2. 河南牧业经济学院动物医药学院, 郑州 450046;
3. 河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室, 郑州 450002
, WANG Wenjia2, LAN Yali1
, ZHANG Bin1, MENG Hongli1, WANG Yazhou1, HUA Liushuai1, XU Zhaoxue1,3
2. College of Veterinary Medicine and Pharmaceutical Engineering, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China;
3. Henan Key Laboratory of Farm Animal Breeding and Nutritional Regulation, Zhengzhou 450002, China
犊牛腹泻是临床上一种常见的综合征，影响犊牛健康，进而影响优质畜产品生产，给养牛业造成严重的危害。其病因复杂，其中，病毒感染是引起腹泻的重要原因[1]。据报道，除了牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus，BRoV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)等常见的可以导致犊牛腹泻的病毒外，牛诺如病毒(bovine norovirus，BNoV)、牛环曲病毒(bovine torovirus，BToV)和牛纽布病毒(bovine nebovirus，BNeV)等新发病毒在犊牛腹泻病原谱中也越来越备受关注[2-3]。
诺如病毒(norovirus，NoV)属于杯状病毒科、诺如病毒属的单股正链RNA病毒，是人和动物胃肠道疾病的重要病原之一[4]。NoV基因组全长7.3~ 7.7 kb，由3个开放阅读框(open read frames，ORFs)组成，ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码主要衣壳蛋白(VP1)，ORF3编码次要结构蛋白(VP2)[5]。NoV共有7个基因群(GI~GVⅡ)[6-7]，BNoV属于基因群GⅢ。BNoV GⅢ有两个基因型：GⅢ.1和GⅢ.2，代表性毒株分别为Bo/Jena/1980/DE [8](GenBank登录号：AJ011099)和Bo/Newbury2/1976/UK[9](GenBank登录号：AF097917)。近年来，根据双重命名系统(基于RdRp部分序列和完整VP1序列)，上述两个原型毒株又可命名为GⅢ/Bo/DE/1980/GⅢ.P1_GⅢ.1/Jena和GⅢ/Bo/UK/1976/GⅢ.P2_GⅢ.2/Newbury2 [10]。
BNoV是确定的犊牛腹泻病原[11]，已在全球19个国家检出[12-17]。尽管BNoV尚无成熟的分离培养体系，在将只含GⅢ.2 BNoV的腹泻粪便无菌处理后感染新生无菌小牛，可引起犊牛急性、间歇性、持续性腹泻，伴有嗜睡症状，并可长期通过粪便排毒，但组织病理学检查未见明显病变[18]；而感染GⅢ.1 BNoV的犊牛，除表现厌食和腹泻外，还伴有肠上皮坏死和肠绒毛萎缩[11]。流行病学资料也表明BNoV与犊牛腹泻紧密相关[19]。因此，BNoV已经是一种公认的犊牛腹泻致病原。实时荧光定量PCR检测方法是国际公认检测病毒的黄金标准，因其快速、简便、安全、灵敏度高且可定量等优点，所以更适用于临床检测[20-22]。Jor等[23]使用染料SYBR Green Ⅰ建立了检测BNoV的荧光定量方法，但该方法需要约2 h才能完成检测，与常规PCR检测时长相当，不满足临床对快速检测的需求。而且，近两年BNoV已在中国部分犊牛群中流行[3, 24]，但目前国内还没有专门针对BNoV的快速诊断方法。鉴于此，本研究基于BNoV的RdRp基因序列，建立了检测BNoV的荧光定量PCR方法，为犊牛腹泻的病原诊断及分子流行病学调查提供了有力手段。
1 材料与方法 1.1 病毒株及被检材料BNoV、BToV、BCoV、BRoV、BVDV、BNeV、牛星状病毒(bovine astrovirus，BAstV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus，BKoV)阳性样品均由本实验室收集并鉴定保存。
221份腹泻犊牛的粪便样本于2017年9月—2019年5月在河南部分地区的牛场采集，样本均采自4月龄以下的腹泻犊牛。
1.2 主要试剂及仪器MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit(9766)、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)、pMD 18-T Vector Cloning Kit(6011)、E. coli JM109 Competent Cells(9052)、2×Premix Taq(R004A)、DL2000 DNA Marker(3427A)和MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(9762)等为TaKaRa公司产品；质粒小提试剂盒Plasmid Mini Kit(D6943)为OMEGA公司产品；2×EvaGreen qPCR SuperMix(AQ142-21)为北京全式金生物技术有限公司产品。
荧光定量PCR仪(7500 Fast，美国ABI公司)、高速冷冻离心机(5424R，德国Eppendorf公司)、常规PCR仪(TP600，日本TaKaRa公司)、超微量分光光度计(NanoDrop2000，美国Thermo Forma公司)、凝胶成像分析仪(WD-9413B，中国北京六一生物科技有限公司)。
1.3 引物设计与合成根据GenBank公布的BNoV基因序列(登录号：MK159169)，针对BNoV RdRp基因的保守区域，采用Oligo 6.0软件设计1对特异性引物：5′-GCTACACAGCGGCGCTTAA-3′(F)；5′-GGGAGTTCGACCACATGTTC-3′(R)。预计扩增产物163 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.4 核酸提取将粪便样品用PBS按1:10混悬，反复冻融3次后，漩涡震荡，4 ℃ 8 000 r·min-1离心5 min，收集上清，-80 ℃保存，用于后续试验。病毒RNA的提取参照提取试剂盒，-80 ℃保存病毒RNA；cDNA的反转录参照逆转录试剂盒，-20 ℃保存。
1.5 重组质粒标准品的制备以BNoV毒株的cDNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增。反应体系为25 μL：包括2×Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL(10 μmol·L-1)，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用胶回收试剂盒回收纯化目的片段，克隆于pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp，将重组质粒转化至JM109感受态细胞中，后涂在含有氨苄青霉素钠的LB琼脂平板上，37 ℃培养，挑取单菌落扩大培养，提取重组质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果正确的重组质粒作为反应模板及质粒标准品。用超微量分光光度计测定重组质粒的浓度，计算拷贝数[拷贝数=质粒浓度×10-9×6.02×1023/(660×质粒总长度)]。
1.6 实时荧光定量PCR熔解曲线以重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp为模板，按照EvaGreen qPCR试剂盒提供的反应体系进行扩增，即SuperMix(2×)10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。扩增条件为预变性94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。熔解曲线条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，验证引物的特异性。
1.7 实时荧光定量PCR检测方法的建立1.7.1 实时荧光定量PCR反应体系及条件的优化 以重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp为模板，按照EvaGreen qPCR试剂盒提供的反应体系，将退火温度设置为57、58、59、60、61、62 ℃共6个温度梯度，对退火温度进行优化。确定退火温度后，将引物浓度设置100、150、200、250、300、350 nmol·L-1，模板用量设置0.5、1、1.5、2、3、4 μL，分别对引物浓度和模板用量进行优化筛选。循环条件：预变性94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。
1.7.2 标准曲线的建立 将重组质粒进行10倍倍比稀释，得到109~101拷贝·μL-1等9个稀释度的标准品模板，按照“1.7.1”优化的反应条件进行扩增，绘制标准曲线。
1.7.3 敏感性试验 将重组质粒进行10倍倍比稀释后作为模板，用等量Nuclease-free Water作阴性对照，每个稀释度做3个重复，根据已建立的荧光定量PCR方法进行扩增，观察扩增曲线，确定质粒的最低拷贝数。同时，对相同模板进行常规PCR扩增，并比较2种检测方法的敏感性。
1.7.4 特异性试验 以“1.1”中待检病原的cDNA为模板，使用本研究建立的荧光定量PCR方法进行扩增，以重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp为阳性对照，设Nuclease-free Water为阴性对照，以验证所建方法的特异性。
1.7.5 重复性试验 以2.24×107~2.24×104拷贝·μL-1 4个稀释度的重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp为模板，分别进行批内和批间试验。批内试验：同一次试验下模板设3个重复；批间试验：同一试验条件下3个不同时间段分别进行3次试验，每次试验模板设3个重复；计算模板Ct值的标准差(s)和变异系数(CV)，验证实时荧光定量PCR方法的可靠性和重复性。
1.8 临床样本检测利用本研究建立的荧光定量PCR方法、常规PCR和Smiley等[25]建立的RT-PCR方法分别对221份腹泻样品的cDNA进行检测，比较3种方法的符合率，同时调查河南省腹泻犊牛中BNoV的感染情况。
2 结果 2.1 BNoV RdRp基因目的片段的扩增利用自行设计的引物从BNoV毒株的cDNA中扩增出约150 bp的片段(图 1)，经测序片段大小为163 bp，与预期相符。经BLAST检索，与GenBank上的基因序列完全匹配，为BNoV RdRp基因的特异性序列。
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M. DNA相对分子质量标准；1.阳性样品；2.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1. BNoV positive sample; 2. Negative control 图 1 BNoV RdRp基因目的片段的PCR扩增 Fig. 1 PCR amplification of the target fragment of RdRp gene |
重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp经扩增后，扩增产物在Tm值为87 ℃处出现单一波峰(图 2)，无引物二聚体和非特异性扩增峰。
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1.pMD18T-BNoV-RdRp；2.阴性对照 1. pMD18T-BNoV-RdRp; 2. Negative control 图 2 荧光定量PCR方法的熔解曲线 Fig. 2 Melting curve of real-time PCR for BNoV |
通过对退火温度、引物浓度和模板浓度等条件的优化，反应体系最终确定为总体积20 μL：2×EvaGreen qPCR SuperMix 10 μL，50×Passive Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。反应条件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。
2.4 标准曲线的建立根据拷贝数计算公式计算出重组质粒的拷贝数为2.24×1010拷贝·μL-1，用ddH2O将重组质粒依次进行10倍倍比稀释，依照优化后的反应体系及条件，对不同拷贝数的重组质粒进行扩增，结果显示，重组质粒在2.24×102~2.24×108拷贝·μL-1之间线性关系良好(图 3)，回归方程为y=-3.36x+38.151，相关系数R2=0.997，扩增效率是98.44%。
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图 3 荧光定量PCR方法的标准曲线 Fig. 3 Standard curve of the real-time PCR |
敏感性试验结果表明，荧光定量PCR所能检出的最低拷贝数为22.4拷贝·μL-1(图 4)。而常规PCR最低检出BNoV的拷贝数为2.24×104拷贝·μL-1(图 5)，该荧光定量PCR方法是普通PCR方法敏感性的1 000倍，敏感性较高。
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1~10.2.24×109 ~2.24×100拷贝·μL-1；N.阴性对照 1-10.2.24×109-2.24×100copies·μL-1; N. Negative control 图 4 荧光定量PCR的敏感性 Fig. 4 Sensitivity test of the real-time PCR |
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1~7.2.24×107 ~2.24×101拷贝·μL-1；8.阴性对照 1-7.2.24×107-2.24×101 copies·μL-1; 8. Negative control 图 5 常规PCR敏感性试验 Fig. 5 Sensitivity experiment of common PCR |
用所建立的方法对BToV、BAstV、BCoV、BRoV、BVDV、BKoV、BNeV的cDNA及重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp进行检测。结果显示，该方法仅对BNoV有扩增，其他病原及阴性对照均无特异性扩增(图 6)。
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1.2.24×108拷贝·μL-1 pMD18T-BNoV-RdRp；2~8. BToV、BAstV、BCoV、BRoV、BVDV、BKoV、BNeV；9. ddH2O 1.2.24×108 copies·μL-1 pMD18T-BNoV-RdRp; 2-8. BToV, BAstV, BCoV, BRoV, BVDV, BKoV, BNeV; 9. ddH2O 图 6 荧光定量PCR的特异性检测 Fig. 6 Specificity test of the real-time PCR |
以4个稀释度的重组质粒为模板分别进行批内和批间重复性试验。结果显示，批内Ct值变异系数(CV)在0.40%~0.50%，批间Ct值CV在0.70%~ 1.30%(表 1)，均小于2.0%，表明该方法具有良好的可重复性。
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表 1 荧光定量PCR的重复性 Table 1 Repeatability test of the real-time PCR |
3种检测方法对BNoV的检出结果见表 2。其中使用荧光定量PCR方法检出BNoV的阳性率为11.31% (25/221)，采样场的阳性率为92.86%(13/14)，且检出的阳性样品包含了另两种方法检出的所有阳性样品。另外河南省腹泻犊牛中BNoV的感染情况见表 3。
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表 2 临床样品的检测结果 Table 2 The detection result of BNoV in clinical samples |
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表 3 河南省BNoV的感染情况 Table 3 Investigation of BNoV infection in Henan Province |
犊牛腹泻是临床上一种可引起犊牛死亡的常见综合征[26]，给养牛业带来巨大的经济损失。由于其病因复杂，及时找出致病原因，并作出准确诊断，采取相应防治措施是成功控制犊牛腹泻的关键。犊牛腹泻病因包括病毒、细菌、真菌、寄生虫以及环境等生物学因子[27-28]，其中，病毒感染是引起犊牛腹泻的重要原因，且病毒性病原可通过急性、持续性或潜伏性等感染模式引起腹泻类疾病[29]。BNoV是确定的犊牛腹泻病原，是国内犊牛腹泻的新发病毒，很可能是犊牛腹泻的重要病原之一，进一步加强对BNoV的监测将对犊牛腹泻的防控具有重要意义。
传统的检测BNoV的方法主要有电镜观察、抗原抗体ELISA检测[30]和分子生物学方法[31]。电镜观察敏感性低，且需要的病毒粒子较多；抗原抗体ELISA检测的敏感性和特异性都较低，且难以区别遗传关系上较为密切的毒株，通常ELISA检测阴性的疑似病例样本仍需通过分子生物学方法进行重新检测。近年来，RT-PCR方法已成为诊断BNoV感染的主要手段，且BNoV的全基因序列已通过设计多对引物进行RT-PCR扩增而获得[5]。目前, 有关BNoV的荧光定量检测方法较少，Jor等[23]使用荧光染料SYBR Green Ⅰ和降落PCR程序来对BNoV进行定量检测。该方法耗时约2 h，与常规RT-PCR时长相当，不利于对临床样本的快速检测。本研究建立的定量方法总耗时低于1 h，能够极大提高临床样本的检测效率，且PCR退火温度高于上述研究5 ℃，能够减少非特异性扩增的出现。另外，本研究使用的EvaGreen染料作为另一种用于实时定量PCR的DNA结合染料，相较于SYBR Green Ⅰ，EvaGreen更稳定更安全，且对PCR反应的抑制性更小，在定量PCR中的定量效果要优于SYBR Green Ⅰ[32]。本研究设计引物所使用的模板来源于中国四川省的GⅢ.2型毒株，尽管上、下游引物与GⅢ.2型Bo/Newbury2/1976/UK毒株存在1~3个位点的点突变，但这并不妨碍本研究对BNoV的检出；但与GⅢ.1型Bo/Jena/1980/DE毒株存在1~7个位点的点突变。本研究根据Smiley等[25]建立的RT-PCR方法所检出的RdRp部分序列，经遗传进化分析发现均属于GⅢ.2型，所以本方法对GⅢ.1型毒株的检测能力尚未可知。
近年来，随着养牛行业的兴起和养殖数量的日益增加，犊牛腹泻和牛呼吸道疾病综合征等病症也突显出来，难以控制，成为困扰养牛业的难题，这可能与病原种类增加、新发病原感染率高、混合感染严重等因素有关[33-35]。然而，目前，国内对BNoV在我国的流行状况、致病力以及分子遗传进化分析等方面的相关报道甚少，尤其河南省BNoV的流行情况尚无准确掌握。王玥琳等[36]采用RT-PCR方法检测了我国5省份12个奶牛场的BNoV感染情况，结果显示腹泻粪便样本中BNoV的检出率高达25.81%，BNoV已在国内奶牛中广泛流行。该试验仅检测了河南省3个奶牛场27份腹泻样品，样品来源及数量较少，无法对河南省BNoV的感染情况进行总体囊括。本试验对2017年9月—2019年5月河南省不同地区的14个牛场221份犊牛腹泻样本进行了检测，BNoV的阳性检出率为11.31%(25/221)，采样场阳性率92.86%(13/14)，表明该病毒已在河南牛群中流行。这一结果对河南省犊牛腹泻的防控提供了重要参考依据。但本研究只针对RdRp基因的部分序列对BNoV进行了检测，并未对BNoV的其他基因序列如VP1、VP2和ORF1/ORF2的结合区域进行深入研究，此将作为下一步的研究方向。
4 结论成功建立了基于EvaGreen的BNoV real-time PCR检测方法，该方法灵敏性高、特异性强、重复性好，其对BNoV的最低检出量为22.4拷贝·μL-1，为BNoV的检测和分子流行病学调查提供了新的技术手段。BNoV作为国内一种牛的新发病毒，可能是一个重要的犊牛腹泻病毒，应引起高度重视。
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