猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus, APPV)是一种能引起仔猪先天性震颤的病原，于2015年经宏基因组测序意外发现[1]。其后2018年，国际病毒分类委员会将其归类为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)K型瘟病毒(Pestivirus K)。APPV为单股正链RNA病毒，基因组全长约11 kb，仅含有1个编码3 635个氨基酸残基的开放阅读框(open reading frame, ORF)，两侧为5′和3′端非编码区。其基因组结构与猪瘟病毒相似，由4个结构蛋白(C、Erns、E1和E2)及至少8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)组成[1]。APPV与瘟病毒属其他成员相似，既可以垂直传播也可以通过接触发生水平传播[2]。2015年Arruda等[3]及2016年Beer等[4]的研究均表明，APPV是引起A-Ⅱ型仔猪先天性震颤(congenital tremor, CT)的病原。随后德国、荷兰、西班牙、澳大利亚、英国、中国、加拿大和巴西等国家相继在具有CT症状的新生仔猪中检测出APPV，表明APPV已在世界范围内流行，对养猪业构成潜在威胁。国内虽然已有该病报道，但毒株信息局限于西南、两广等南方地区，缺少全国范围的调查，不同时间和地区间流行毒株是否存在差异尚不清楚。为进一步分析我国APPV的感染情况以及基因组特征和毒株遗传变异规律，本研究选取2015—2017年采自全国22个省(自治区、直辖市)93个规模化猪场的285份血清样品进行APPV核酸检测，分析其感染情况和毒株基因组特征，以为揭示APPV的感染状况、基因组特征以及遗传变异规律提供重要数据信息，为APPV的防控提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 样品来源研究中所用样本由中国农业大学农业部动物流行病学重点实验室(以下简称本实验室)保存。2015—2017年收集的猪临床血清样本285份分别来自安徽、北京、福建、广东、广西、贵州、河北、河南、黑龙江、湖北、湖南、吉林、江苏、江西、辽宁、山东、山西、上海、四川、天津、云南、浙江共22个省(自治区、直辖市)的93个规模化养猪场。血清来源主要为发生流产或呼吸道症状的猪群送检样品，无猪群是否发生先天性震颤的明确记录。
2017年3月，河北唐山某规模化猪场，猪群出现先天性震颤发病仔猪，采取血清、脑脊液和脑组织，用于APPV全基因组序列扩增和测序。
1.2 主要试剂RNA提取试剂盒QIAampⓇ Viral RNA Mini Kit和E.Z.N.ATM Viral RNA Kit分别为Qiagen和Omega公司产品；反转录试剂盒PrimerScriptTM RT Master Mix和SuperScirptⓇ Ⅳ Reverse Transcriptase分别购自TaKaRa宝生物和Invitrogen公司；2×Vazyme Lamp master mix(Dye Plus)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；KOD FX DNA聚合酶购自TOYOBO生物科技有限公司；Trans2K Marker购自北京全式金生物有限公司。
1.3 样品的处理利用E.Z.N.A.TM Viral RNA Kit提取血清样本中的病毒基因组，置-80 ℃保存。
取临床样本中的脑组织和2% DMEM按1:3体积比混合，充分研磨后，研磨液经-80 ℃冻融3次，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min。取上清，利用QIAampⓇ Viral RNA Mini Kit提取病毒基因组，置-80 ℃保存。
1.4 APPV感染状况检测及E2基因序列分析参考GenBank中APPV参考序列，针对E2基因上下游保守区域，运用Primer 5.0软件设计两对用于套式PCR扩增APPV E2基因的引物(表 1)，以APPV_OR为反转录引物，利用PrimerScriptTM RT Master Mix(TaKaRa)对样本中病毒基因组进行反转录，合成病毒cDNA。用套式PCR方法扩增APPV E2基因。首先用外侧引物进行第1轮PCR扩增，PCR反应体系：2× Vazyme Lamp master mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环35次；72 ℃ 7 min。将第1轮PCR产物10倍稀释后作为模板，进行第2轮PCR扩增，反应体系和条件同第1轮。以1%琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行检测。
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表 1 扩增APPV E2基因的引物序列 Table 1 The primers designed for amplification of the APPV E2 gene |
将RT-PCR阳性样本的纯化回收产物送至金唯智生物科技(北京)有限公司进行测序。在GenBank中下载相关APPV参考序列(表 2)，使用DNAStar Lasergene软件中的Clustal W算法对所获得的序列进行比对分析。使用MEGA X软件中的Maximum-Likelihood算法对E2序列进行进化树分析，Bootstrap为500次重复。
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表 2 APPV全基因组扩增引物 Table 2 The primers designed for APPV whole-genome amplification |
将APPV基因组分为7个有相互重叠区域的片段，在保守区域设计PCR引物(表 2)。利用SuperScirptⓇ Ⅳ Reverse Transcriptase对扩增样本中的病毒基因组进行反转录，合成病毒cDNA。PCR扩增APPV各片段，PCR反应体系：2 μmol·L-1 dNTPs 10 μL，2×PCR buffer for KOD FX 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA模板5 μL，KOD FX 1 μL，DEPC水6 μL。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s·kb-1，循环35次；68 ℃ 7 min。以1%琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行检测。将PCR阳性样本的纯化回收产物送金唯智生物科技(北京)有限公司测序。
使用DNAStar Lasergene进行全基因组拼接，以及序列同源性比对；使用MEGA X软件中的Maximum-Likelihood算法对APPV全基因组序列进行进化树分析，以CSFV基因组序列为outgroup对照，Bootstrap为500次重复。
2 结果 2.1 APPV检测情况利用所建立的套式RT-PCR方法，对2015—2017年，采自22个省市93个养殖场的285份猪血清进行检测。结果显示，APPV阳性样本为72份，阳性率为25.26%(95% CI=20.3%~30.75%)。93个猪场中有36个猪场的样品能检测到APPV E2基因，阳性率为38.71%(95% CI=28.8%~49.4%)。全国22个省市中的18个省市样品APPV为阳性，表明APPV在我国各地区已广泛流行(表 3)。
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表 3 各地区血清样本来源及检测结果统计 Table 3 Origin of the serum samples and testing results |
2015—2017年，猪场的APPV检测阳性率在32.35%~78.57%，且阳性率逐年上升，其中2017年猪场阳性率达78.57%(95% CI：49.2%~95.3%)，而样本阳性率为66.67%(95% CI=52.1%~79.2%)(表 4)，表明在此期间我国APPV的流行面越来越广。
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表 4 各年份血清样本来源及检测结果统计 Table 4 Positive rate of serum samples from different years |
以养殖场为单位，从36个阳性场共成功获得35条APPV E2基因序列，依据其采样时间和省份命名，序列信息已提交GenBank，登录号为MH307701-MH307735。利用DNAStar Lasergene软件中MegAlign程序，经Clustal W算法将所得E2序列与选取的GenBank参考毒株序列(表 5)进行核苷酸和推导氨基酸序列的比对分析，发现所获得的35个APPV E2基因之间核苷酸序列相似性为83.4%~100.0%，推导氨基酸序列相似性为90.5%~100.0%。与NL1 Farm1和000515等国外参考序列相比，核苷酸序列相似性为83.4%~93.9%，推导氨基酸序列相似性88.4%~93.6%；而与我国的大部分APPV临床毒株核苷酸序列相似性为80.1%~98.9%，推导氨基酸序列相似性为88.4%~99.2%。2018年，报道的4个来源于广东省的APPV E2基因序列与其他序列差异均较大，核苷酸序列相似性仅为80.1%~83.0%，推导氨基酸序列相似性仅为89.2%~92.9%。
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表 5 本研究中所用的APPV参考序列及与CHheb1701全基因组、Npro、Erns、E2、NS3和NS5B核苷酸序列相似性的比较 Table 5 Origin of reference sequences in this study, and homology analysis of CHheb1701 whole-genomic sequence, Npro, Erns, E2, NS3, and NS5B gene with reference sequences |
使用MEGA X软件中的Maximum-Likelihood算法对所测得的35个E2序列及26条参考序列进行多序列比对和遗传变异分析，构建基于APPV E2核苷酸序列的进化树(图 1)。结果表明，基于E2基因的变异情况可将我国流行株分为4个亚群(subgroup)，本研究所获得的大部分临床毒株序列(24株)均属于亚群1，该亚群还包括广西、江西的两个参考毒株和美国株000515。参考毒株中大部分国外毒株(8株)属于亚群2，该亚群还包括本研究所检测到的5个临床毒株。余下的6株测序临床毒株被划分至亚群3。亚群3及亚群4均由国内临床毒株构成，且亚群4均由2018年广东地区检测到的4株APPV组成。
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▲.国内参考序列；◆.国外参考序列 ▲. Chinese reference sequences; ◆.Reference sequences from other countries 图 1 基于APPV E2基因核苷酸序列的进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree based on E2 gene sequences |
以上结果表明，APPV已在我国广泛流行，且毒株间差异较大。
2.3 APPV全基因组序列测定及遗传变异分析2017年3月河北省某猪场出现新生仔猪先天震颤病例，取发病猪血清和脑组织为样品，成功扩增得到7条大小在1 516~2 319 bp的APPV基因片段，经序列测定和拼接得到全长11 556 nt的基因组序列，并将毒株命名为CHheb1701(GenBank登录号为MH307700)。应用MegAlign Clustal W算法分析CHheb1701与参考毒株(表 5)核苷酸序列同源性。结果表明，CHheb1701与26个APPV参考序列的核苷酸序列相似性为81.3%~98.6%，其中与广西临床株GX04/2017的核苷酸序列相似性最高，达98.6%；而与另一广西临床毒株GX01-2018相似度仅为88.0%，与广东临床毒株GD-LDCT1核苷酸相似度最低，仅为81.3%。选取Npro、Erns、E2、NS3和NS5B基因进行相似性比较，发现CHheb1701与参考毒株间各基因的相似性高低与全基因组相似性趋势一致，其中，E2基因的相似性在81.1%~98.9%，而具有RNA聚合酶(RdRP)功能的NS5B的相似性为81.1%~98.8%，该数据进一步证明APPV具有高度变异性。
应用MEGA X软件中的Maximum-Likelihood算法对CHheb1701和APPV参考序列的全基因组核苷酸序列进行遗传变异分析，绘制了进化树(图 2)，其表明当前全球APPV流行毒株可分为2个大的分支，其中CHheb1701与所有国外报道毒株均属于同一个大的分支，在该分支内CHheb1701与广西毒株GX04/2017亲缘关系最近，并与美国2014年毒株000515聚为一簇；而第二个大的分支内毒株均来自我国广东省。该数据再次提示，我国当前流行的APPV毒株可能具有多个来源。
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▲.本研究所测得的APPV毒株CHheb1701 ▲. APPV strain CHheb1701 obtained in this study 图 2 基于猪非典型瘟病毒全基因组序列构建的进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree based on the full-length genomic sequences of atypical porcine pestiviruses |
APPV感染可以导致仔猪先天性震颤，严重阻碍仔猪采食母乳，引起发病猪场仔猪断奶重下降以及死淘率增加[3-5]。自2015年美国首次发现该病原以来，其感染在亚洲、北美、南美和欧洲均有报道[2]，我国也于2016年首次报道该病[6]，但前期研究所述毒株大都来自南方局部地区，目前对于全国不同地区不同年份的毒株组特征和变异情况尚无系统性调查，因此，对2015—2017年收集自全国不同省份的血清样本进行了APPV回溯性调查，并结合近年国内外发表的毒株序列，以解析我国不同时间和地区APPV毒株的基因组特征和遗传变异情况，该研究对于阐明病毒的流行和遗传变异规律具有重要意义。
通常检测样本的阳性率在一定程度上能反映猪群中的病原感染和流行情况，但前期报道中APPV的检测阳性率在不同研究团队间存在较大差异。本研究血清样本阳性检出率为25.26%，远高于早期Postel等[7]及Yuan等[8]所报道的5%和5.2%，其差异可能源于多个原因，首先，检测方法敏感性可能存在差异，本研究所建立套式PCR检测方法灵敏度高于单轮PCR，试验中多份样品仅在第2轮PCR中才被检出；其次，由于APPV基因组变异较大，早期设计引物参考毒株有限，可能无法有效覆盖到所有APPV的基因序列，影响了PCR检出率[9]；再者，检测样品来源差异也可影响样品的阳性率，Muñoz-González等[10]于1997—2016年，对西班牙某出现过先天性震颤的临床症状的农场进行APPV的回顾性分子流行病学研究中发现，APPV的样本阳性率为13.9%(89/642, 95% CI=11.3%~16.8%)，其中，1周龄仔猪样本的APPV阳性率高达33.5%(54/161, 95% CI=26.3%~41.4%)，而大日龄猪样品中只有少量能检测到APPV基因；最后，本研究所选取血清多来自猪场送检样品，非健康猪群送检概率大于健康猪群，也可能导致样品阳性率与前期报道存在差异。虽然本研究并未能获得所检样品对应猪的免疫背景、健康状况和日龄等信息，尚不能完整解析该病在我国的三间分布规律，但样品来源覆盖了全国大部分养猪省份，时间跨度覆盖2015—2017年，其结果可确切证实该病已在我国广泛流行。
APPV具有广泛的毒株变异性，与猪瘟病毒相似，E2基因是对其进行遗传变异分析的重要靶标基因。本研究对比了61条APPV的E2基因氨基酸序列(35条测序结果以及26条参考序列)，结果发现不同APPV毒株之间E2基因序列相似性差异较大，其变异位点主要集中在第3位(I/H/Y)、11位(V/I)、48位(M/V)、52位(E/K/D)、54位(V/L)、55位(S/L)、71位(R/Q)、73位(I/A/T)、98位(T/M)、140位(D/E)氨基酸残基，其中第3位、55位及98位氨基酸的突变可引起极性变化，第52位和71位突变则可导致氨基酸电荷的变化，同时E2的其他位点也存在个别突变，但由于APPV的E2蛋白研究尚少，其是否也能与受体结合，是否存在中和表位仍然未知，这些突变位点是否与宿主选择压力或与免疫逃逸相关尚不清楚。
为追踪流行毒株来源、传播和遗传变异规律，对APPV毒株进行了基于E2基因的进化树分析，并按毒株来源省份进行归类，可发现国内早期报道毒株绝大多数来自广东、广西，且多为亚群2、亚群3和亚群4毒株；但亚群1所属毒株在我国数量最多、分布最广，尤其在北方省份检出比例高于其他亚群，且本研究中2017年检出的临床毒株均属于该亚群，其是否会成为我国优势流行株，仍有待后续监测。亚群4毒株组成较为特别，均为2018年广东省临床毒株。有趣的是，虽然4株病毒的E2基因序列单独成为一亚群，但基于全基因组的变异分析可发现，4毒株与广东省其他早期毒株亲缘关系较近，共同形成一个大的独立分支，故推测该亚群4毒株应该来自广东省原有毒株，在E2基因处发生了突变从而演化而来，而非新毒株的直接传入，该数据进一步证实了APPV在田间流行过程中的易变异性。
4 结论通过对2015—2017年收集于我国22个省(自治区、直辖市)93个猪场的血清样品进行APPV回溯检测以及E2基因和全基因组的遗传变异分析，证实APPV在我国的广泛流行性以及毒株的易变异性。其结果丰富了我国APPV毒株的分布和基因组信息，为进一步揭示毒株的遗传变异规律提供了重要的科学依据，对指导该病的诊断、监测和预防具有重要意义。
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