2. 新疆畜牧科学院畜牧研究所, 乌鲁木齐, 830026
, TENG Xiaoxiao1, YANG Ningzhi1, LI Ting1, CHEN Zhuo1, Eskandar·eslam1, WANG Zhi1, QI Laifang1, LIU Jiajia2, YANG Huiguo2, ZHAO Hongqiong1
, YAO Gang1
2. Institute of Animal Science, Xinjiang Academy of Animal Sciences, Urumqi 830026, China
羔羊腹泻是一种常发生于新生和断奶阶段羔羊的消化道疾病。羔羊腹泻常导致羔羊生长迟滞甚至死亡，给养殖者带来很大经济损失。越来越多的研究证明，人和动物的肠道菌群在保障宿主正常生理功能、营养代谢、免疫防御、抵抗疾病等方面发挥着重要作用[1-2]。宿主肠道微生态环境紊乱与腹泻关系密切[3-4]。Round和Palm[5]认为，胃肠菌群生物多样性的降低与疾病的易感性之间密切相关，使用抗生素会使胃肠菌群多样性降低，导致免疫功能失调从而诱发腹泻等疾病。粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是一种将健康动物的粪便菌群移植到患病动物胃肠道内，重建其肠道正常菌群结构，以达到治疗肠道及肠道外疾病的方法[6]。FMT在治疗艰难梭菌引起的顽固性腹泻中的良好效果以及在肿瘤疾病辅助治疗中的良好前景，表明FMT可能成为人类临床某些疾病的主流治疗方法[7-8]。Niederwerder[9]在对包括狗、猫、马、鱼类以及家禽等在内的十几种动物利用FMT治疗疾病，并取得良好效果的基础上，总结认为FMT具有成本小，应用范围广等特点，在治疗或预防其他疾病(包括胃肠道以外的疾病)方面也具有良好的前景。FMT对于改善肠道稳态和宿主健康具有潜在优势[9-10]。FMT在治疗动物消化道腹泻相关疾病中已有一些临床研究报道，如Hensley-McBain等[11]采用FMT对猴免疫缺陷病毒相关疾病(SIV)感染进行了防治研究，另外FMT也被应用于犬细小病毒腹泻以及马结肠炎的治疗中，并获得良好效果[12-14]。然而，FMT在牛羊等反刍家畜疾病防治中的应用研究鲜有报道，因此，本试验拟采用FMT对吮乳期临床散发的羔羊腹泻症状进行治疗，并与不同抗生素药物治疗进行对比，初步评估FMT在羔羊腹泻治疗中的效果，为后续深入开展FMT在畜禽疾病防控中的应用提供经验。
1 材料与方法 1.1 试验动物从某商品湖羊舍饲养殖场选取临床散发的、具有明显腹泻症状的吮乳羔羊60只(公母各半)，以及健康羔羊10只(公母各半)，平均日龄为(24±2) d，体重(6.12±1.01) kg。
1.2 主要试剂与仪器生理盐水购自西安京西双鹤药业有限公司；兽用庆大霉素注射液购自山西省芮城科龙兽药有限公司；恩诺沙星注射液购自山东天振药业有限公司；酶联免疫试剂盒(基因美)购自北京全式金生物技术有限公司。
DL-CJ-1NDII超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，LDZF-75KB高压灭菌锅(购自上海申安医疗器械厂)，XFA6030全自动血液细胞分析仪(深圳市普康电子有限公司)，AB-1020生化分析仪(美国爱德士公司)，微量高速离心机(国产TG16W)。
1.3 粪菌液的制备与移植正常粪便供体的选择与采样：选取3月龄左右健康断奶羔羊6只作为粪菌供体羊用于制备粪菌液。供体羊临床检查无腹泻症状和抗生素使用史，粪便颗粒成型，无腹泻相关病原阳性，生理生化指标测定值在正常参考值范围。采样人员戴PE手套，刺激羔羊肛门处待其有排便反应，手指插入肛门取粪样，随即装于灭菌的50 mL离心管中备用。
粪菌液制备：采用Mullen等[13]报道的“粗滤加离心富集法”并结合青年羊粪便特点，制备粪菌液。在超净工作台中，取健康羊新鲜粪便50~60 g于500 mL灭菌容器中，捣碎后按照1:10加生理盐水稀释，涡旋混匀成匀浆状。用双层无菌纱布覆盖反复过滤3~4次，最后倒入无菌离心管中，得到棕黄色混浊液体。在粗滤法的基础上6 000 r·min-1离心15 min，弃上清并加80 mL左右生理盐水重悬沉淀，制备成约120 mL浓缩粪菌悬浮液，经分光光度计测量浓度为33%~40%。通过过滤和离心，去除粪便中大的颗粒和可溶性杂质，收集离心得到的悬液用于移植，备份进行菌群成分测定。
粪菌移植方法与频次：粪菌移植采用阿姆斯特丹方案[15]，在移植前一天灌服奥美拉唑2 mg，抑制胃酸分泌，降低胃酸度以利于菌群定植。腹泻羔羊采用20 mL注射器套输液管口腔灌注粪菌液，每天早晚两次灌注，根据腹泻羔羊体重，每次灌注粪菌液剂量为3 mL·kg-1，粪菌移植持续时间一般为(3±1) d。
1.4 试验动物分组根据腹泻评定标准[9]并观察肛门周围是否黏连粪便判定腹泻状况，其中轻微腹泻：软粪、能成形；中度腹泻：稠状、不成形、粪水未分离；重度腹泻：液状、不成形、粪水分离。当粪便评定为中度以上腹泻时，认为羔羊发生腹泻，据此选出体重相近的60只腹泻羔羊，以及10只健康羔羊。试验期间每天观察腹泻程度并记录。健康对照组无处理，正常饲养；腹泻对照组灌服与粪菌液等量生理盐水；粪菌移植组(单次剂量：3 mL·kg-1，时间为(3±1) d)；抗生素治疗Ⅰ组(单次剂量：0.2 mL·kg-1，肌肉注射庆大霉素)；抗生素治疗Ⅱ组(单次剂量：0.05 mL·kg-1肌注恩诺沙星)；庆大霉素+粪菌移植治疗组(庆大霉素作为抗生素干预试剂，用药2 d后停1 d，然后再用粪菌液治疗)；恩诺沙星+粪菌移植治疗组(恩诺沙星作为抗生素干预试剂，用药2 d后停1 d，然后再用粪菌液治疗)。上述试验处理均每天进行两次。
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表 1 腹泻羔羊分组与处理(n=10) Table 1 Grouping and treatment of diarrhea lambs(n=10) |
1.5.1 治愈用时(d) 腹泻羔羊粪便由最初的稀粪到正常的颗粒粪(图 1)，患羊体温达到正常，腹泻不再复发，即为治愈，记录治愈天数。统计死亡羔羊数量。
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图 1 腹泻羔羊的粪便(A)和治愈后羔羊粪便(B) Fig. 1 The diarrheic feces (A) and feces turn normal (B) after treatment |
1.5.2 生长性能和生理常值(TPR)测定 试验开始和治愈后分别称量羔羊体重，试验结束后计算平均日增重(ADG)；试验期每天早晨在羔羊空腹安静状态下测量腹泻羔羊直肠温度。观察胸腹部起伏的次数，计数呼吸频率。触诊羔羊颈部颌外动脉或后肢股内侧股动脉记录脉搏。
1.5.3 血液生理生化指标测定 分别采集健康羔羊、腹泻羔羊和治愈后羔羊的血液。早上8点左右空腹颈静脉采血两份各5 mL于抗凝管和非抗凝管中，抗凝血用于血常规指标检测，主要包括：红细胞数量(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、白细胞数量(WBC)、中性粒细胞数量(GRAN)、中间细胞数量(Mid)、淋巴细胞数量(LYM)、血小板数量(PLT)等。非抗凝血静置30 min后3 000 r·min-1离心15 min分离血清，检测生化指标包括：白蛋白(ALB)、丙氨酸转移酶(ALT)、肌酐(CREA)、钙离子(Ca2+)、胆固醇(CHOL)、总蛋白(TP)、球蛋白(GLOB)、碱性磷酸酶(ALKP)等。
1.5.4 细胞因子检测 采集腹泻和不同治疗处理后羔羊全血，制备血清，采用ELISA方法检测主要炎性相关因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-8。操作按照检测试剂盒要求进行。
1.6 数据处理与分析数据采用“平均值±标准差(mean±SD)”表示。采用SPSS 23.0统计软件对腹泻对照组和各治疗组之间进行单因素方差分析(one-way-ANOVA)，采用Dunnett’s multiple comparisons test比较各组与腹泻对照组的差异。P＜0.05表示差异显著, P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 羔羊增重、生理常值(TPR)变化及治疗效果试验期间FMT受体羊无不适反应。由图 2可知，经过15 d试验，SC组羔羊分别在治疗第2、5、7天各死亡1只，共死亡3只；ENR组羔羊在第6天死亡1只，其余组未发生死亡，组间差异显著(P＜0.05)。SC组与HC组羔羊相比，平均日增重显著降低(P＜0.05)。与SC组羔羊((8±2.45) d)相比，FMT((4.5±1.77) d)、ENR((4.13±1.64) d)、ENR+FMT((4.88±0.83) d)和GM((5.17± 1.84) d)组均显著降低了治愈天数(P＜0.05)，而GM+FMT((6.86±1.95) d)组与SC组差异不显著。采用5种治疗方法治疗腹泻羔羊后，ENR组羔羊日增重显著高于SC组羔羊(P＜0.05)。采用5种治疗方法治疗羔羊TPR无显著差异(P＞0.05)。
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*表示P＜0.05，**和***均表示P＜0.01。下同 * indicates P < 0.05, **and *** indicate P < 0.01. The same as below 图 2 腹泻羔羊5种方法治疗后日增重(A)、治愈天数(B)、存活数(C)及TPR(D、E、F) Fig. 2 ADG (A), healing day (B), survival of lambs (C) and TPR of diarrheic lambs (D, E, F) after different anti-diarrheic treatments |
分别采集健康羔羊、腹泻羔羊和治愈后羔羊的血液，进行血液生理生化指标的测定。由图 3可知，与HC组羔羊相比，SC组羔羊RBC和HGB均显著低于HC组羔羊(P＜0.05)，而MCHC显著高于HC组羔羊(P＜0.05)。与SC组羔羊相比，经5种方法治疗后，FMT治疗可显著提升腹泻羔羊血液中HGB含量，GM+FMT治疗组羔羊MCV显著降低(P＜0.01)，而ENR和GM+FMT组羔羊MCH显著升高、MCHC显著降低(P＜0.01)。与HC组相比，SC组羔羊LYM比例显著降低(P＜0.05)。与SC组羔羊相比，经5种方法治疗后，FMT和GM+FMT方法显著提高了血液LYM数量(P＜0.05，P＜0.01)，而GM治疗方法显著提高了GRAM(P＜0.05)。
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图 3 不同治疗方式对腹泻羔羊血液生理指标的影响 Fig. 3 Effects of different anti-diarrheic treatment on blood physiological indexes of diarrheic lambs |
血液生化指标变化如图 4。与HC组羔羊相比，腹泻羔羊CREA含量显著降低(P＜0.01)。与SC组羔羊相比，经5种方法治疗后，除了GM治疗组羔羊，FMT、ENR、GM+FMT和ENR+FMT治疗组羔羊CREA含量均显著升高(P＜0.01)。ENR和GM+FMT组羔羊的ALKP较SC组显著提高(P＜0.01)。
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图 4 不同治疗方式对腹泻羔羊血液生化指标的影响 Fig. 4 Eflects of different anti-diarrheic treatment on blood biochemical indicators of diarrheic lambs |
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图 5 不同治疗方式对腹泻羔羊炎性因子的影响 Fig. 5 Effects of different anti-diarrheic treatment on inflammatory factors of diarrheic lambs |
采集健康、腹泻和不同治疗处理后羔羊全血，制备血清，采用ELISA方法检测主要炎性相关因子。SC组羔羊与HC组羔羊相比，各种炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6和IL-8均显著升高(P＜0.01)。与SC组羔羊相比，FMT、ENR和GM+FMT治疗后，各种促炎因子均下降到健康组羔羊水平。GM治疗后羔羊IL-8、IL-6和IL-2水平未显著下降到HC组羔羊水平。ENR+FMT治疗后羔羊的IL-6和IL-2水平未显著下降到HC组羔羊水平。
3 讨论本试验中的腹泻羔羊发病呈散发特点，无发热现象，无群发流行现象发生。腹泻羔羊也未检出常见致病微生物病原，初步临床诊断为新生期营养不良、环境应激等因素所致的腹泻，但不排除有细菌和寄生虫感染现象。本试验发现，SC组羔羊平均日增重显著下降，RBC、HGB、淋巴细胞比例和CREA水平下降，而MCHC显著增高。这些结果与Koçkaya和Özșensoy[16]在因球虫感染导致腹泻的吮乳羔羊中发现RBC、HGB、HCT显著低于健康羔羊，而MCV显著升高的结果相一致。本试验发现，腹泻导致的主要血液生理生化变化经5种治疗方式治疗后均接近或与健康组羔羊水平趋于一致。
本试验所测定的TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6和IL-8共5种促炎因子在腹泻羔羊中均显著高于健康羔羊。Sakai等[17]在腹泻小鼠试验中也发现，腹泻小鼠肠道TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-22的mRNA水平均显著升高。Jiang等[18]发现，患轮状病毒腹泻儿童的IL-6、IL-10和IFN-γ显著高于健康对照组儿童，与本试验所测定的结果一致，表明腹泻过程中促炎因子升高与炎症的发生密切相关[19]。经5种方法治疗后，促炎因子均有不同程度下降，其中FMT治疗对所测定的5种促炎因子均起到显著降低效果。
有关FMT在反刍家畜疾病防治中的应用研究鲜有报道，这可能与反刍动物消化道结构功能复杂、缺乏适合反刍动物使用的标准化粪菌液制备和移植程序、耐药性和传染病的传播风险以及其他不良表型性状的转移等因素有关[8, 20-21]。Pereira等[14]采用标准抗生素治疗法和抗生素+FMT进行比较，治疗幼犬感染细小病毒腹泻时，证明经治疗存活的犬中，抗生素+FMT方法较单纯抗生素方法(平均6 d)显著降低了治愈用时(平均3 d)。本试验结果除GM+FMT组外，其余4种治疗方法均可显著降低治疗用时，FMT治愈用时4.5 d，与Pereira等[14]研究结果相类似。Niederwerder[9]预先给吮乳仔猪进行FMT移植，然后再用PCV-2和PRRSV共感染吮乳仔猪后发现，接受FMT的吮乳仔猪发生圆环病毒相关疾病的发病率和死亡率显著低于未接受FMT移植的吮乳仔猪。Furmanski和Mor[12]通过多次FMT治疗成功治愈了一只因患有溃疡性结肠炎反复腹泻的成年阿比西尼亚猫，认为FMT是一种安全有效的新方法。
已有大量报道证明，肠道菌群的改变对人和动物宿主健康与疾病的影响[1, 22-23]。Hu等[24]用具有典型抗断奶腹泻特点的中国地方小型猪，即早期断奶后8 d的从江香猪(CM)作为供体制备粪菌移植液，按低、中、高剂量口服移植到10~18日龄的兰德瑞斯和约克夏杂交仔猪(LY)，接受低剂量粪菌移植的LY仔猪断奶后的腹泻率和腹泻指数显著低于其生理盐水对照组，其肠道菌群结构发生显著变化，特别是肠道菌群β-多样性由原来的LY分布向CM仔猪分布迁移，又进一步证明加氏乳杆菌LA39和Lactobacillus frumenti是介导LY仔猪产生抗断奶腹泻的优势物种，其抗腹泻机理主要是依赖细菌分泌的一种细菌素环肽气溶蛋白A(circular peptide gassericin A)和肠道上皮细胞特异受体结合，从而增强了小肠上皮细胞的吸收功能，降低了分泌功能[25]。另外，Ferrecchia和Hobbs[26]尝试了在非人灵长类动物身上口服使用FMT治疗腹泻。这些研究中的动物物种、年龄、性别、导致腹泻的原因以及移植操作方法等方面与我们的试验不近相同，但FMT在治疗腹泻中均显示出一致的有效性。
4 结论综上所述，本次试验初步证明了FMT方法治疗羔羊腹泻的效果。FMT方法具有治愈时间短，成本低廉等优点，有望作为一种抗生素替代方法应用于家畜疾病防治实践，而反刍动物粪菌液制备和移植程序标准化以及腹泻机理和肠道菌群变化方面值得进一步深入研究。
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