2. 中国科学院微生物研究所 微生物资源前期开发国家重点实验室, 北京 100101
, FAN Ziyao1, NIU Pengxia2, LIU Zhiguo1, MU Yulian1, ZHANG Mingrui1, LI Kui1
, WANG Bingyuan1
2. State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
骨骼肌是动物个体进行正常活动和维持新陈代谢的重要器官，也是人类获取动物蛋白的重要来源[1]。骨骼肌生成是一个复杂的过程，包括增殖的单核成肌细胞退出细胞周期，互相融合形成梭状的多核肌管，肌管进一步融合形成骨骼肌的基本结构单位肌纤维[2]。通常情况下，肌纤维的数目在动物个体出生时就已经决定了，出生后肌肉的生长发育主要依赖于肌纤维的增粗、延长所致的肌纤维体积增大。个体成年后，肌纤维的数量、体积、各类型的比例基本维持在相对恒定的状态[3]，但当肌肉受到损伤时，骨髓中的成体干细胞和肌肉中的成肌细胞可以再次被激活，到达损伤部位发挥修复功能[4]。
生肌调节因子(myogenic regulatory factors, MRFs)家族包括Myod、Myog、Myf5和Myf4，参与胚胎期到成年期肌肉发育和损伤修复的全过程，是肌肉生成相关的重要基因[5-6]。其中，Myod是最早发现的生肌调节因子，能够使成纤维细胞分化为骨骼肌样细胞[7-8]，Myod和Myf5参与早期的肌卫星细胞和成肌细胞增殖[9-10]，而Myod和Myog能够促使成肌细胞退出细胞周期并融合形成多核肌纤维[11]。缺失Myog抑制成肌细胞分化，会导致缺失小鼠产生严重的肌肉缺陷而在出生前后死亡[12]。因此，Myod和Myog的表达在成肌细胞增殖和分化中具有重要意义[13-14]，在此基础上的肌肉发育相关研究对骨骼肌生成和肌肉损伤修复相关治疗具有重要的理论意义。
Ide基因在人和所有真核生物、细菌中都有高度保守的一级序列，是一种在进化上高度保守的锌金属蛋白酶，其活性中心是锌离子结合部位。Ide高度亲和并降解胰岛素、淀粉样蛋白、胰高血糖素、心钠肽、松弛肽、降血钙素及某些生长因子。Ide尤其倾向于裂解目标蛋白P1位点的碱性或较大的疏水残基。胰岛素是Ide的主要底物，Ide能高度特异性降解胰岛素，通过与胰岛素A链和B链结合并以此断裂结合位点的肽键来催化降解反应，生成短肽和氨基酸，使胰岛素受体再循环以促进新的胰岛素分泌，维持体内胰岛素水平的稳定。Ide主要位于细胞质、过氧化物酶体和内涵体内，也存在于细胞膜表面及细胞外，Ide对其底物的降解可能是通过Ide靶向细胞膜转移到细胞外，然后对底物进行降解[15-19]。研究发现，Ide敲除小鼠出现高胰岛素血症和葡萄糖不耐受等2型糖尿病的特征，同时出现脑中内源性β淀粉样蛋白积累增多等阿尔茨海默病的特征，说明Ide功能障碍与2型糖尿病和阿尔茨海默病有关，也可能是糖尿病易向阿尔茨海默病发展的原因之一[20-21]。近年来的研究还发现，在人癌变的乳腺组织、卵巢组织，以及不同组织来源的肿瘤细胞系中均检测到了Ide的异常表达，提示Ide在肿瘤的进展中也可能发挥作用[22]。除此之外，Epting等[23]发现，Ide作为生肌祖细胞标志基因Sca-1(stem cell antigen-1)的靶蛋白，化学抑制或siRNA干扰其表达能够在分化状态下维持成肌细胞增殖，进而延迟成肌细胞分化。在最近的研究中，Meneses等[24]发现了Ide的新功能，与野生型小鼠相比，Ide敲除小鼠的睾丸重量下降了50%，曲细精管直径也明显减小，同时，Ide敲除小鼠精子质量受到破坏，出现精子存活率下降以及精子形态异常，证明了Ide在雄性繁殖中也具有重要作用。
本团队最新研究发现，Ide可能与猪肌肉发育不良致站立困难有密切关系(尚未发表)，因此，本研究进一步围绕Ide在成肌细胞增殖和分化中的作用这一科学问题，对Ide在猪不同组织包括骨骼肌组织(股四头肌、股二头肌和背最长肌等)中的表达情况进行检测，并利用小鼠C2C12成肌细胞系对其进行初步的功能研究，解析了Ide在成肌细胞增殖和分化中的作用及可能的分子机制。为后续开展猪原代肌肉细胞的相关研究奠定了基础，也为后期家畜肌肉发育相关的理论研究和肉质改良提供了参考依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂DMEM高糖培养基、0.25%胰酶、胎牛血清、Opti-MEM® I Reduced Serum Medium购自美国Gibco公司；siRNA购自广州锐博生物科技有限公司；LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂购自美国Invitrogen公司；CCK-8细胞增殖试剂盒购自日本Dojindo公司；RNA裂解液、反转录试剂盒及PCR试剂购自日本TaKaRa公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇和甲醇购自北京化工厂；10×转膜缓冲液、10×TBST、10×电泳缓冲液和胶试剂盒购自上海雅酶生物科技有限公司；蛋白裂解液、蛋白Marker购自美国Thermo Fisher Scientific公司；脱脂奶粉购自上海碧迪医疗器械有限公司；PBS Phosphate-Buffered Saline购自瑞士Lonza公司；IDE抗体购自英国Abcam公司，β-actin、GAPDH、PCNA、CyclinA2、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE1、P-P53、P53、AKT、P-AKT、Bcl2、Bax等抗体、二抗(兔/鼠)均购自美国Cell Signaling Technology公司；MyHC、MYOG、MYOD等抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.2 方法1.2.1 C2C12成肌细胞培养及诱导分化 小鼠C2C12成肌细胞培养：细胞培养在含10%胎牛血清、10 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素的DMEM高糖培养基中，培养箱条件为37 ℃，5% CO2；细胞传代：细胞密度达到80%左右时，用0.01%胰酶对细胞进行消化，将细胞铺板传代或冻存；诱导细胞成肌分化：在细胞密度达到90%左右时，更换培养基为含2%马血清的DMEM高糖培养基，诱导分化，在分化的早期(第2天, D2)和后期(第5天, D5)收集细胞进行相应检测。
1.2.2 RT-PCR和RT-qPCR引物设计与合成 参照NCBI中各基因的mRNA序列，利用Primer -BLAST在线设计引物，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，引物列表见表 1。
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表 1 试验所用引物 Table 1 Primers used in the study |
1.2.3 siRNA转染C2C12成肌细胞 siRNA(包括Ide-siRNAs和NC-siRNA)由广州锐博生物科技有限公司设计并合成，其中Ide-si-1、Ide-si-2、Ide-si-3序列分别为GGAATGAAGTTCACAATAA、GGTTCAAACAAGATGATAA和TCCTGGTCATTATCTTGGT。增殖检测时，将C2C12细胞以每cm2培养皿底面积6 000个细胞进行接种后培养过夜，参照LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂说明书，将Ide-siRNAs和NC-siRNA分别转染细胞，4 h后更换新鲜培养液，培养48 h后收集细胞进行后续检测。分化检测时，培养C2C12细胞密度达80%左右时，更换含2%马血清的DMEM高糖培养基，诱导细胞成肌分化，同时将Ide-siRNA和NC-siRNA分别转入细胞，4 h后更换新鲜培养液。并于转染第3天再次转染，以维持干扰效果。分别于转染第2和5天收集细胞进行后续检测。
1.2.4 CCK-8检测C2C12成肌细胞增殖 将C2C12细胞以3 000个·孔-1细胞加入96孔板，每组10个复孔，放入培养箱培养过夜后，将Ide-siRNA和NC-siRNA分别转染细胞，4~6 h后更换新鲜培养液。转染48 h后更换新鲜培养基(每孔100 μL)，随后每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续孵育1 h，于酶标仪450 nm波长下检测每孔细胞的吸光度OD值，按照说明书计算细胞增殖情况，即细胞活率=(干扰组OD－空白孔OD)/(NC组OD－空白孔OD)×100%。
1.2.5 小型猪组织和C2C12成肌细胞RNA提取、RT-PCR和RT-qPCR 试验所用组织样品来自中国农业大学小型猪饲养场，采集8月龄小型猪大脑、股四头肌、股二头肌、背最长肌、心、肝、脾、肺、肾和睾丸10个组织样品；C2C12成肌细胞购自北京协和细胞资源中心。使用TaKaRa Trizol reagent提取小型猪组织和C2C12成肌细胞RNA。使用TaKaRa去DNA反转录试剂盒，按照说明书将500 ng RNA去除基因组DNA后，反转录合成cDNA。
RT-PCR反应体系(20 μL)：2× Taq PCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，灭菌水补充至总体积20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重复30个循环；72 ℃延伸5 min。以GAPDH为内参。
RT-qPCR反应体系(20 μL)：2× TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，50× ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，灭菌水补充至总体积20 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，重复40个循环。添加熔解曲线(95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃变性15 s)。β-actin做内参，试验设置3次生物学重复，采用2－△△Ct法计算mRNA的相对表达量。
1.2.6 Western blotting检测样品中蛋白表达 将C2C12细胞以初始细胞数为每孔9.6×104个细胞接种于6孔板中，在转染48 h后用0.01%胰酶消化并收集细胞，离心弃PBS后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解缓冲液，冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心20 min，提取上清后进行蛋白定量。加入5×蛋白变性buffer并煮沸，进行SDS-PAGE电泳(120 V 15 min；200 V 40 min)，转膜至PVDF膜(200 mA 2 h)，5%脱脂奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温1 h，ECL发光液显影。
1.2.7 数据统计学分析 所有涉及到统计学分析的结果均为两两比较，且数据至少重复3次。以“平均数±标准差”表示，数据平均值间统计学差异用t检验进行分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 Ide在小型猪不同组织中的表达对小型猪大脑、股四头肌、股二头肌、背最长肌、心、肝、脾、肺、肾和睾丸10个组织中Ide mRNA和蛋白表达情况进行检测，结果发现，Ide mRNA在小型猪不同组织中均有表达(图 1A)，Western blotting结果(图 1B)显示，IDE蛋白在股四头肌、肾和睾丸中表达量高于其他组织。
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A. Ide mRNA在小型猪10个组织中的表达情况，GAPDH为内参；B. IDE蛋白在小型猪10个组织中的表达情况，GAPDH为内参。M. DNA相对分子质量标准；1.大脑；2.股四头肌；3.股二头肌；4.背最长肌；5.心；6.肝；7.脾；8.肺；9.肾；10.睾丸 A. The expression of Ide mRNA in 10 tissues of mini-pig, GAPDH used as internal reference; B. The expression of IDE protein in 10 tissues of mini-pig, GAPDH used as internal reference. M. DNA marker; 1. Brain; 2. Quadriceps; 3. Biceps femoris; 4. Longest dorsal muscle; 5. Heart; 6. Liver; 7. Spleen; 8. Lung; 9. Kidney; 10. Testis 图 1 Ide在小型猪不同组织中的表达 Fig. 1 Expression of Ide in different tissues of mini-pig |
将小鼠C2C12成肌细胞接种后培养过夜，分别将3组Ide-siRNAs(简写为Ide-si-1、Ide-si-2、Ide-si-3)和1组NC-siRNA(简写为NC)转染至细胞，在转染48 h后，收集细胞提取RNA和蛋白，用于检测干扰效率。RT-qPCR结果显示(图 2A)，3组siRNAs均可极显著降低Ide mRNA表达(P＜0.001)，Western blotting结果(图 2B)也可见IDE蛋白表达明显下降，说明干扰效果良好，选择Ide-si-1用于后续试验。
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A. Ide-siRNAs转染C2C12成肌细胞48 h后Ide mRNA相对表达量变化，内参为β-actin；B. Ide-siRNAs转染C2C12成肌细胞48 h后IDE蛋白的表达变化，内参为GAPDH。***. P＜0.001，n=3 A. Change of Ide mRNA relative expression after Ide-siRNAs tranfecting into C2C12 for 48 h, β-actin used as internal reference; B. Change of IDE protein levels after Ide-siRNAs tranfecting into C2C12 for 48 h, GAPDH used as internal reference. ***. P < 0.001, n=3 图 2 Ide-siRNAs干扰效率检测 Fig. 2 Analysis of Ide-siRNAs interference efficiency |
成肌细胞中转染Ide-si-1和NC-siRNA 48 h后检测成肌细胞相关基因Myod、Myog的表达变化，结果如图 3所示，RT-qPCR检测mRNA相对表达量发现，降低Ide表达后(P＜0.001)，成肌细胞相关基因Myod(P＜0.01)和Myog(P＜0.05)的表达显著下降(图 3A)。Western blotting检测蛋白表达变化结果与RT-qPCR结果一致(图 3B)，即IDE表达降低后，MYOD和MYOG的蛋白水平也下降。
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A. RT-qPCR检测干扰Ide 48 h后Myod和Myog mRNA表达情况, 内参为β-actin；B. Western blotting检测转染Ide-siRNA 48 h后MYOD和MYOG蛋白表达情况, 内参为ACTINB。*. P＜0.05, **. P＜0.01, ***. P＜0.001, n=3，下同 A. The mRNA relative expression of Myod and Myog after Ide knockdown for 48 h, β-actin used as internal reference; B. The protein expression of MYOD and MYOG after Ide-siRNA transfecting into C2C12 for 48 h, ACTINB used as internal reference. *. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001, n=3, the same as below 图 3 干扰Ide 48 h后成肌细胞相关基因表达 Fig. 3 The expressions of myoblast-related genes after Ide knockdown |
为研究Ide在成肌细胞增殖中的作用，成肌细胞中转染Ide-si-1和NC-siRNA 48 h后，CCK-8法检测细胞增殖情况，结果如图 4A所示，干扰Ide表达后细胞存活率极显著高于NC组(P＜0.01)。RT-qPCR和Western blotting检测细胞周期相关基因的表达情况，结果显示，干扰Ide表达后Pcna(P＜0.05)、CyclinB1(P＜0.05)和CyclinA2(P＜0.001)的mRNA相对表达量均显著升高(图 4B)，同时，这些因子的蛋白表达水平也显示升高(图 4C)。综上说明，干扰Ide表达促进了成肌细胞的增殖。
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A. CCK-8法检测干扰Ide 48 h后细胞增殖情况；B. RT-qPCR检测干扰Ide 48 h后细胞周期相关基因mRNA表达情况, 内参为β-actin；C. Western blotting检测转染Ide-siRNA 48 h后细胞周期相关基因蛋白表达情况, 内参为GAPDH A. The proliferation analysis by CCK-8 test after Ide knockdown for 48 h; B. The mRNA relative expressions of cell cycle-related genes after Ide knockdown for 48 h, β-actin used as internal reference; C. The protein expressions of cell cycle-related genes after Ide-siRNA transfecting into C2C12 for 48 h, GAPDH used as internal reference 图 4 干扰Ide对成肌细胞增殖的影响 Fig. 4 The effect of Ide knockdown on the proliferation of myoblasts |
为探究Ide在成肌细胞凋亡中的作用，转染Ide-si-1和NC-siRNA至成肌细胞48 h后，检测凋亡相关基因的表达，RT-qPCR结果显示，干扰Ide表达后抗凋亡因子Bcl2表达极显著升高(P＜0.001)，凋亡因子Bax表达极显著下降(P＜0.01)，P53表达无显著变化(图 5A)。Western blotting结果显示，抗凋亡因子BCL2表达升高，凋亡因子BAX表达下降，P53及磷酸化P53表达下降(图 5B)。综上说明，干扰Ide表达抑制了成肌细胞的凋亡。
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A. RT-qPCR检测干扰Ide 48 h后凋亡相关基因mRNA表达情况, 内参为β-actin；B. Western blotting检测转染Ide-siRNA 48 h后凋亡相关基因蛋白表达情况, 内参为GAPDH A. The mRNA relative expressions of apoptosis-related genes after Ide knockdown for 48 h, β-actin used as internal refe-rence; B. The protein expressions of apoptosis-related genes after Ide-siRNA transfecting into C2C12 for 48 h, GAPDH used as internal reference 图 5 干扰Ide对成肌细胞凋亡的影响 Fig. 5 The effect of Ide knockdown on the apoptosis of myoblasts |
为了解Ide在成肌细胞分化中的表达情况，本研究使用2%马血清诱导细胞成肌分化。在分化的第1(D1)和5天(D5)，即成肌分化的初期和后期，收集细胞提取RNA，检测Ide、Myod、Myog、Akt1和Akt2的表达情况，RT-qPCR结果显示(图 6)，随着成肌细胞的分化进程，Ide、Myod、Myog、Akt1和Akt2的表达趋势均为上升，提示，Ide很可能在成肌细胞分化中具有重要作用。
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图 6 Ide、Myod、Myog、Akt1和Akt2在成肌细胞分化过程中的表达 Fig. 6 The expressions of Ide, Myod, Myog, Akt1, and Akt2 in the process of myoblast differentiation |
为了解Ide在成肌细胞分化中的作用，使用2%马血清诱导细胞成肌分化的同时转染Ide-si-1和NC-siRNA，计为第0天，在第3天再次转染，收集第2(D2)和5天(D5)细胞，检测分化相关基因的表达。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，Ide干扰组在分化第2天，随着Ide表达的下降，Myod和Myog表达极显著下降(P＜0.001)，Akt1和Akt2的表达无显著差异(图 7A)。而在分化第5天，随着Ide表达的下降，Myod、Myog、Myhc和Akt2的表达均显著下降(P＜0.001或P＜0.05)，Akt1的表达无明显变化(图 7B)。和RT-qPCR结果相似，Western blotting结果显示，在分化的第2和5天，随着IDE表达降低，MYOD、MYOG和MyHC表达也明显下降。同时发现，IDE表达降低后AKT和磷酸化AKT(P-AKT)表达下降(图 7C)。提示，IDE通过AKT磷酸化调控成肌细胞的分化。
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A. RT-qPCR检测分化第2天(D2)相关基因mRNA表达情况, 内参为β-actin；B. RT-qPCR检测分化第5天(D5)相关基因mRNA表达情况, 内参为β-actin；C. Western blotting检测分化D2和D5相关基因蛋白表达情况, 内参为ACTINB A. The mRNA relative expressions of differentiation-related genes at differentiation D2, β-actin used as internal reference; B. The mRNA relative expressions of differentiation-related genes at differentiation D5, β-actin used as internal reference; C. The protein levels of differentiation-related genes at differentiation D2 and D5, ACTINB used as internal reference 图 7 干扰Ide对成肌细胞分化的影响 Fig. 7 The effect of Ide knockdown on the differentiation of myoblasts |
肌肉发育情况影响着畜禽肉品质，成肌细胞的增殖和分化是肌肉发育中的重要过程，探究调控成肌细胞增殖和分化的关键基因及其机制对肌肉发育相关研究和改良畜禽肉品质具有重要意义。本研究初步解析了Ide在猪不同组织中的表达及其在成肌细胞增殖和分化中的作用，发现Ide在猪不同组织中广泛表达，以股四头肌、肾和睾丸中表达更高。干扰Ide表达后促进了成肌细胞的增殖、抑制了成肌细胞的分化，Ide可能是通过影响AKT的磷酸化水平调控成肌分化的。本研究结果为肌肉发育相关研究提供了理论基础。
本研究首先利用RT-PCR和Western blotting检测了Ide在猪大脑、股四头肌、股二头肌、背最长肌、心、肝、脾、肺、肾和睾丸10个组织中的表达情况，发现Ide在这些组织中广泛表达，在股四头肌、肾和睾丸中表达量高于其他组织。早在1994年，Bondy等[25]检测了Ide在胚胎期和成年期大鼠组织中的mRNA表达情况，他们发现，Ide mRNA在大鼠不同组织中广泛表达，以肾和肝中表达量更高。此后，Yfanti等[26]检测了IDE蛋白在人不同组织中的表达，发现IDE蛋白在肾、肝、肺、脑、乳腺和骨骼肌中广泛表达。而本研究在猪的组织中检测了Ide的表达，发现同大鼠和人相似，Ide在不同组织中广泛表达，提示其可能参与猪的多种生物学过程。
成肌细胞的增殖受到PCNA、细胞周期蛋白等基因的调控，PCNA主要参与细胞DNA的合成，在细胞增殖的启动上起重要作用[27]。细胞周期蛋白包括Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E等，在细胞周期的不同时期动态表达并发挥重要作用[28]。为了解Ide在成肌细胞增殖中的作用，本研究利用siRNA干扰了Ide的表达，发现Ide表达下降后，细胞活率升高，同时PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E的表达均升高。说明Ide具有负调控成肌细胞增殖的作用。不同研究报道了Ide在几乎所有人类肿瘤中高表达，提示其异常激活促进增殖[29]。如Ide在人乳腺癌和卵巢癌中表达升高[22, 26]，Ide在中枢神经系统肿瘤中高表达且其含量与肿瘤分级相关。在神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y中，干扰Ide表达抑制细胞增殖，启动细胞死亡[30]。但Epting等[23]和本研究都发现，在成肌细胞中干扰Ide表达促进了细胞增殖，也并未引起细胞凋亡(Bcl2表达升高，Bax和P53表达降低)。Tundo等[15]也提出，到目前为止，Ide到底是一个肿瘤抑制因子还是新的原癌基因，仍不是很清楚。因此需要进一步研究。
Myod、Myog、Myf5和Mrf4，这4个转录因子构成生肌调节因子家族[31]。在成肌分化早期的定向中，同源性较高的Myod和Myf5起决定性作用，而同源性较高的Myog和Mrf4在后期分化为肌纤维的过程中发挥调节作用[32-33]。其中，Myod调节成肌细胞增殖和肌肉生长，促进多种类型的细胞转化为成肌细胞样细胞[7]。Myog抑制成肌细胞增殖，促进单核的成肌细胞分化为多核肌纤维[11]。本研究发现，干扰Ide表达后，Myod和Myog表达下降，细胞增殖增强。在分化条件下干扰Ide表达后，在分化的早期(第2天)和后期(第5天)均可见Myod和Myog表达的下降。MyHC(myosin heavy chain)是肌原纤维的骨架成分，在分化后期形成肌纤维时表达，被认为是成肌细胞分化的标志基因[34]。本研究结果也证实，MyHC在成肌细胞分化早期表达极弱，在分化的后期表达量显著升高。干扰Ide表达后MyHC的表达也显著下降，提示成肌细胞分化受到抑制。这些结果说明，Ide在成肌细胞分化中具有重要的作用。
AKT是一种丝苏氨酸激酶，调控细胞内多种生物学过程，包括增殖、存活和代谢等。哺乳动物Akt有3种亚型：Akt1、Akt2和Akt3，在肌肉细胞和组织中存在的主要是Akt1和Akt2亚型。有报道称，只有Akt1参与成肌细胞增殖，而Akt2则通过促进成肌细胞退出细胞周期及调控Myog表达参与成肌细胞分化，得出结论为，Akt1促进成肌细胞增殖而Akt2促进成肌细胞分化[35]。因此本试验研究了Ide是否通过影响Akt1、Akt2，以及激活的AKT(即磷酸化的AKT(P-AKT))调控成肌细胞的分化。结果发现，干扰Ide表达后，Akt1和Akt2 mRNA表达量在分化第2天无显著变化，在分化第5天Akt1仍无明显变化，但Akt2表达出现了下降。Western blotting检测发现，在分化的第2和5天均出现P-AKT表达下降，AKT总蛋白在分化的第2天无明显变化，但在分化第5天表达下降，提示Ide表达下降引起Akt2表达下降，进而导致AKT总蛋白及P-AKT表达下降，而Akt2表达下降也会导致Myog表达下降[36]。以上结果说明，Ide通过Akt2/P-AKT/Myog途径调控成肌细胞的分化。
4 结论Ide在猪的不同组织中广泛表达，以肌肉、肾和睾丸中表达量更高。干扰Ide表达促进C2C12成肌细胞的增殖，分化时干扰Ide表达则通过Akt2/ P-Akt/ Myog途径抑制C2C12成肌细胞的分化。
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