猪瘟在我国属于一类动物疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须上报的动物疫病之一^[1]。对猪瘟病毒核酸的检测是判定是否感染猪瘟病毒的主要手段^[2]。为全面考察动物疫病检验机构对猪瘟病毒核酸的检测能力，国家认证认可监督管理委员会(以下简称“认监委”)组织了A类能力验证项目“猪瘟诊断检测技术”(CNCA-19-A01)，该项目由中国兽医药品监察所国家/OIE猪瘟参考实验室承担^[3]。动物疫病检测也是结合国家动物疫病防治计划和净化工作的要求，提高各省级兽医实验室在动物疫病防控一线的实战能力的重要措施^[4]。能力验证的结果是相关检验检测机构在猪瘟病毒核酸检测能力的客观反映。根据《检验检测机构资质认定管理办法》和《实验室能力验证实施办法》等有关规定，本次能力验证项目旨在了解国内猪瘟病毒核酸检测技术整体水平，帮助实验室发现问题，提高检验能力。能力验证满意结果作为参加者相关检验检测项目的能力证明，该参加者2年内可免于相关项目的现场评审。

1 材料与方法 1.1 参加单位

本次能力验证为A类强制参加项目，由国家认监委颁发检验检测资质认定(CMA)证书的检验检测机构和各相关国家产品质检中心，凡具有猪瘟诊断检测技术项目检测能力和资质的，为强制参加单位，必须参加本次能力验证。同时，鼓励由各省、自治区、直辖市及新疆生产建设兵团市场监管部门颁发资质认定证书的检验检测机构和其他机构自愿参加。

1.2 检测样品的制备

待检样品由国家/OIE猪瘟参考实验室制备，包括4份，其中强阳性样品的编号为A，弱阳性样品为B，阴性样品为C和空白样品D。采用国家标准方法《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)对A、B、C和D样品进行检测，A样本的Ct值不高于27，B样品的Ct值不高于34，样品C和D无Ct值。同时，采用国家标准方法《猪瘟病毒RT-nPCR检测方法》(GB/T 36875—2018)进行检测，样品A和B扩增出目的条带，为猪瘟病毒核酸阳性；样品C和D未扩增出目的条带。所有样品无菌定量分装为1 mL·瓶^-1，经过真空冷冻干燥处理，均呈乳白色至白色疏松团块，加稀释液后可迅速溶解。对分装后的所有样品进行三位随机编号，编号为N***。

1.3 样品的均匀性和稳定性检验

待检样品均为真空粉末冻干，可在-20 ℃下长期稳定保存。因此，将-20 ℃作为样品的正常保存温度。对能力待检样品进行均匀性和稳定性检验^[5-6]。

1.3.1 均匀性检验 　　样品制备分装后，于-20 ℃冰箱中保存，随机抽取A和B样品各10份，C、D样本各4份，由2名技术人员按照相应的国家标准《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)和《猪瘟病毒RT-nPCR检测方法》(GB/T 36875—2018)进行均匀性检验，样品的所有重复测试应按随机次序进行。

1.3.2 稳定性检验 　　由于本品为冻干的固体样品，且为真空密封保存，不存在湿度影响的问题，因此影响样品稳定性的唯一因素仅为温度。随机抽取猪瘟病毒核酸样品(A样、B样、C样、D样)各20瓶，分为两组，分别置于37和4 ℃环境中，放置7、14和21 d，每个时间点各随机取2瓶，置于-20 ℃环境下，待试验结束时，由两名实验人员同时采用2种国标方法进行稳定性检测。同时取保存在-20 ℃环境中的核酸样品作为检测对照。两种检验的操作方法及引物、探针参见《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)和《猪瘟病毒RT-nPCR检测方法》(GB/T 36875—2018)。

1.4 检测方法

本次能力验证检测盲样为含有或不含有猪瘟病毒疫苗株的细胞培养物。样品冻干前，加入了适量的冻干保护剂。检测前，需用1 mL无酶水(DNase/RNase-Free Water)复溶后，再进行RNA提取。本次检测不限定RNA提取和核酸检测方法，各检测实验室应对每份样品中是否含猪瘟病毒核酸进行定性检测。

1.5 评价原则

检测样品全部符合预期结果，评价为“满意”；出现1个或1个以上样品与预期结果不符，则评价为“不满意”；若出现“不满意”结果，参试单位可申请补测1次。若补测结果仍为“不满意”，则表明该实验室暂不具备该参数的检测能力。

2 结果 2.1 制备样品的均匀性和稳定性 2.1.1 均匀性检验

2.1.1.1 　　RT-nPCR检测结果：采用RT-nPCR方法，两名实验人员对A和B样本的10份重复样本均扩增出目的条带，检测均为核酸阳性。C和D样本的4份重复样本均未扩增出条带，检测为核酸阴性。

2.1.1.2 　　荧光RT-PCR结果：两名实验人员的检测样本A的Ct值在24.63~26.05波动，变异系数分别为1.72%和1.15%；样本B的Ct值在28.79~ 30.28，变异系数分别为1.37%和0.52%；样本C和D无Ct值。以上结果说明制备的猪瘟病毒核酸样本具有良好的均匀性。从荧光扩增曲线的结果看(图 1)，样本扩增重复性良好。

2.1.2 稳定性检验

2.1.2.1 　　RT-nPCR方法检验结果：两名实验人员采用普通RT-nPCR方法进行检测，37和4 ℃条件下保存的样本A和B在7、14和21 d时，均检测出核酸阳性，而样本C和D均为阴性。

2.1.2.2 　　荧光RT-PCR方法检验结果：两名实验人员采用荧光RT-PCR方法对样本进行稳定性检验，结果显示，在37和4 ℃条件下保存的样本A和B在7、14和21 d时，均呈现出明显的扩增曲线，样本C和D无扩增曲线(图 2)。

猪瘟病毒核酸样品在37 ℃下保存7、14、21 d，A样品的Ct值为25.90~27.40，变异系数为2.31%；B样品的Ct值为28.47~29.73，变异系数为1.63%；C和D样品均无Ct值；在4 ℃条件下，A样品的Ct值为25.42~27.83, 变异系数为3.49%；B样品的Ct值为28.42~29.83，变异系数为2.05%；C和D样品均无Ct值；-20 ℃保存条件下，A样的Ct值为26.32和26.26，B样的Ct值为30.32和29.58，C和D样品无Ct值。结果表明，制备的样品在不同的保存条件下，Ct值均无明显变化，核酸基本无降解，样品稳定。

2.2 参试实验室的地理和行业分布

报名参加本次能力验证项目的单位共计97家。从行业分布来看，包括出入境检验检疫机构(海关)36家，动物疫病预防控制机构9家，其他检测机构、科研院所52家；从地域分布上看，参加单位遍布我国28个省/自治区/直辖市，除宁夏、青海、西藏、香港、澳门、台湾等6地，基本覆盖我国全境。因此，本次能力项目能够基本上反映我国猪瘟病毒核酸检测能力的整体水平。97家单位中，强制参加单位41家，主要为各地的出入境检验检疫机构(海关)，占42.3%；自愿参加单位56家，大多为检验检测机构，占57.7%。以上数据充分说明了猪瘟病毒核酸检测是动物疫病检测实验室的重要检验项目，实验室其检测能力希望能获得“认监委”或参考实验室等权威机构的认可。

2.3 初测及补测结果

在初测过程中，有91家检测结果为“满意”，6家为“不满意”，总体满意率为93.81%。其中，56家自愿参加单位的初测满意率为91.07%，41家强制参加单位的初测满意率为97.56%。强制参加单位的初测满意度高于自愿参加单位。参加补测的6家单位，有5家补测“满意”，1家补测“不满意”，补测满意率为83.3%。

3 能力验证结果技术分析 3.1 检测方法及标准的引用

本次“猪瘟病毒核酸”参数的检测未限定检测方法。目前，用于猪瘟病毒核酸的检测方法主要有荧光RT-PCR和普通RT-PCR两种方法。本次能力验证中，92.8%的单位采用了荧光RT-PCR方法。30.9%的单位采用了普通RT-PCR，8.2%的单位采用了上述两种方法。针对猪瘟病毒核酸检测，我国已经颁布了多个国家标准和行业标准。此次能力验证，有69家采用了国标《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)，占71.13%；有10家单位采用《猪瘟病毒RT-nPCR检测方法》(GB/T 36875—2018)，占10.31%；有9家单位采用《猪瘟诊断技术》(GB/T 16551—2008)，占9.28%；有4家单位采用行业标准《猪瘟病毒荧光RT-PCR检测方法》(SN/T0762—2011)；还有少数单位采用了部颁规范、《陆生动物诊断试验及疫苗手册》(OIE)以及自建方法进行检测。可以看出，绝大多数单位采用了正确的国家标准作为检验依据，但有1家单位却选择了错误的国家标准，并且补测结果仍为“不满意”，该单位是本次能力验证试验中唯一一家最终结果为“不满意”的单位。

3.2 核酸提取试剂的选择

在进行猪瘟病毒核酸检测时，除了核酸扩增之外，核酸提取的过程也是影响核酸检测结果的重要环节。目前，用于核酸提取的方法主要有核酸抽提试剂盒(柱式)、自动核酸提取仪(磁珠法)和手工抽提(Trizol试剂)3种。参加“猪瘟病毒核酸”参数检测的有97家单位，初测过程中有57.7%的单位选择了商品化核酸提取试剂盒(柱式)，有35.1%的单位选择自动核酸提取仪(磁珠法)，仅有8.2%的单位选择手工抽提(Trizol试剂)病毒RNA；其中有67.4%的单位选择了国产试剂/仪器进行RNA抽提，32.6%的单位选择进口试剂/仪器。在6家初测结果“不满意”单位中，有4家选择的是核酸提取试剂盒(柱式)，其中，3家为国产试剂盒，1家为进口试剂；2家采用的是自动核酸提取仪(磁珠法)，均为国产试剂和仪器。

病毒核酸检测结果的影响因素很多，如核酸提取试剂的提取效率，操作人员的熟练程度，样品的质量，以及核酸扩增试剂和扩增仪器的性能等。从各实验室核酸检测结果来看，Ct值的偏差较大，强阳性样品的Ct值的浮动范围在19~30，弱阳性在25~ 32，产生这一差异的结果可能与核酸提取的效率有关。但从本次能力验证的整体结果看，虽然各核酸提取试剂的提取效率存在差异，但基本不会影响最终的定性检测结果。

3.3 核酸扩增试剂的选择

本次能力验证中，有82家选择了荧光RT-PCR方法，其中有28家自配荧光RT-PCR检测体系，其余54家选择了商品化的荧光RT-PCR检测试剂盒(均为国产)，涉及13个品牌，使用次数最多的主要集中在5个品牌；22家选择了普通RT-PCR方法，其中15家自配RT-PCR检测体系，另有7家选用商品化试剂盒，涉及3个品牌，有5家选择了同一品牌，并且这7家单位的初测结果全部为“满意”，说明此次能力验证试验采用普通RT-PCR检测试剂盒产品质量稳定。

3.4 检测仪器的影响

在本次能力验证中，有54家选择了进口的荧光PCR仪器，涉及6个品牌，其中，有40家为同一主流品牌的不同型号。有4家为国产仪器，涉及3个品牌。初测出现“不满意”结果的单位，有4家使用了进口品牌，其中，主流品牌的有2家，只有1家选择了国产品牌。通过对原始记录查阅，各单位所提供的原始扩增图谱均为典型的扩增曲线。另外，参加补测单位通过更换试剂或规范操作等改进措施，基本都能得到“满意”结果(除1家单位外)，说明所使用的仪器都能满足此次能力验证。

3.5 “不满意”原因技术分析

在初测过程中，有6家单位为“不满意”，91单位的为“满意”。经过补测后，6家单位中的5家为“满意”。通过分析发现，只有1家(No.16)同时更换了核酸提取试剂和扩增试剂品牌，由使用次数较低的产品换为使用次数较高、市场认可度较高的产品；另外5家未更换核酸提取试剂，其中2家(No.50和No.117)更换了核酸扩增试剂品牌(但方法类型未发生变化)，另外3家(No.66、96、83)未更换品牌，其中1家(No.96)选择了同一品牌不同批次产品(表 1)。

在出现不满意结果的6家单位中，有4家提供了自查报告，对初测过程中出现的问题进行了分析。结合参试单位的自查结果以及项目组对原始报告的分析结果，对各个单位在初测过程中出现错误的原因进行了分析。由检测试剂质量不合格导致的错误可能有2家；由于检验员操作不当造成的错误可能有2~3家；由于仪器导致的1家；由于自身管理不到位导致的1家。

4 讨论

能力验证是利用实验室间指定检测数据的比对，确定实验室从事特定测试活动的技术能力^[7]。能力验证是实验室管理和检验技术能力的综合表现，是实验室通过外部措施补充其内部质量控制方法的技术方法，是确保实验室质量管理体系持续改进的有效措施之一^[8]。在国外，外部质量评价体系(External Quality Assessment，EQA)或能力验证(Proficiency Testing，PT)已经被广泛应用于疫病检测、诊断、生物标本制备^[9]以及刑侦^[10]等多个领域。通过对能力验证中错误结果的全过程分析，包括样本的处理和识别，检测过程，数据结果的描述等，可以帮助实验室找出问题的根本原因^[11]。

动物疫病检测实验室的诊断能力是检测机构综合能力的体现。合格的检验机构应具备以下几个必要条件：1)完善的质量管理体系；2)高素质的检验人员，有能力对所检验的疫病进行科学的辨别，采用正确的检测标准和检测方法，并能够进行熟练且正确的操作；3)检验机构需建立严格和科学的供应商评价体系，确保所采用的诊断试剂质量可靠，结果准确；4)检验的复核和审批人员也应具备良好的理论和实操技能，能够对检测过程中的存在的问题进行识别与判断。

通过对本次能力验证项目的分析，对检测机构有如下建议：1)进一步完善和严格执行质量管理制度，从制度层面保证检验质量；2)加强基础理论和实操培训，提高检验员、复核员素质，确保检验过程的准确性；3)建立机构内部的质量控制体系，对采购的诊断试剂进行严格的供应商评价，每批产品需进行内控样品检验合格后方可投入使用；4)严把审核关。加强对复核员和审核人的培训，提高责任意识，切实发挥审核的作用，把好检验的每一道关卡！

5 结论

此次能力验证结果表明，我国90%以上猪瘟检测机构能够提供正确的检测结果，可以满足猪瘟诊断和监测的需求。对极个别不达标机构，通过本次能力验证项目查找出了存在的问题，能够帮助该单位及时纠正错误，进一步提升猪瘟诊断能力。