, TIAN Yaqing, HAO Haisheng, ZOU Huiying, ZHAO Shanjiang, PANG Yunwei, ZHAO Xueming, ZHU Huabin, DU Weihua
在雌性哺乳动物的卵巢中，仅有少量卵泡能发育成熟和排卵(0.1%~10%)，大部分卵泡将发生闭锁和退化，造成卵泡资源的较大浪费[1]；家畜卵泡发育成熟和排卵也是母畜繁殖力的重要决定因素。卵丘细胞和颗粒细胞作为卵泡内的体细胞，其增殖和凋亡对卵泡及其中卵母细胞的发育有重要影响，尤其是卵丘细胞，其与卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)，并通过缝隙连接进行物质交换，进而调控卵母细胞的成熟，为早期胚胎的发育提供物质贮备[2-3]。因此，以卵丘细胞为模型，研究其表观遗传修饰机制，揭示其对胚胎发育的调控作用，将促进动物胚胎工程和畜牧业的发展。
细胞在生长和分化过程中存在广泛的表观遗传修饰，DNA 甲基化和组蛋白修饰是主要的调控方式；其中，组蛋白甲基化和乙酰化修饰在调节基因组活性及转录中起着重要的作用[4]，组蛋白 H3 第4和第36位赖氨酸(histone H3 lysine 4，H3K4 和 H3K36)的三甲基化与基因激活有关，而 H3K27 的三甲基化与基因抑制有关[5]。缺失、小的、同源异形1(absent, small, or homeotic 1-like，ASH1L)是组蛋白赖氨酸甲基转移酶，首次被发现于果蝇中[6]，ASH1L 包含 SET(su[var]3-9，enhancer-of-zeste，trithorax)结构域，具有甲基转移酶活性。在哺乳动物中，ASH1L 可特异性甲基化 H3K36[7]，并通过干扰核小体上多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的活性来抑制 H3K27 甲基化，从而促进基因的表达[8]。在 Ash1 标记的基因中，30%的基因被 H3K27me2/3 共同标记[9-10]；组蛋白 H3 的质谱分析表明，K27 和 K36 甲基化通常不存在于同一分子上[11]，因此，这些标记以“不对称”修饰形式存在于相同和/或相邻的核小体上。
目前，ASH1L 的相关研究主要集中于人和小鼠，在大型家畜中尚未见报道。本研究以牛卵丘细胞为对象，分析 ASH1L 甲基转移酶的 RNA 和蛋白水平表达情况；研究干扰 Ash1L 基因对凋亡相关基因和 PRC2 蛋白组分基因的表达水平及卵丘细胞甲基化状态的影响，为进一步研究 ASH1L 对家畜胚胎的调控作用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料本研究所用试剂无特殊说明均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；DEME/Ham’s F12(DF12)培养基、0.25% Trypsin和DPBS液均购自Invitrogen公司；H3K36me1、H3K36me2和H3K36me3兔多克隆抗体均购自Abcam公司；Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG购自Cell Signaling Technology公司；ASH1L甲基转移酶抗体购自Merck Millipore公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自北京中杉金桥公司；高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司。
1.2 牛卵母细胞的体外成熟屠宰场采集健康牛卵巢，30 ℃生理盐水洗涤后2 h内运回实验室。用18号针头抽取直径为2~6 mm卵泡的卵泡液，体视显微镜下挑选带有3层以上卵丘细胞的COCs，用成熟液(含10% FBS、0.01 IU·mL-1 FSH、1 IU·mL-1 LH、1 μg·mL-1 E2、10 μg·mL-1肝素、40 ng·mL-1 IGF、50 ng·mL-1 EGF的TCM 199培养液)洗涤后，于成熟液中38.5 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养22 h。
1.3 牛卵丘细胞培养用0.1%透明质酸酶处理体外成熟培养22 h的COCs，轻轻吹打2 min后加入含10%血清的TCM199液终止消化。将牛卵丘细胞悬液收集到离心管中，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，用含1%青链霉素的PBS液洗涤离心两次。最后用含10% FBS和1%青链霉素的DF12培养基悬浮细胞，混匀后移入六孔板，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
1.4 Ash1L siRNAs 的设计与合成按照NCBI提供的牛 Ash1L 基因序列(登录号：NM_001192743)，根据 siRNA 设计原则，设计3对 siRNAs 及1对阴性对照 siRNA(negative control，NC)，由上海吉玛基因股份有限公司合成(表 1)。
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表 1 针对牛 Ash1L 基因的 siRNAs 序列 Table 1 siRNAs equences targeting bovine Ash1L gene |
38 ℃水浴解冻常规冷冻精液于6 mL洗精液(含4 μg·mL-1 BSA、10 mmol·L-1咖啡因的BO液)中，1 800 r·min-1离心两次，每次8 min。用洗精液稀释精子至2×106个·mL-1，取50 μL精子悬浮液加入50 μL受精滴(含4 mg·mL-1 BSA的BO液)中，并移入15枚体外成熟培养22 h的COCs，于38.5 ℃、100%湿度条件下培养。受精后8 h脱去卵丘细胞，受精后10 h挑选1-细胞期受精卵，分为对照(非注射胚胎)、NC(注射NC序列的胚胎)和 siRNA-2 (注射 siRNA-2 的胚胎)3组，并分别进行胚胎注射操作。注射后存活的受精卵移入前期培养液(含6 mg·mL-1 BSA、1 mmol·L-1 L-谷氨酰胺、2% EAA、1% NEAA的mCR1培养液)中培养，2 d后移入后期培养液(含10% FBS、1 mmol·L-1 L-谷氨酰胺、2% EAA、1% NEAA的mCR1培养液)中培养7~8 d至囊胚阶段。从胚胎脱卵丘细胞开始记为0 h，分别于48和168 h记录卵裂的胚胎数和囊胚数，计算相应的发育率。
1.6 细胞转染观察细胞融合度达到60%~70%，且状态良好时进行 siRNA 转染。根据lipofectamine3000转染试剂说明书，将3 μL lipofectamine3000加入100 μL Opti-MEM培养基中，混匀后室温静置5 min；同时，将3 μL siRNA 与100 μL Opti-MEM培养基混合，5 min后将混匀的转染试剂加入 siRNA 混合物中，室温静置20 min。移去细胞培养孔中的培养基，PBS清洗一遍后，每孔加入1 mL Opti-MEM培养基，将含转染试剂和 siRNA 的复合物加入培养孔中，于培养箱中培养。6 h后更换成含10% FBS和1%青链霉素的DF12培养基，荧光显微镜下(NIKON，日本)观察转染效果，48 h后收集细胞进行后续检测。
1.7 实时荧光定量 PCR收集干扰组和对照组细胞，参照动物组织/细胞RNA提取试剂盒说明书提取RNA后反转录成cDNA，利用CFX96TM实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD, 美国)进行定量分析。利用Primer Premier5.0软件，根据NCBI提供的基因序列设计引物，由北京六合华大基因科技有限公司合成(表 2)。反应体系：TB Green Premix Ex Taq II(2×)10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，模板2 μL，ddH2O补至20 μL。反应步骤：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共39个循环。每个样品重复3次，采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析，选择 GAPDH 为内参，ΔΔCt=[(Ctgene-CtGAPDH)]干扰组－[(Ctgene-CtGAPDH)]对照组。
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表 2 实时荧光定量 PCR 引物序列 Table 2 Primer sequences for qRT-PCR |
卵丘细胞培养48 h后，用0.25%的胰酶消化，收集细胞悬液并离心，重悬细胞后移入含爬片的六孔板中，培养箱培养48 h后移去培养基，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定1 h，加入0.5%Triton X-100，室温通透40 min；然后用含1% BSA的PBS清洗细胞3次，每次10 min，加入1% BSA的PBS，4 ℃封闭过夜。移去封闭液，一抗4 ℃孵育过夜；用含0.05%Triton X-100和1% BSA的PBS清洗3次，每次20 min。二抗37 ℃孵育1 h，清洗3次后DAPI避光孵育5 min，再清洗3次，取出爬片，反扣在载玻片上，倒置荧光显微镜下(NIKON，日本)拍照。
1.9 蛋白质免疫印迹当细胞融合度达90%时移去培养基，加入200 μL细胞裂解液，冰上裂解20~30 min，将细胞悬液移入1.5 mL离心管中，4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min，上清移入另一离心管备用。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定蛋白浓度后。按20:19:1比例加入蛋白样品、Buffer及β-巯基乙醇，100 ℃进行蛋白变性；变性蛋白质经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，300 V电压将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，37 ℃摇床、5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜，TBST清洗3遍后于HRP标记的二抗中37 ℃孵育1 h，清洗后显影，凝胶成像仪曝光保存图像，使用Image-J软件对蛋白含量进行分析。以a-tubulin作为内参，每个样品重复3次。
1.10 数据分析每个试验至少进行3个生物学重复，试验结果以“平均数±标准误(SEM)”表示。采用SAS统计软件使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan’s检验进行不同组间的差异显著性分析，P < 0.05为显著差异。
2 结果 2.1 牛卵丘细胞的培养用透明质酸酶消化体外成熟培养22 h的COCs(图 1A)，将获得的卵丘细胞进行培养。约20 h后细胞开始贴壁，24 h后可观察到伪足的出现(图 1B)；当细胞融合度为80%~90%时，消化传代并继续培养(图 1C)。
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A.成熟培养22 h的COCs；B.开始贴壁的卵丘细胞；C.融合度达80%~90%的卵丘细胞 A.COCs matured in vitro for 22 h; B.Cumulus cells attaching wall; C.Cumulus cells with 80%-90% confluency 图 1 牛卵丘细胞的培养(200×) Fig. 1 Culture of bovine cumulus cells(200×) |
收集培养48 h的牛卵丘细胞，以GAPDH为内参基因，采用荧光定量PCR方法分析 Ash1L mRNA的表达水平。结果发现，Ash1L 基因在卵丘细胞中的表达量较低，仅为内参基因的1%(图 2)。当卵丘细胞生长至融合度为80%~90%时，进行ASH1L甲基转移酶的免疫荧光染色。结果显示，ASH1L甲基转移酶定位于细胞核，且呈点状分布(图 3)。
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不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下同 Different letters indicate significant difference (P < 0.05).The same as below 图 2 Ash1L 基因在牛卵丘细胞中的表达 Fig. 2 Expression of Ash1L gene in bovine cumulus cells |
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图 3 ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达定位(200×) Fig. 3 Location of ASH1L methyltransferase in bovine cumulus cells (200×) |
用免疫荧光染色法分析牛卵丘细胞中H3K36me1/2/3甲基化修饰状态。结果见图 4，卵丘细胞中同时存在以上3种甲基化修饰模式。
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图 4 牛卵丘细胞中的H3K36me1/2/3甲基化修饰(200×) Fig. 4 H3K36me1/2/3 pattern in bovine cumulus cells (200×) |
将靶向 Ash1L 基因的3对 siRNAs (干扰组)和1对NC(对照组)分别转染牛卵丘细胞，培养48 h后分别收集细胞(图 5A和5B)，并进行定量PCR及Western blotting检测。结果显示，3个干扰组细胞中 Ash1L 基因的mRNA表达水平均显著低于对照组(P < 0.05)，且 siRNA-2 干扰组中 Ash1L 表达量显著低于 siRNA-1和 siRNA-3组(P < 0.05)，siRNA-1和 siRNA-3组间无显著差异(P>0.05，图 5C)。siRNA 转染后，ASH1L蛋白的变化趋势与mRNA变化趋势一致，其中，siRNA-2 干扰组中ASH1L蛋白的表达水平显著低于 siRNA-1、siRNA-3和对照组(P < 0.05，图 5D)。可见，siRNA-2 对牛 Ash1L 基因的干扰效果最佳，达到60%~ 70%，可用于后续试验。
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A. siRNA 转染前的牛卵丘细胞(200×)；B.荧光显微镜下观察转染 siRNA 后的卵丘细胞(200×)；C.转染不同 siRNAs 后，卵丘细胞中 Ash1L 基因的mRNA表达水平；D.转染不同 siRNAs 后，卵丘细胞中ASH1L蛋白的表达水平 A.Cumulus cells before siRNA transfection(200×); B.Cumulus cells transfected with siRNA under fluorescence microscape(200×); C.mRNA expression level of Ash1L gene in bovine cumulus cells transfected with different siRNAs ; D.Protein level of ASH1L in bovine cumulus cells transfected with different siRNAs 图 5 siRNAs 干扰对卵丘细胞中 Ash1L 基因和蛋白表达的影响 Fig. 5 Effects of siRNAs targeting Ash1L gene on the expression of Ash1L gene and protein in bovine cumulus cells |
将上述试验筛选得到的 siRNA-2 转染卵丘细胞，细胞爬片后采用免疫荧光染色法检测ASH1L甲基转移酶的表达。可见，干扰组细胞中ASH1L酶的荧光强度显著低于对照组，说明该酶的表达水平显著降低(图 6A和6B)，与 Ash1L mRNA表达量变化趋势一致(P < 0.05, 图 6C)。
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A.干扰 Ash1L 后ASH1L甲基转移酶表达的荧光染色图(200×)；B.干扰 Ash1L 后ASH1L甲基转移酶的相对荧光强度；C.干扰 Ash1L 后 Ash1L mRNA的相对表达量 A.Immunofluorescence staining of ASH1L methyltransferase after transfected with siRNA-2 and NC (200×); B.Relative fluorescence intensity of ASH1L methyltransferase after transfected with siRNA-2 and NC; C.Expression level of Ash1L mRNA after transfected with siRNA-2 and NC 图 6 siRNA-2 干扰对卵丘细胞中ASH1L甲基转移酶的影响 Fig. 6 Effects of siRNA-2 targeting Ash1L on the expression of ASH1L methyltransferase in bovine cumulus cells |
为进一步验证 siRNA-2 对胚胎中 Ash1L 基因的干扰效果，将 siRNA-2 和NC序列分别注射到牛体外受精1-细胞期胚胎，胚胎经过7 d体外培养后统计其发育率；同时以非注射胚胎为对照组。结果(表 3)，注射 siRNA-2 后，体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显著低于对照组和NC组胚胎(P < 0.05)，而NC组胚胎的发育率与对照组间无显著差异(P>0.05)。
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表 3 注射干扰序列后牛体外受精胚胎的发育 Table 3 Developmental competence of bovine IVF embryos injected with siRNA |
将 siRNA-2 (干扰组)和NC(对照组)分别转染牛卵丘细胞，48 h后收集干扰组和对照组细胞，采用免疫荧光染色法分析其中H3K36的甲基化状态。结果发现，干扰 Ash1L 基因表达后，H3K36me1/2/3甲基化水平均显著降低(图 7A)，其中H3K36me1甲基化水平降低幅度最大，达60%~70%(P < 0.05，图 7B)。
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A.干扰 Ash1L 基因表达后，卵丘细胞中H3K36me1/2/3甲基化的荧光染色图(200×)；B.H3K36me1的相对荧光强度；C.H3K36me2的相对荧光强度；D.H3K36me3的相对荧光强度 A.Immunofluorescence staining of H3K36me1/2/3 in bovine cumulus cells after interfering Ash1L (200×); B.Relative fluorescence intensity of H3K36me1; C.Relative fluorescence intensity of H3K36me2; D.Relative fluorescence intensity of H3K36me3 图 7 干扰 Ash1L 基因表达对牛卵丘细胞中H3K36甲基化修饰的影响 Fig. 7 Effects of interfering Ash1L on the methylation patterns of H3K36 in bovine cumulus cells |
将 siRNA-2 (干扰组)及NC(对照组)转染牛卵丘细胞，48 h后分别收集干扰组和对照组细胞，采用实时荧光定量PCR技术检测凋亡相关基因 Bax、Bcl-2和caspase-3，及PRC2蛋白组分 EZH2 和 Suz12 基因的mRNA表达水平。结果显示，当 Ash1L 基因表达降低时，凋亡相关基因 Bax、Bcl-2和caspase-3的表达量均显著升高(P < 0.05)，且凋亡基因 Bax 和caspase-3的表达量均高于抗凋亡基因Bcl-2(1.311和1.179 vs 1.146，图 8A~E)。同时，干扰 Ash1L 基因导致PRC2蛋白组分 EZH2 和 Suz12 基因的表达水平显著升高(P < 0.05，图 8F、G)。
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A.Bax 基因的相对表达量；B.Bcl-2基因的相对表达量；C.caspase-3基因的相对表达量；D.Bax /Bcl-2比值；E.caspase-3/Bcl-2比值; F.EZH2 基因的相对表达量；G.Suz12 基因的相对表达量 A.Relative expression level of Bax gene; B.Relative expression level of Bcl-2 gene; C.Relative expression level of caspase-3 gene; D.Bax /Bcl-2 ratio; E.caspase-3/Bcl-2 ratio; F.Relative expression level of EZH2 gene; G.Relative expression level of Suz12 gene 图 8 干扰 Ash1L 基因对牛卵丘细胞中凋亡相关基因及PRC2蛋白基因表达的影响 Fig. 8 Effects of interfering Ash1L on the mRNA level of apoptosis-related genes and PRC2 protein genes |
ASH1L是含有SET结构域的组蛋白甲基转移酶，通过控制基因的表达来调节细胞的生长与发育[12]。本试验对ASH1L在牛卵丘细胞中的分布、表达水平及其对组蛋白甲基化修饰和凋亡相关基因表达的影响进行了深入研究。
本研究发现，在牛卵丘细胞中，ASH1L甲基转移酶定位于细胞核中，且呈散点状分布，这与其在人上皮细胞和牙髓细胞中的研究结果一致[13-14]。将哺乳动物 Ash1L 基因导入果蝇体内，并观察果蝇的形态发育，结果表明，Ash1L 基因的功能在进化过程中是高度保守的[15]。在细胞分化过程中，ASH1L是一个积极的调控因子，可通过直接靶向I型胶原纤维和转化生长因子β1启动子区的H3K4me3修饰来促进肝星状细胞分化为肌成纤维细胞[16]；ASH1L通过结合Hox(homeobox gene)和Smad3(drosophila mothers against decapentaplegic protein 3)基因的启动子来调控基因的表达，调节骨髓间充质干细胞的成骨分化[17-18]；也可通过直接激活Smad3启动子上调其表达，进而促进Foxp3(forkhead box protein 3)表达，体外诱导调节性T细胞分化[19]。而 Ash1L 基因的突变会导致受伤小鼠的表皮细胞分化紊乱，角质形成细胞过度增殖、伤口愈合缺陷及皮肤增生[20]；另外，Ash1L 突变体小鼠断奶时的体重仅为野生型的60%[21]。在个体生长过程中，Ash1L 的功能缺失会导致胎儿造血干细胞的消耗，降低再生能力[22]。在体内和体外，Ash1L 基因表达与成肌细胞的融合呈正相关，其缺失会导致选择性成肌细胞融合缺陷，不利于细胞的发育[12]。
细胞凋亡是维持体内细胞数量动态平衡的基本过程，对多细胞生物的生长发育和正常生命活动至关重要；而且，其受多个基因的精确调控。Bax 和Bcl-2均属于Bcl-2家族，前者是促凋亡基因，后者是抗凋亡基因，两者共同调控线粒体凋亡信号通路。Bax 同源二聚体可促进线粒体内细胞色素C的释放，而Bcl-2与 Bax 形成的异源二聚体可阻碍线粒体内细胞色素C的释放。细胞色素C的大量释放能启动Caspase级联反应，caspase-3是级联反应中的最下游，是凋亡的执行者，可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起核固缩、核溶解，进而导致细胞凋亡[23-24]。脂多糖可诱导牛颗粒细胞凋亡水平的升高，Bax 和caspase-3基因的表达量显著升高，Bcl-2表达显著下降；添加泛素化修饰连接酶1抑制脂多糖表达后，细胞凋亡率下降，Bax 和caspase-3表达量显著下调，Bcl-2表达显著上调[25]。虽然 Ash1L 沉默与过表达对小鼠间充质干细胞的增殖率、周期和凋亡率均无显著影响，但基因沉默抑制了骨及软骨的形成；而且随着年龄的增长，老龄鼠的ASH1L蛋白表达水平显著低于青年鼠，说明ASH1L甲基转移酶有利于细胞的生长发育[26]。同样地，当牛卵丘细胞中 Ash1L 基因的表达下调时，凋亡相关基因caspase-3、Bax 和Bcl-2表达量均显著升高，但凋亡基因 Bax 及caspase-3升高幅度大于抗凋亡基因Bcl-2，所以 Ash1L 表达的缺失可能会促进细胞凋亡，抑制细胞的增殖，但具体的作用机制还有待于进一步的研究。
H3K36甲基化是一种与转录激活相关的组蛋白标记，富集在转录的起始位点[27-28]，可调控发育基因的表达[29]。在果蝇和哺乳动物中，ASH1L甲基转移酶可体外、体内特异性地甲基化H3K36[27-30]。在小鼠细胞中，当组蛋白H3K36突变为蛋氨酸时，会损害间充质祖细胞、软骨细胞及骨细胞的分化，并在体内产生未分化的肉瘤；同时染色质结合的EZH2和Suz12表达水平升高[31]。本研究通过免疫荧光染色方法分析了牛卵丘细胞中H3K36甲基化修饰状态，发现H3K36me1/2/3三种甲基化模式均存在于细胞核中；干扰 Ash1L 基因后，H3K36me1/2/3甲基化水平均显著降低，说明ASH1L可甲基化H3K36，与之前的研究结果一致。然而在果蝇幼虫中，ASH1L突变只小幅度降低了H3K36me1水平[32]，可能与不同物种或不同发育阶段中ASH1L甲基转移酶对组蛋白修饰位点的调控机制有关。
研究表明，ASH1L能拮抗多梳蛋白家族(polycomb group，PcG)对基因转录的抑制功能[33-34]。PcG蛋白是一种表观遗传修饰系统，是进化上保守的染色质抑制因子家族；对维持干细胞、祖细胞和分化细胞中的细胞特性具有重要作用[35]，其介导的组蛋白H3K27me3在基因沉默和发育调控中起着至关重要的作用[36-37]。作为PcG的核心蛋白复合物之一，PRC2是一种组蛋白甲基转移酶，通过甲基化H3K27来抑制转录，调控基因表达[38]。PRC2包含4个亚基，Zeste同源物增强子2(enhancer of zeste homologue 2，EZH2)、EED(embryonic ectoderm development)、SU(Z)12(suppressor of zeste 12)及Nurf55(nucleosome remodeling factor 55)，后两者是PRC2与核小体结合所必需的[39-40]；而EZH2及 Suz12 的敲低导致H3K27me2/3水平的降低[36]。根据本研究的结果，干扰牛卵丘细胞中 Ash1L 基因表达，导致 EZH2 和 Suz12 基因的mRNA表达水平均显著升高，表明ASH1L与PRC2蛋白间存在相关性，与果蝇和小鼠中的结果一致。在小鼠胚胎干细胞中添加维甲酸，不仅激活了ASH1L的甲基转移酶活性，还导致 Suz12 和PRC1成分Rnf2表达量的显著下降[7]。在果蝇的活性基因中，ASH1的存在使PRC2不能三甲基化染色质的H3K27；而在ASH1突变体中，多个基因的启动子和编码区存在H3K27me3，所以，ASH1特异性催化H3K36甲基化，并通过干扰核小体上PRC2的活性而抑制H3K27甲基化；另外，ASH1L甲基转移酶与亚基Mrg15结合后，在其靶基因的转录区催化H3K36me2，以拮抗PRC2催化的H3K37的甲基化修饰[30]，抵抗PcG蛋白诱导的基因沉默，维持靶基因的转录“ON”状态[41-42]。因此，对PRC2蛋白及其组成成分的研究将有利于揭示ASH1L甲基转移酶对基因转录的作用机制。
4 结论本研究定量和定性分析了ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达，发现其在细胞核中呈点状分布，但其基因表达量较低；成功筛选到能有效干扰牛 Ash1L 基因的 siRNA (干扰效率为60%~70%)；干扰后，卵丘细胞的H3K36me1/2/3三种甲基化水平均显著降低；同时，干扰 Ash1L 不仅导致凋亡相关基因 Bax、Bcl-2和caspase-3表达水平的显著上调(凋亡基因 Bax 和caspase-3表达量高于抗凋亡基因Bcl-2)，也导致PRC2蛋白亚基 EZH2 和 Suz12 基因的显著上调。该结果为研究ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞生长、卵母细胞和胚胎发育中的调控作用奠定了基础。
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