猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一种以高热稽留和广泛出血为主要特征的高度接触性传染病，给全球养猪业造成了严重的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为须申报的(notifiable)动物传染病[1-3]。CSFV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员，其基因组全长约12.3 kb，包含5′非编码区(untranslated region，UTR)、一个大的开放阅读框和3′-UTR[4-6]。其阅读框编码由3 898个氨基酸组成的多聚蛋白，这一多聚蛋白在2种细胞内蛋白酶和3种病毒蛋白酶(Npro、NS2和NS3)的作用下裂解为12个成熟的病毒蛋白，分别为4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[7-10]。目前，我国主要采取免疫接种的措施来预防猪瘟，常用的疫苗为猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株或HCLV株)[11-12]。C株为我国学者在20世纪50年代通过将CSFV强毒株在兔体内连续传480余代后培育而成的[13-15]，该疫苗株能对各种日龄的猪产生极好的免疫保护，抵抗致死性强毒的攻击[16-17]。同时，C株在家兔上具有独特的生物学特性，包括能够引起家兔的定性热反应以及病毒能在家兔的脾和淋巴组织中复制[15]。与C株相反，CSFV强毒Shimen株则不具备这些特性。
表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的一种突变体，由238个氨基酸构成，蛋白质相对分子质量为27 ku。EGFP具有荧光强度高、对宿主细胞毒副作用小以及检测方法简便，无需添加底物等优点，因此，EGFP蛋白在生物学研究领域中应用非常广泛。目前已经开发了与报告基因表达相关的多种策略。例如，瘟病毒属的成员牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)经过基因改造，可以在Npro和C基因之间插入外源EGFP基因，报告基因可以在重组病毒中稳定表达[18]。通过反向遗传操作系统，在小反刍兽疫病毒(pestedes petits ruminants virus，PPRV)的全长感染性克隆中插入GFP基因，拯救的病毒在细胞培养物中10代以内都可以稳定表达GFP蛋白[19]。
本研究采用两种策略将EGFP基因引入C株，用于构建报告CSFV。首先，将EGFP基因引入C株Npro蛋白的13和14位氨基酸之间，构建表达EGFP蛋白的报告病毒rHCLV-EGFP。尽管rHCLV-EGFP携带完整EGFP基因，但在感染的细胞中并未观察到绿色荧光。改进试验方案后，将CSFV强毒Shimen株Npro基因替换C株Npro基因后再引入EGFP基因，获得的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP可以在感染病毒的细胞中观察到绿色荧光。
1 材料与方法 1.1 质粒、细胞和病毒C株感染性克隆pHCLV、pSM-HCLV5NCR的5′半端和pSM-HCLV3NCR的3′半端[20-22]由本实验室构建和保存。SK6(swine kidney cell line)细胞在含5%胎牛血清的DMEM培养基(不含BVDV及其抗体)中培养，放在含5% CO2的37 ℃温箱中。猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV株或C株)(GenBank登录号AY805221)，从感染性cDNA克隆拯救出的rHCLV、rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP均在SK6细胞中培养。EGFP-CSFV为表达EGFP蛋白的CSFV强毒Shimen株报告病毒，由本实验室前期拯救[23]。CSFV强毒Shimen株的GenBank登录号为AY775178。
1.2 感染性克隆的构建以实验室前期构建的CSFV C株的感染性克隆pHCLV为载体构建了C株报告病毒的感染性克隆pHCLV-EGFP(图 1A)。简而言之，用表 1中列出的引物通过重叠PCR将EGFP基因插入到Npro蛋白第13和14位氨基酸间。然后，将PCR产物用标准分子克隆技术克隆入pHCLV中获得pHCLV-EGFP，并用多种核酸限制性内切酶和测序对获得的pHCLV-EGFP进行鉴定。
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图 1 表达EGFP的报告C株感染性克隆的构建策略 Fig. 1 Schematic representation of reporter C-strain expressing the enhanced green fluorescent protein |
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表 1 构建感染性克隆所用的引物 Table 1 Primers used for construction of the reporter infectious clones |
在pHCLV-EGFP基础上构建嵌合报告病毒感染性克隆pHCLV-Npro(SM)-EGFP(图 1B)。即用表 1中列出的引物通过PCR将包含部分5′-UTR，Npro和EGFP序列的基因从带有EGFP标签的CSFV Shimen感染性克隆pShimen-EGFP扩增得到[17]。然后，用标准分子克隆技术将PCR产物克隆进pHCLV-EGFP以获得pHCLV-Npro(SM)-EGFP，同样用多种核酸限制性内切酶酶切和测序对获得的pHCLV-Npro(SM)-EGFP进行鉴定。
1.3 报告病毒的拯救用之前描述的方法拯救报告病毒rHCLV-EGFP和嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP[21]。具体方法如下：将4 μg pHCLV-EGFP或者pHCLV-Npro(SM)-EGFP转染SK6细胞，然后将细胞进行10次传代。通过荧光显微镜对每代病毒的EGFP荧光进行实时观察。通过3次冻融收获拯救出来的病毒。用CSFV抗原检测试剂盒检测rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP第3代到第10代Erns蛋白的表达。利用针对CSFV E2蛋白的特异性单克隆抗体HQ06进行间接免疫荧光试验[24]，检测拯救的rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP E2蛋白的表达。
同时，提取拯救病毒的基因组，通过RT-PCR方法扩增Npro-EGFP融合基因进行测序鉴定。用抗EGFP的单克隆抗体(Genscript)或者鼠抗CSFV Npro蛋白多克隆抗体(实验室制备)检测rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP的Npro-EGFP蛋白表达情况。
1.4 报告病毒的生长曲线将rHCLV-EGFP、rHCLV-Npro(SM)-EGFP和rHCLV分别以MOI值为0.1感染量接种培养在24孔板中的SK6细胞，37 ℃孵育2 h后，更换新的培养液，再将细胞置于含5% CO2的37 ℃温箱中培养。每12 h收获上清，通过间接免疫荧光试验检测病毒滴度，用每毫升TCID50表示。试验重复3次，计算出平均值和标准偏差。
1.5 家兔试验动物试验经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物福利委员会批准，其执照为SYXK(黑龙江)2011022。将24只14周龄大的新西兰白兔随机分为4组，每组6只(表 2)。第1组家兔通过耳缘静脉接种rHCLV-EGFP，第2组接种rHCLV-Npro(SM)-EGFP，第3组接种rHCLV，第4组接种DMEM。接种之后，每6 h记录家兔的直肠温度来监测它们的定型热反应。
接种3 d后每组随机选择3只家兔进行安乐死，采集家兔脾，用实时RT-qPCR定量进行检测家兔脾中病毒的RNA拷贝数[25]。具体方法如下：配制25 μL的实时RT-qPCR反应体系，包含3 μL cDNA, 2.5 μL 10× Ex Taq Buffer，2 μL的dNTP(每个含2.5 mmol·L-1)，1 μL的HCLV-F/HCLV-R(10 mmol·L-1)，0.5 μL HCLV-JOE(10 mmol·L-1)探针和2 U的Hot Star Ex Taq polymerase(TaKaRa)。循环条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s和60 ℃退火/延伸45 s(40个循环)。每个样本的试验进行3个重复。通过标准曲线计算病毒基因组的RNA拷贝数。
2 结果 2.1 报告病毒rHCLV-EGFP的拯救将构建的感染性克隆pHCLV-EGFP转染SK6细胞拯救报告病毒rHCLV-EGFP，并通过直接观察EGFP荧光，IDEXX猪瘟病毒抗原检测试剂盒、间接免疫荧光以及基因测序的方法对拯救的报告病毒进行鉴定。ELISA结果显示，在第6代到第10代SK6细胞上清中CSFV Erns蛋白抗原检测结果为阳性(图 2A)；利用针对CSFV E2蛋白的特异性单克隆抗体HQ06进行间接免疫荧光试验，结果表明，在ELISA抗原检测结果为阳性的细胞上清中可检测到CSFV E2蛋白(图 2B)；之后，按照病毒RNA提取说明书提取第6代到第10代细胞上清中的病毒基因组，通过RT-PCR方法扩增Npro-EGFP融合基因并进行测序鉴定。测序结果表明，在第6代至第10代病毒中Npro-EGFP基因和预期的大小一样为1 218 bp(图 2C)，且插入的EGFP基因没有发生缺失或者突变。上述3种结果共同表明，笔者获得了携带EGFP基因的报告病毒rHCLV-EGFP，且报告病毒遗传稳定，第6代至第10代报告病毒rHCLV-EGFP的Npro-EGFP基因没有发生缺失或者突变。然而，在连续传代过程中并未在SK6细胞中观察到EGFP的绿色荧光。
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图 2 rHCLV-EGFP的ELISA检测结果(A)、免疫荧光(B)检测结果和第6代至第10代病毒Npro-EGFP基因RT-PCR结果(C) Fig. 2 Results of ELISA (A), immunofluorescence of rHCLV-EGFP (B) and amplified Npro-EGFP gene from viral RNA of passage 6 (P6) to P10 (B) by RT-PCR(C) |
为了进一步分析rHCLV-EGFP在连续传代过程中没有察到EGFP绿色荧光的原因，进行了Western blot试验。通过用抗EGFP单克隆抗体以及鼠抗CSFV Npro蛋白多克隆抗体(实验室制备)对拯救得到的第10代病毒的Npro蛋白和EGFP蛋白分别进行了检测。结果表明，在rHCLV-EGFP第10代病毒中，用抗EGFP单克隆抗体并未检测到Npro-EGFP蛋白信号(图 3A)，然而用鼠抗CSFV Npro蛋白多克隆抗体检测到Npro-EGFP蛋白信号，但蛋白相对分子质量比预期增加了约30 ku(图 3B)。以上结果表明，在报告病毒rHCLV-EGFP中并未检测到EGFP蛋白的表达，且Npro-EGFP融合蛋白的大小比预期增大。
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A.抗EGFP抗体；B.抗Npro抗体 A. Anti-EGFP antibody; B. Anti-Npro antibody 图 3 rHCLV-EGFP的Western blot检测结果 Fig. 3 Results of Western blot testing of rHCLV-EGFP |
笔者实验室前期研究发现，CSFV强毒Shimen株的Npro基因中插入EGFP基因后拯救得到报告病毒EGFP-CSFV，在该病毒感染的细胞中可观察到绿色荧光[26]。改进试验方案后，以C株为骨架将Shimen株的Npro基因与C株进行替换，并在Npro蛋白相同位点插入EGFP基因，构建全长感染性克隆pHCLV-Npro(SM)-EGFP。用相同的方法拯救得到嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP，并通过直接观察EGFP荧光和基因测序的方法对嵌合报告病毒进行鉴定。
荧光观察结果表明，病毒传代至第5代时，可直接在病毒感染的细胞中观察到EGFP的绿色荧光(图 4A)。同时，提取拯救的嵌合报告病毒第5代和第10代细胞上清中的病毒基因组，通过RT-PCR方法扩增Npro-EGFP融合基因。RT-PCR结果证实，在第5代和第10代转染细胞上清中可扩增得到Npro-EGFP基因(图 4B)；测序后发现，在第5代和第10代病毒中Npro-EGFP基因并没有发生缺失或者突变。以上结果表明，携带EGFP基因的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP拯救成功，在感染病毒的细胞中可以观察到EGFP的绿色荧光；并且嵌合报告病毒遗传稳定，连续传代至第10代后Npro-EGFP基因依然稳定存在，没有发生缺失或者突变。
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图 4 rHCLV-Npro(SM)-EGFP的EGFP荧光(A)、Npro-EGFP基因的RT-PCR结果(B)和Western blot检测Npro-EGFP蛋白的表达(C.抗Npro抗体；D和E.抗EGFP抗体) Fig. 4 Fluorescence of rHCLV-Npro(SM)-EGFP (A), results of amplified Npro-EGFP gene from viral RNA of passage 5 (P5) and P10 (B) by RT-PCR and Western blot testing of rHCLV-Npro(SM)-EGFP (C. Anti- Npro antibody; D and E. Anti-EGFP antibody) |
为了检测EGFP蛋白是否在嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP中表达，笔者通过Western blot的方法，利用抗EGFP单克隆抗体以及鼠抗CSFV Npro蛋白多克隆抗体对第10代病毒的Npro-EGFP蛋白进行了检测。结果证实，在第10代病毒感染的细胞中，用鼠抗CSFV Npro蛋白多克隆抗体(图 4C)以及抗EGFP单克隆抗体(图 4D)均可以检测到Npro-EGFP融合蛋白，且蛋白大小与预期相符。试验结果证实，在连续传代过程中，嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP可以稳定表达EGFP蛋白，在第5代到第10代rHCLV-Npro(SM)-EGFP均可检测到表达的Npro-EGFP融合蛋白(图 4E)。综上所述，拯救得到的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP可以表达EGFP蛋白，且在连续传代过程中，EGFP蛋白可以稳定表达。
2.5 嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP的生长特性在SK6细胞上评估rHCLV-Npro(SM)-EGFP和rHCLV-EGFP的体外生长特性。试验结果表明，在拯救的报告病毒中，EGFP基因的插入以及Shimen株的Npro基因与C株Npro基因的替换都不影响病毒的生长特性，拯救得到的rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP与rHCLV株具有相似的生长特性(图 5)。
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图 5 rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP的生长曲线 Fig. 5 The growth curves of rHCLV-EGFP and rHCLV-Npro(SM)-EGFP |
为了检验嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP和报告病毒rHCLV-EGFP在家兔体内的生物学特性，按表 2的设计进行了家兔试验，并检测了接种家兔的体温、脾中病毒的复制情况和血清中的抗体水平。结果显示，接种rHCLV-Npro(SM)-EGFP的家兔在接种后24或36 h出现发热，持续18~24 h，可判定为定型热反应；RT-qPCR结果表明，在家兔脾中检测到rHCLV-Npro(SM)-EGFP的复制；抗CSFV E2特异性抗体检测结果表明，在接种后10 d，接种rHCLV-Npro(SM)-EGFP的家兔可以产生高水平的抗CSFV E2抗体(表 2)。同时，提取接种2株报告病毒在家兔脾中的病毒RNA，经RT-PCR扩增CSFV Npro-EGFP基因并进行测序。测序结果显示，2株报告病毒在家兔体内稳定存在，病毒的EGFP基因保持完整并没有发生任何突变或者缺失(数据未显示)。然而，在接种rHCLV-EGFP在家兔中，虽然在脾中也检测到病毒的复制，接种后10 d病毒也可以诱导家兔产生高水平的抗体，但是报告病毒rHCLV-EGFP丧失了诱导家兔产生定型热的能力。以上试验结果表明，嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP具有与亲本病毒一样的生物学特性。同时，rHCLV-Npro(SM)-EGFP中插入的EGFP基因在家兔体内是稳定存在的。
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表 2 病毒接种后家兔的定型热反应、脾中病毒复制和血清转阳结果 Table 2 Fever response, viral replication, and seroconversion of the rabbits inoculated with rescued viruses |
本研究发现在C株Npro蛋白中插入外源基因EGFP能够拯救得到报告病毒rHCLV-EGFP，但无法在该病毒感染的细胞中观察到绿色荧光。然而，将C株Npro基因替换为Shimen株Npro基因再引入EGFP基因，可以在拯救得到的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP感染细胞中观察到绿色荧光。细胞试验和家兔试验均证实，嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP在细胞上具有与C株相似的生长特性，在家兔上具有与C株一致的生物学特性。由此说明，本研究构建的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP可以作为C株的报告病毒进行科学研究。
本研究利用CSFV C株反向遗传操作平台，实现了对CSFV C株的快速改造。试验中将全长感染性克隆pHCLV-Npro(SM)-EGFP转染细胞后，通过直接观察荧光的方式判定病毒是否拯救成功，相较于传统的ELISA方法和间接免疫荧光检测病毒的方法来说，操作方法更为简单，大大节约时间成本和实验耗材。
之前的研究发现，将EGFP基因引入CSFV Shimen株，经过多次传代后，CSFV Shimen株的EGFP基因仍然能够稳定表达[26]。本研究构建的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP显示出了良好的稳定性，在连续传至10代时，EGFP基因稳定存在并未发生任何突变，且EGFP蛋白在连续传代过程中稳定表达。
在本研究中，尽管来自rHCLV-EGFP的Npro-EGFP基因是没有突变的，但是在感染rHCLV-EGFP的细胞中并未观察到绿色荧光，且Npro-EGFP蛋白质相对分子质量大小比预期大30 ku。之前有报道，将EGFP基因插入猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)中，拯救的报告病毒在细胞培养过程中经多次传代后，EGFP蛋白的荧光会丧失，这可能是因为病毒第96位精氨酸突变为丝氨酸，该突变干扰EGFP生色基团的形成或者EGFP的功能[27]。Tumkosit等[28]构建了基孔肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)囊膜蛋白E1与EGFP蛋白融合的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)CHIK-VLP-EGFP，但是该VLP内化后病毒囊膜蛋白的分解导致荧光信号的丢失。由此，笔者推测rHCLV-EGFP的Npro-EGFP蛋白可能在病毒感染的细胞内EGFP蛋白因未正确折叠所以并未观察到荧光，且相对分子质量大小的改变可能会影响EGFP的生色基团的形成或EGFP的功能，这也可能是导致在rHCLV-EGFP感染的细胞中没有观察到绿色荧光的原因之一。此外，有研究报道，在C株Npro蛋白相同的位点插入猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)Cap蛋白后，Cap蛋白可以稳定表达[29]，然而在本试验中直接插入C株的EGFP蛋白却没有表达，这说明EGFP蛋白本身的结构可能影响了它在C株中的表达。值得一提的是，在C株骨架中将EGFP基因与CSFV强毒Shimen株的Npro基因融合时，EGFP蛋白得到稳定表达，这可能是由于CSFV Shimen株和C株之间Npro蛋白氨基酸序列或结构的差异影响EGFP蛋白的表达，这需要进一步研究。
通过耳缘静脉接种C株的家兔表现出持续18~24 h的定型热反应，这是C株在家兔体上重要生物学特性之一。与C株相反，CSFV强毒Shimen株不能引起家兔的定型热反应，不能在家兔的脾和淋巴组织中复制，也就是说两毒株有着迥异的生物学特性。之前的研究表明，C株的UTRs被CSFV强毒Shimen株的UTRs替换后不能诱导家兔产生定型热反应，但是会保持其免疫原性[22]，这证明C株基因组的微小改变可能会影响它在家兔体内的生物学特性但是不会影响其免疫原性。因此，Shimen株Npro基因的替换理论上可能会影响C株的生物学特性。然而，笔者的试验结果证实，rHCLV-Npro(SM)-EGFP保留了C株在家兔体内的生物学特性。
本研究构建的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP应用前景广阔。之前有学者基于CSFV报告病毒建立了简化的血清中和试验方法，使得试验操作更为简便[23]，本研究构建的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP也具有同样的效用。在国际贸易中疫苗的应用通常会导致严重的贸易限制[30-31]，因此大部分国家都采用严格的扑杀政策或者净化措施来防控猪瘟[32-34]。我国防控猪瘟的主要措施为免疫接种C株，但是现阶段该疫苗并不能区分感染动物和免疫动物之间产生血清学的差异，这种技术上的不足不利于我国猪瘟净化工作[35-36]。本研究构建的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP接种家兔后，可以诱导家兔的免疫反应，并且EGFP基因在家兔体内保持稳定，这表明在弱毒活疫苗C株中插入标记抗原是可行的，可以尝试将嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP开发为标记C株疫苗。
总之，本研究发现，将EGFP基因插入CSFV强毒Shimen株的Npro基因后，将嵌合的Shimen株的Npro基因与C株Npro基因进行替换，成功拯救得到的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP。该嵌合报告病毒感染细胞后可观察到绿色荧光，并且具有与rHCLV相似的生长特性，表明rHCLV-Npro(SM)-EGFP可以作为C株的报告病毒对病毒示踪，在研究C株的复制过程、病毒与细胞的相互作用中发挥作用；同时，rHCLV-Npro(SM)-EGFP在家兔体内具有与C株一致的生物学特性，具备发展为标记疫苗的潜力。
4 结论CSFV强毒Shimen株Npro基因替换C株Npro基因后，在Npro蛋白第13和14位氨基酸间插入EGFP基因，拯救得到的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP可以作为C株的报告病毒进行病毒的复制过程、病毒与细胞的相互作用研究，而且具备开发为标记疫苗的潜力。
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