小肠是应激反应的中心器官,也是营养物质消化吸收的主要场所,动物热应激时,全身的血液重新分配以维持机体散热功能,肠道最先缺血而又最晚得到恢复,如果动物肠道出现长时间的缺血缺氧,肠道将会产生各种炎症反应,导致肠黏膜严重损伤[1]。白藜芦醇(resveratrol, RES),化学名称3, 4’, 5-三羟基二苯乙烯,又名芪三酚,是一种非黄酮类多酚化合物,广泛存在于葡萄、松树、虎杖及花生等天然植物及果实中[2-3]。研究表明,白藜芦醇具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保护心血管和神经等作用[4-5]。Zhou等[6]报道,白藜芦醇在兔急性咽炎模型中,可降低TNF-α、IL-6的转录水平和NF-κB的磷酸化水平,缓解炎性反应。崔勇和与沈先敏[7]发现,白藜芦醇可降低LPS诱导的肾小管上皮细胞炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平,抑制炎性通路。Youn等[8]研究发现,在葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)模型中,口服白藜芦醇可以抑制NF-κB基因的活化,减少NF-κB下游促炎因子的释放,进而减轻炎症对肠道组织的刺激。然而,尚无研究评估白藜芦醇抵御山羊小肠上皮细胞热应激的抗炎作用功效。因此,本试验通过体外建立山羊小肠上皮细胞热应激炎性模型,应用白藜芦醇预处理,探究白藜芦醇对热应激造成的肠黏膜损伤的体外抗炎效果,以期为白藜芦醇修复肠黏膜损伤提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂白藜芦醇(Resveratrol,R5010-100mg,HPLC≥ 99%)购自美国Sigma公司;CCK-8试剂盒(碧云天,中国上海);胎牛血清(FBS)、DMEM/F12粉末、胰岛素-转铁蛋白-添加剂(ITS-G)购自美国Gibco公司;山羊IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α、SOD、MDA、T-AOC和GSH-Px检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司;Eastp® Super总RNA试剂盒(Promega,美国),反转录试剂盒(ThermoScientific,美国),BioEasy Master Mix(SYBR Green)定量PCR试剂盒购自杭州博日科技有限公司。
1.2 细胞培养原代山羊小肠上皮细胞(goat small intestinal epithelial cells,GIE细胞)由扬州大学动物科技学院赵国琦教授惠赠,培养于含10%FBS、1%青-链霉素、1% ITS-G的DMEM/F12培养液中,置于37 ℃、5% CO2的无菌培养箱内培养。取对数生长期的细胞用于试验。
1.3 CCK-8筛选白藜芦醇安全作用浓度及热应激时间收集对数生长期的GIE细胞,调整细胞密度为5×104个·mL-1,96孔板每孔加入100 μL细胞悬液,37 ℃、5% CO2培养。待细胞融合率达到约80%时,弃去上清,PBS清洗2遍后,加入不同浓度的白藜芦醇培养液(0、1、5、15、30、60、120、240 μmol·L-1),每个浓度设5个平行孔。继续培养细胞24 h后弃去旧培养液,更换含10% CCK-8试剂的培养液继续培养2 h后,在酶标仪中于450 nm波长处测定各孔吸光度OD值。细胞相对存活率(%) = OD处理组 /OD37 ℃空白对照组 × 100。按照上述方法培养细胞,待细胞融合率达到约80%时,将细胞置于42 ℃、5% CO2培养箱,分别作用0、2、4、6、8、10、12 h后,用CCK-8法测定细胞活力。
1.4 GIE细胞热处理及分组采用生长良好的第4代GIE细胞用于试验,分为空白对照组(37 ℃)、热应激组(42 ℃)、42 ℃热应激加白藜芦醇组(5、15、30 μmol·L-1);加药预处理6 h后进行热应激处理6 h。每组设置3个复孔。
1.5 T-AOC、SOD、GSH-Px活性和MDA含量测定细胞培养及加药热应激处理后,收集各孔细胞,细胞破碎仪破碎,得到待测样本。按照试剂盒说明书分别测定总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。
1.6 ELISA检测IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α含量细胞培养及加药热应激处理后,收集各孔细胞上清液,3 000 r·min-1离心后取上清,按照ELISA试剂盒说明书检测细胞上清中IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量。
1.7 RT-PCR检测IL-1β、TNF-α、IL-8、HSP70和NF-κB的基因转录1.7.1 GIE细胞总RNA的提取和cDNA合成 细胞培养及加药热应激处理后,收集各孔细胞,PBS清洗两遍,按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA,用Micro-Spectrophotometer核酸定量仪(K5800,上海DRAWELL科学仪器有限公司)测定总RNA的浓度和纯度,用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。按照反转录试剂盒说明书操作步骤将提取的总RNA反转录成cDNA,于-20 ℃冰箱保存。
1.7.2 引物设计与合成 根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的山羊目的基因HSP70、IL-1β、TNF-α、IL-8、NF-κB和内参基因β-actin的mRNA序列,使用软件Premier 5.0设计特异性引物,委托西安擎科泽西生物技术有限公司合成,引物序列见表 1。
1.7.3 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR反应体系20 μL:2×SYBR GreenMix 10 μL,cDNA 1 μL,上、下游引物各0.4 μL,RNase Free ddH2O 8.2 μL。PCR扩增条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。熔解条件:95 ℃ 1 min,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s,循环1次。IL-1β、TNF-α、IL-8、NF-κB和β-actin的mRNA检测结果由LightCycler 96定量仪给出。以β-actin为内参基因,各目的基因转录强度以基因绝对拷贝数/β-actin绝对拷贝数表示,通过熔解曲线判断是否有非特异性扩增产物或引物二聚体出现,采用2-△△Ct法进行相对定量。
1.8 数据分析利用SPSS 25.0软件对所得数据进行组间单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05和P<0.01分别表示统计学检验差异显著和差异极显著。本研究所有直方图均由GraphPad Prism 6软件做成。
2 结果 2.1 白藜芦醇安全作用浓度及热应激时间筛选不同浓度白藜芦醇作用GIE细胞24 h后,细胞活力如图 1所示。与对照组相比,白藜芦醇含量在0~60 μmol·L-1范围内的各组细胞活力变化不显著,而120和240 μmol·L-1白藜芦醇组细胞活力极显著下降(P<0.01),结果证明,白藜芦醇浓度在0~60 μmol·L-1时对细胞无明显毒性作用,本试验最终选择5、15、30 μmol·L-1为白藜芦醇药物作用浓度。
GIE细胞热应激0、2、4、6、8、10、12 h的细胞活力如图 2所示。与对照组相比,热应激2和4 h细胞活力变化不显著,随时间延长,细胞活力在6 h后极显著下降(P<0.01),热应激6 h时细胞存活率在78%左右,最终选择42 ℃热应激6 h为本试验模型。
如图 3所示,与空白对照组相比,热应激组中T-AOC、SOD、GSH-Px的活力极显著降低(P<0.01),MDA含量极显著升高(P<0.01)。与热应激组相比,白藜芦醇组中T-AOC、SOD、GSH-Px的活力极显著升高(P<0.01),MDA含量极显著下降(P<0.01)。
如图 4所示,与空白对照组相比,热应激组中IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量极显著升高(P<0.01)。与热应激组相比,白藜芦醇组中IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量均极显著降低(P<0.01)。
如图 5所示,与空白对照组相比,热应激组中HSP70基因表达量极显著升高(P<0.01)。与热应激组相比,白藜芦醇组中HSP70基因表达量极显著降低(P<0.01)。
如图 6所示,与空白对照组相比,热应激组中IL-1β、TNF-α、IL-8、NF-κB的基因相对转录量极显著升高(P<0.01)。与热应激组相比,白藜芦醇组中IL-1β、TNF-α、IL-8、NF-κB的基因相对转录量均极显著降低(P<0.01),且随着白藜芦醇的浓度增大,抑制作用相应增强。
白藜芦醇药理活性广泛。有研究表明,白藜芦醇可以抑制前列腺合成的环氧化酶(COX),减少白三烯(LT)、血栓素等(TXB2)生成[9];抑制LPS和TNF-α刺激后内皮黏附蛋白表达[10];增加嗜中性白细胞中cAMP水平和抗炎功能;抑制细菌和真菌生长[11]。白藜芦醇的抗炎作用在不同动物模型细胞中都已得到验证。Bereswill等[12]研究发现,白藜芦醇可以显著增加致病小鼠回肠黏膜中上皮细胞和T细胞的数目,调节机体的免疫机能。Ravagnan等[13]报道,白藜芦醇在人角质细胞系(HaCat)热应激模型中能有效抑制其炎症反应并调节e-防御因子2(HBD-2)的表达以增强细胞的保护效应。因此,抗炎作用是白藜芦醇药理活性的重要功能之一。
小肠是动物机体吸收营养物质的主要场所,也是免疫系统的重要组成部分,对于动物的生长发育至关重要。GIE细胞属于未分化的上皮细胞,来源于新生正常山羊的小肠,同时具有隐窝样上皮细胞的特征,在一定条件可分化为成熟的小肠上皮细胞。当受到应激(高温、低温、缺氧和紫外线等)时[14],组织细胞会快速产生一类高度保守的热休克蛋白来抵御应激对细胞的损伤[15]。有研究表明,HSP70是热应激反应中保护细胞的蛋白质,主要起提高细胞耐受力、参与机体免疫和分子伴侣的功能[16]。Xu等[17]发现,42 ℃下热应激可诱导IEC-6细胞HSP70基因表达量极显著升高。Shimizu等[18]研究发现,细胞内HSP70与核因子抑制蛋白α(IκBα)相结合,抑制NF-κB通路激活,从而抑制TNF-α、IL-1β等促炎症因子转录,提高细胞对炎症因子的耐受力。本研究利用热应激诱导山羊小肠上皮细胞产生炎性反应,建立了热应激炎性模型。结果显示,GIE细胞在42 ℃培养箱热应激6 h后,IL-1β、TNF-α、IL-2和IFN-γ的分泌量和HSP70基因表达量均极显著高于空白对照组(P<0.01),表明体外热应激炎症模型建立成功。Jin等[19]研究发现,白藜芦醇浓度在0~50 μmol·L-1时对奶牛乳腺上皮细胞无显著细胞毒性作用。本试验结果显示,白藜芦醇浓度在0~60 μmol·L-1时对GIE细胞无显著细胞毒性作用,最终选择白藜芦醇处理浓度为5、15、30 μmol·L-1。
热应激主要是通过破坏动物机体内氧化与抗氧化系统平衡使机体产生氧化应激,造成机体免疫力下降,引发炎症反应。自由基过量产生导致脂质过氧化,最终造成细胞损伤[20]。MDA是脂质过氧化的终产物[21],T-AOC可反映机体防御体系的抗氧化能力,二者是衡量机体抗氧化防御系统功能的综合性指标[15]。SOD是机体内对抗自由基的第一道防线,GSH-Px可以清除超氧阴离子自由基,二者对机体的氧化与抗氧化平衡起关键作用[22]。Li等[23]报道,43 ℃热应激会显著降低SOD、GSH-Px等抗氧物酶活力,增加MDA含量。Das[24]研究发现,在热应激大鼠基础日粮中添加白藜芦醇,会显著降低肝细胞MDA含量和增加T-AOC、SOD、GSH-Px的活力。本研究表明,白藜芦醇可显著增加热应激炎性模型中T-AOC、SOD、GSH-Px的活力,降低MDA含量,从而提高机体抗氧化损伤能力,调控机体的免疫应答水平。
在热应激作用下,细胞因子及炎症介质会过度分泌,引发机体组织损伤,甚至导致器官萎缩、死亡。TNF-α是动物机体应激反应中产生最早且作用最重要的炎症细胞因子,其分泌能诱导IL-1β等细胞因子的释放[25]。IL-1β能通过增强细胞因子(IL-2及其受体)表达共活化T细胞,在免疫应答和组织修复中起重要作用[26]。IL-2又称T细胞生长因子,作为启动炎症反应的关键细胞因子,促进CTL细胞(尤其是IFN-γ和TNF-α)、Th细胞及NK细胞释放细胞因子[27]。IFN-γ主要由CD4+T细胞、NK细胞分泌产生,能激活Th 1细胞促进IL-2释放并诱导单核细胞、巨噬细胞等MHCⅡ类抗原的表达[28]。Li等[23]研究发现,葡萄籽提取物可在一定温度范围内降低热应激诱导的肉牛空肠上皮细胞中IL-1β和TNF-α的分泌。王舰等[29]报道,双歧杆菌DNA(主要成分为LPS)诱导小鼠肠上皮内淋巴细胞的IL-2和IFN-γ分泌极显著增加。本研究表明,热应激刺激可以显著增加GIE细胞IL-1β、TNF-α、IL-2和IFN-γ的分泌,而白藜芦醇显著抑制热应激炎性模型中IL-1β、TNF-α、IL-2和IFN-γ的分泌,这些结果表明,白藜芦醇对热应激诱导的GIE细胞炎性反应具有显著的抑制作用。
肠黏膜是动物机体抵抗病原微生物进入机体的第一道防线[30]。当哺乳动物遭受热应激时,肠黏膜防御屏障被破坏,病原微生物(如LPS)被免疫系统感知,发生免疫应答炎症反应,导致肠道炎症发生。NF-κB是先天免疫应答反应的主要核转录因子[31],可介导IL-8、TNF-α、IL-1β等多种炎性因子的转录和表达[32-33]。同时,炎性细胞因子也可活化NF-κB,来引起炎症反应,导致机体组织炎性损伤[34-35]。因此,NF-κB信号通路中的主要分子都是重要的抗炎药物靶点。Shakibaei等[36]研究表明, 白藜芦醇可通过抑制人关节软骨细胞的IκB的磷酸化和降解, 剂量依赖性抑制IL-1β诱导的NF-κB的活化。Gonzales和Orlando[37]研究发现, 白藜芦醇可通过抑制脂肪细胞中IκB的降解和NF-κB的核转位来抑制NF-κB信号转导, 从而减少TNF-α、IL-8等炎性因子转录和表达。本试验结果显示,白藜芦醇作用于GIE细胞后均能显著抑制热应激诱导的IL-1β、TNF-α、IL-8和NF-κB基因的表达,且表现出一定的剂量依赖性,表明白藜芦醇对热应激诱导的山羊小肠上皮细胞炎性反应的抑制作用可能与调节NF-κB信号通路的活化相关,但具体作用还有待进一步研究。
4 结论白藜芦醇可降低IL-1β、TNF-α、IL-8、HSP70和NF-κB的基因转录水平,促进抗氧化酶活力,抑制热应激诱导的山羊小肠上皮细胞中IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌。因此,白藜芦醇通过调节细胞因子的分泌发挥抗炎活性,其抑炎作用可能与抑制NF-κB信号通路相关。
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