的水平。结果显示,当用RPMI 1640刺激小鼠脾细胞时,各组脾细胞有较少细胞因子产生(图 5)。当用ConA刺激时,免疫rHFQ小鼠脾细胞IFN-γ的表达量为1 205.55 pg·mL-1,IL-4的表达量为622.22 pg·mL-1,免疫M5-90小鼠脾细胞IFN-γ的表达量为1 232.32 pg·mL-1,IL-4的表达量为645.05 pg·mL-1,表达水平与免疫PBS和pET-32a空载体的小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-4的水平相似,差异不显著(P >0.05)(图 5)。当用rHFQ刺激时,免疫rHFQ小鼠脾细胞IFN-γ的表达量为1 828.37 pg·mL-1,IL-4的表达量为1 095.58 pg·mL-1,表达水平显著高于免疫PBS和pET-32a空载体的小鼠(P < 0.01)(图 5)。当用热灭活M5-90刺激时,免疫M5-90小鼠脾细胞IFN-γ的表达量为1 885.35 pg·mL-1,IL-4的表达量为1 153.56 pg·mL-1,表达水平显著高于免疫PBS和pET-32a空载体的小鼠(P < 0.01)(图 5)。结果表明,小鼠免疫rHFQ后,可诱导机体产生细胞免疫反应。
收集pET-32a、rHFQ、M5-90和PBS处理小鼠后不同时间点的血清,用ELISA方法检测血清中IgG的抗体水平。结果显示,免疫rHFQ和M5-90的小鼠均可产生较高水平的IgG,两组差异不显著(P>0.05),并且IgG的水平随着免疫时间的延长而升高,在免疫后第42天到达高峰(图 6)。但是注射PBS和pET-32a空载体的小鼠产生较低水平的IgG(图 6)。结果表明,小鼠免疫rHFQ后,可诱导机体产生体液免疫反应。
布鲁菌是革兰阴性胞内寄生菌,可适应宿主细胞内的各种变化,达到其在胞内存活的目的[30]。HFQ是布鲁菌的伴侣蛋白,参与布鲁菌在逆境条件下的生存[31]。已有研究显示,在布鲁菌感染期间,hfq影响大量靶基因的表达,如omp25、omp31、vjbR、htrA、gntR和dnaK等[32]。羊种布鲁菌16MΔhfq突变株在宿主细胞内的存活能力减弱,在小鼠体内的毒力降低,且能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,表明HFQ是布鲁菌的重要组成成分[32]。因此,本研究选择HFQ进行研究。重组蛋白疫苗免疫动物后可持续地表达目的蛋白,激活特异性T细胞,有效防控布病。以pET-32a为目的载体,纯化表达的rHFQ重组蛋白已被证明是绵羊布病血清学诊断的潜在抗原[15]。本研究利用布鲁菌rHFQ刺激RAW 264.7细胞,结果显示,可诱导较高水平的细胞因子。
理想的疫苗应诱导机体产生免疫反应。细胞免疫和体液免疫的产生情况可反映抗原刺激机体后产生免疫应答的水平。本研究发现,rHFQ可诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7和免疫小鼠脾细胞高水平地表达IFN-γ和IL-4,表明rHFQ可以通过刺激巨噬细胞和脾细胞分泌IFN-γ和IL-4触发细胞免疫反应。
IgG主要在机体体液免疫中起保护作用,是抗感染的主要抗体。IgG有4个亚型:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。研究发现,Th2型细胞分泌的IL-4可促进IgG1的产生,Th1型细胞分泌的IFN-γ可促进IgG2a的产生[33]。本研究发现,小鼠免疫rHFQ后,可产生较高水平的IgG,且随着时间的延长而增加,在免疫后第42天出现峰值,表明rHFQ可诱导机体产生高水平的体液免疫反应。
目前,HFQ已被广泛用于开发疫苗研究,以抵抗各种疾病,如鼠伤寒沙门菌[34]、维氏气单胞菌[35]、嗜水气单胞菌[36]等。在布鲁菌的各类疫苗中,除了产生细胞和体液免疫反应外,还应具有一定的保护力。本研究证实HFQ蛋白是免疫优势抗原,免疫学评价显示rHFQ重组蛋白疫苗有一定的应用前景,但其保护效果还需进一步研究。
4 结论rHFQ具有良好的反应原性,且rHFQ刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7后,可诱导宿主细胞产生较高水平的Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4。此外,rHFQ免疫小鼠后,可诱导机体产生较高的细胞免疫和体液免疫水平。因此,HFQ蛋白是布鲁菌亚单位疫苗研制较理想的候选抗原。然而,该疫苗的安全性需要进一步研究。
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