2. 广东省农业科学院动物科学研究所, 畜禽育种国家重点实验室, 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室, 广州 510642
, XU Xiangping1, LU Tingting1, LIAN Zhiquan1, ZOU Xian2, ZHAO Zhifeng1, LIU Guangbin1, LIU Dewu1, DENG Ming1
2. Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510642, China
卵巢是雌性动物重要的繁殖器官，其主要功能是生成并排出能够完成受精的健康卵子，同时分泌性激素以维持雌性动物性征和周期性繁殖活动。卵巢可通过影响排卵数量决定山羊产羔数，故其在山羊的生殖调控过程中占据重要地位[1-2]。有研究表明，长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)可参与雌性动物卵巢发育和卵母细胞成熟等与动物繁殖相关的生物学过程，并在其中发挥重要的调控作用[3-5]。lncRNA是一类转录本长度超过200 bp且具有一定功能，但缺乏蛋白质编码能力的RNA分子[6]，能够在多个水平调控相关基因表达和蛋白质的功能，进而发挥其独特的生物学作用，因此，研究lncRNA在山羊卵巢中的表达特征，分析其综合调控产羔数的作用机制，对山羊繁育工作意义重大。
目前，在小鼠、绵羊和山羊等动物的卵巢或颗粒细胞中，关于差异表达lncRNA的研究多有报道。罗瑞晨[7]利用高通量测序技术检测小鼠卵巢组织中lncRNAs的表达情况，研究结果发现，卵巢中存在大量差异表达的lncRNAs，推测这些lncRNAs可能在卵巢衰老过程中发挥重要作用。李良远[8]和高霄霄[9]分别针对绵羊卵巢和雌性山羊下丘脑，通过高通量测序技术筛选差异表达lncRNAs，并对其进行GO和KEGG分析，推测lncRNAs在发情调控中起着重要作用。以上研究表明，通过高通量测序方法可筛选出差异表达lncRNA，GO和KEGG分析可预测并挖掘lncRNA的功能，故用此方法研究川中黑山羊卵巢中影响产羔数的差异表达lncRNA的功能是可行的。
目前，关于川中黑山羊繁殖性能的相关研究鲜有报道。川中黑山羊是我国优秀的一胎多羔、常年发情的地方品种，具有适应性强、生长发育快、产肉性能好、繁殖性能突出、被毛光滑黑亮等优良性状，初产母羊的产羔率约为197%，经产母羊的产羔率约为249%[10]。羔羊是养羊业各项经济来源的基础，羊的产羔数直接影响养殖场的经济收益。为提高养羊业生产效益和山羊繁殖育种效率，有必要对影响山羊产羔数的调控机理进行深入研究。
本试验以处于发情期的高、低繁殖力川中黑山羊为研究对象，利用高通量测序技术对卵巢进行转录组测序，鉴定高、低繁殖力山羊卵巢差异表达的lncRNA，并对其靶基因进GO和KEGG分析，综合探究lncRNA对山羊产羔数的分子调控机制，这不仅可丰富山羊卵巢转录组数据信息，鉴定出的lncRNAs还可为分子选育种技术提供理论依据，对加速优质高繁山羊的选育种进程，提高养羊业的经济效益具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 试验动物和样品采集本试验以南方某种羊场的10头年龄在3.5 ~ 4.5岁，且经产3胎以上的健康川中母羊(capra hircus)为研究对象，根据每胎产羔数将其分为高繁组和低繁组，其中高繁组母羊有6只(编号为o5~o10)，低繁组母羊有4只(编号为o1~o4)。本研究选择的高繁组母羊每胎产羔数大于等于2，减小了胎次对产羔率统计的影响，平均每胎产羔数为2.8只，低繁组母羊每胎产羔数为1只。采用前列腺素一次注射法对母羊注射氯前列烯醇0.1 mg·只-1，24 h后第一次发情，18 d后确认第二次发情，采用公羊试情法确认母羊是否发情，发情情况以母羊摇尾、站立并接受爬跨为准[11-14]。发情后24 h内进行屠宰并采集卵巢，每头羊卵巢样品均在同一部位采集。卵巢组织采集后修剪掉韧带和附着组织，在体式显微镜下将小卵泡(小于3 mm)、中卵泡(3~10 mm)、大卵泡(＞10 mm)尽可能分离，得到剩下的卵巢组织放入液氮速冻后-80 ℃保存。卵巢组织中包含少量的小卵泡和卵巢基质。
1.2 高、低繁殖力山羊卵巢组织的总RNA抽提、cDNA文库构建和转录组测序取冻存的卵巢组织置于研钵中研磨成粉末，用Trizol试剂提取总RNA(Invitrogen, carlsbad, CA, USA)。通过DanoDrop ND-2000分光光度计(Thermo science, wilmington, DE, USA)、1%琼脂糖凝胶分别检测RNA的浓度和纯度、完整性。每个样品取3 μL总RNA，构建cDNA文库，利用HigSeq X ten测序平台进行双末端测序。整个流程委托上海派森诺生物科技股份公司完成。
1.3 卵巢转录组数据分析检测碱基质量及获取lncRNA测序数据包含带接头、低质量的Reads，这些数据会对后续的信息分析造成干扰，故对测序数据采用Cutadapt软件去除3′端的接头，去除的部分与接头有至少10 bp重叠(AGATCGGAAG)，允许20%碱基错配；去除平均质量分数低于Q20的Reads。Q20值是指测序碱基识别(base calling)过程中，对所识别的碱基给出的错误概率为1%。通过Bowtie 2软件建立参考基因组(GCF_001704415.1_ARS1_genomic；http://www.ensembl.org/)索引，使用Tophat 2软件将过滤后的Reads比对到参考基因组上，默认Reads和参考基因组序列的错配在2个之内即为比对成功[15]。
用Stringtie软件根据比对结果来组装转录本，分析拼接结果中的信息和lncRNA的结构特点，从组装的转录本中筛选候选lncRNA[16-17]。条件为长度≥200 bp，外显子个数≥2；Reads最小覆盖度≥3；利用guffcompare软件中的类代码信息筛选Intergenic lncRNA、Intronic lncRNA、Anti-sense lncRNA类型的转录本。
1.4 编码潜能分析鉴定lncRNA分别使用CNCI(coding-non-coding-index)(v2)[18]、CPC(coding potential calculator)(0.9-r2)[19]、Pfam Scan(x1.3)[20]和PhyIoCSF(phylogenetic codon substitution frequency)(x20121028)[21]进行编码潜能性分析，3种软件均判定没有编码潜能的转录组序列为候选lncRNAs。
1.5 高、低繁殖力山羊卵巢组织的lncRNA表达量分析1.5.1 lncRNA转录本水平的表达量分析 使用Stringtie软件对lncRNA在转录本水平上进行表达量分析[22]；皮尔逊相关系数表示样品间lncRNA的表达水平相关性；使用R语言的procmp函数，根据表达量对各样品进行PCA主成分分析(principal components analysis)。
1.5.2 表达差异lncRNAs的分析 本研究采用DESeq对lncRNA表达进行差异分析，筛选条件为表达差异倍数|log2Fold Change |>1，显著性P-value < 0.05[23]。
使用R语言ggplots 2软件包绘制差异表达lncRNA的火山图，Pheatmap软件包根据同一lncRNA在不同样品中的表达水平和同一样品中不同lncRNA的表达模式进行聚类，采用Euclidan方法计算距离，使用层次聚类最长距离法(complete linkage)进行聚类。
1.6 差异表达lncRNAs的靶基因预测由于样品数较少时分析结果的可靠性不高，因此无法进行反式调控功能预测。采用顺势作用(cis role)靶基因预测，筛选出lncRNA上游和下游100 kb范围内的编码基因进行后续功能分析。
1.7 差异表达lncRNAs的靶基因功能注释利用GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库分别对所有差异lncRNAs的靶基因进行功能注释和通路分析。采用超几何分布计算靶基因显著富集的GO条目和KEGG通路，P < 0.05为显著富集[24]。
1.8 差异表达lncRNAs的荧光定量PCR验证从筛选出的差异表达lncRNAs中随机选择出6个差异lncRNAs，利用qRT-PCR进行转录组表达谱验证分析。lncRNA信息源自Esemble数据库(http://www.ensembl.org/)。PCR反应体系(10 μL)：5 μL SYBR® Green Master Mix，上、下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA和3 μL ddH2O。反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34个循环。引物设计参考NCBI的山羊(capra hircus)相关lncRNA序列，β-actin作为内参基因，用Primer 5.0软件设计，并送Sangon Biotech合成引物(表 1)。
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表 1 实时荧光定量PCR试验相关引物 Table 1 Primer used for qRT-PCR |
将本研究所得的测序数据进行质量控制，对Clean reads进行碱基含量分布和碱基质量分布统计，质量值大于等于30的碱基所占百分比在91%以上(表 2)，测序数据与山羊的数据库比对率在82%以上，93%以上的序列在参考序列上有唯一比对位置(表 3)。综合表明测序数据好，满足后续分析的要求。
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表 2 测序数据质控 Table 2 Quality control of sequencing data |
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表 3 Reads与参考基因组比对情况 Table 3 Comparison of reads and reference genome |
本研究从山羊卵巢中一共筛选出4 370个lncRNAs，对其进行进一步的差异表达分析，结果表明，高、低繁殖力山羊卵巢之间的显著差异表达lncRNAs总数为168个，其中163个在高繁组山羊卵巢中显著上调，5个在低繁组山羊卵巢中显著上调(图 1)。从热图分析来看，同一lncRNA在同一组内的表达量基本一致，说明同组内的样本之间差异较小。低繁组山羊卵巢的4个样本聚集在一起，高繁组山羊卵巢的6个样本另外聚在一起，说明高繁组和低繁组山羊卵巢的lncRNAs表达模式不同(图 2)。随机挑选6个差异表达lncRNAs进行实时荧光定量PCR，验证RNA测序数据的可靠性。验证结果与测序数据结果基本一致，表明测序数据结果可靠性高(图 3)。
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图 1 差异表达lncRNAs的火山图 Fig. 1 Volcano plot of differentially expressed lncRNAs |
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右侧的图例表示lncRNA的表达量，红色表示lncRNAs表达上调；绿色表示lncRNAs表达下调 Red indicates the up-regulated expression of lncRNAs; Green indicates the down-regulated expression of lncRNAs 图 2 差异表达lncRNAs聚类图 Fig. 2 Heatmap of differentially expressed lncRNAs |
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图 3 差异表达lncRNAs的qRT-PCR验证 Fig. 3 Validation of the differentially expressed lncRNAs by qRT-PCR |
本试验对差异表达lncRNAs的靶基因进行了生物功能分析，进一步探究与产羔数相关的差异lncRNAs所涉及的生物学功能。基于GO数据库，本研究对差异lncRNA的靶基因进行功能分类，其中GO分析包括生物学过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组成(cellular component, CC)3个部分。在高、低繁殖力山羊卵巢中有832个GO条目显著富集(P < 0.05)，其中涉及的生物学过程有717个，主要包括感觉器官发育(sensory organ development)；涉及的分子功能有80个，主要包括DNA结合RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、序列特异性DNA结合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity, sequence- specific DNA binding)和DNA结合转录因子活性(DNA binding transcription factor activity)；涉及的细胞组成有35个，主要包括质膜的内在组成成分(integral component of plasma membrane)和转录因子复合物(transcription factor complex)。生物学过程、分子功能和细胞组成中P 值前10的GO条目见图 4。
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图 4 lncRNAs的GO分析 Fig. 4 GO analysis of lncRNAs |
基于KEGG数据库的通路富集分析，在高、低繁殖力山羊卵巢中差异lncRNAs的靶基因涉及119条通路，其中显著富集的通路有12个(P < 0.05)。P 值前10的通路包括: Janus激酶/信号转导与转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription, Jak-STAT)、肿瘤中心糖代谢(central carbon metabolism in cancer)、腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)、肾素分泌(renin secretion)、细胞黏附分子(cell adhesion molecules, CAMs)、RNA降解(RNA degradation)、烟酸和烟酰胺代谢(nicotinate and nicotinamide metabolism)、转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)、环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G, cGMP-PKG)和有丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，其中差异最显著的信号通路是Jak-STAT信号通路。P 值前20的通路见图 5。
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图 5 lncRNAs的KEGG分析 Fig. 5 KEGG analysis of lncRNAs |
产羔率属于微效多基因控制的阈性状或数量性状，不但受营养水平和环境的影响，还受遗传的影响[25]。lncRNA对于动物繁殖相关的过程都起着重要的调控作用，但是在山羊中对lncRNA的认识非常有限，尤其是卵巢发育过程中lncRNA对山羊排卵、产羔率等繁殖性能的影响[26-28]。因此，本研究以发情期高、低繁殖力川中黑山羊的卵巢为研究对象进行高通量测序，对筛选出的差异lncRNAs的靶基因进行生物学分析，进而探究差异lncRNAs在山羊卵巢中对产羔率的影响作用。
本研究在 P 值前10的显著富集通路中选择Jak-STAT、MAPK、TGF-β、AMPK、细胞粘附分子和RNA降解信号通路，并对通路及通路中的靶基因进行有关繁殖调控的讨论。
Jak-STAT信号通路是细胞内信号转导通路。卵巢内生长因子在调节卵泡的选择和生长中起重要作用，有研究鉴定并证明了大鼠卵巢中的血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factors, PDGF)和受体(platelet-derived growth factors receptors, PDGFR)家族所有成员的存在和定位，同时表明了 PDGF 影响早期卵泡的生长[29]。PDGFRA是缺乏gH/gL/pUL128-pUL131A复合物的巨细胞病毒进入人胎盘细胞的重要受体[30]。根据本试验结果分析发现，在高繁组山羊卵巢中显著上调的ENSCHIG00000007416的靶基因 PDGFRA 富集到此通路，根据靶基因所发挥的功能推测，ENSCHIG00000007416可能是通过调控 PDGFRA 参与卵泡生长和胚胎发育过程来影响产羔数。
MAPK信号转导通路能将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应[31]。在胚胎发育过程中起关键作用的调控基因，在成熟组织器官中能促进组织修复和细胞增殖，同时与肿瘤发生及侵袭生长也密切相关[32]。成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor, FGF9)是成纤维细胞生长因子家族成员之一，作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中起重要作用，也影响卵巢癌发生过程[33-34]，根据本试验结果分析发现，ENSCHIG00000005930、ENSCHIG00000005932和ENSCHIG00000005937在高繁组山羊卵巢中显著上调，其靶基因 FGF9 在MAPK信号通路显著富集。根据已有的靶基因功能研究，推测上述lncRNAs在卵巢癌发生和胚胎发育的生殖调控中起重要作用。
TGF-β是一条广泛参与增殖、凋亡、分化和迁移等细胞功能的信号通路。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMPs)作为TGF-β信号通路中的关键组分对卵巢卵泡的发育、胚胎发育、器官形成具有重要调控作用。有研究报道，小鼠内胚层衍生物BMP2和外胚层衍生物BMP4协作可刺激原始生殖细胞生成[35-36]。BMP2的表达可作为检测卵母细胞以及胚胎质量的指标[37]。结果表明，ENSCHIG00000002084在高繁卵巢中显著上调，其靶基因 BMP2 在TGF-β通路中显著富集，根据上述研究报道，猜测卵泡发育和胚胎发育可能与ENSCHIG0000000208介导 BMP2 有关。
从数据可得，Jak-STAT、MAPK和TGF-β信号通路有共同基因 MYC。有研究表明，MYC 是癌基因中重要的生物标志物，睾丸和卵巢的恶性肿瘤等都有MYC的过度扩增、异常表达和基因重组[38-39]。根据本试验结果分析发现，ENSCHIG00000001479在高繁卵组山羊卵巢中显著上调，且介导的靶基因 MYC 在此通路中显著富集，猜测ENSCHIG00000001479可能通过调控 MYC 影响卵巢癌的发生。
AMPK信号通路是调控哺乳动物繁殖性能的关键通路。已有研究表明，猪、羊、牛和兔卵巢均有AMPK存在，在哺乳动物卵巢发育中主要通过介导葡萄糖、胰岛素样生长因子-1、促卵泡素、脂联素等发挥功能[40]，过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1alpha, PPARGC1A)参与线粒体的生物合成、葡萄糖代谢、肝糖异生等代谢途径[41]。葡萄糖可调控卵母细胞线粒体结构，高浓度葡萄糖可促进鼠卵母细胞减数分裂恢复[42]。试验表明，ENSCHIG00000007334在高繁卵巢中显著上调且靶向 PPARGC1A，推测ENSCHIG00000007334在 PPARGC1A 介导的肝糖异生和葡萄糖代谢过程中发挥调控作用。
颗粒细胞与卵母细胞间借助于黏附分子相互黏附和传达信息来影响卵泡的发育。钙粘素是细胞黏附分子中一种钙依赖的跨膜糖蛋白，神经型钙粘素(n-cadherin, CDH2)介导的细胞接触可使颗粒细胞表面G蛋白配体与G蛋白相关受体结合进而激活卵母细胞表面的成纤维细胞生长因子受体，抑制cAMP-磷酸二酯酶，导致细胞内cAMP水平下降，维持在基础cAMP水平，阻滞减数分裂[43]，miR-26b- 5p可以通过抑制CDH2的表达促进GCs的凋亡[44]；细胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1, CADM1)在卵巢癌细胞系中低表达，过表达 CADM1 对卵巢癌细胞增殖和克隆形成无显著影响，但可抑制其迁移和侵袭，起抑癌基因的作用[45-46]。本研究结果表明，ENSCHIG00000002617和ENSCHIG00000002622的靶基因 CDH2 和 ENSCHIG00000002007 的靶基因 CADM1 在此通路显著富集，且上述lncRNAs均在高繁组山羊卵巢中显著上调。推测上述lncRNAs可能通过调控 CDH2 影响细胞分裂和排卵，或通过调控 CADM1 抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，进而影响山羊产羔数。
母源mRNA降解在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中起重要作用。在小鼠母体向受精卵的转变过程中，BTG4 是母源mRNA降解的一个重要调节因子，并且 BTG4 是通过连接CCR4-NOT复合体(CCR4-NOT transcription complex)与胞浆多聚A结合蛋白1样蛋白来发挥这一调节功能的。有研究报道，该基因敲除的雌性小鼠早期胚胎发育阻滞，MⅡ期卵母细胞和合子的转录组与未敲除小鼠相比有明显差异[47]。BTG4 在受精卵形成和胚胎发育过程中发挥作用。根据结果表明，在高繁组山羊卵巢中显著上调的 ENSCHIG00000002062 靶向 BTG4，且 BTG4 在此通路中显著富集，表明ENSCHIG00000002062可能与山羊产羔数存在一定的相关性。
4 结论本研究采用RNA-Seq测序技术对发情期高、低繁殖力川中黑山羊的卵巢组织进行转录组测序，通过对表达差异显著的lncRNAs的靶基因进行生物信息学分析，结果发现，ENSCHIG00000001479、ENSCHIG00000002617和ENSCHIG00000002622等差异表达lncRNAs对川中黑山羊的卵巢发育、排卵、肿瘤发生过程可能具有重要的调控作用，推测lncRNA在母羊繁殖过程中发挥的作用与产羔数密切相关，本研究为探讨山羊产羔数的繁殖机制提供了完善的转录组数据，也为山羊繁育工作中候选功能基因的研究提供了理论依据。
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