2. 河南农业大学, 郑州 450002
2. Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是危害世界养猪业的重要病原之一，至今仍缺少有效的防控手段[1-2]。PRRSV感染后，临床主要表现为母猪的繁殖障碍及各年龄段猪严重的呼吸道症状，同时，由于其对动物机体免疫系统产生很强的免疫抑制作用，也是猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等其他病原继发感染引起严重临床疾病的重要诱发因子[2-3]。
PRRSV病毒属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)，动脉炎病毒属(Arterivirus)，为有囊膜单股正链RNA病毒[4-5]。基因组大小约15.4 kb，包含10个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，ORF1a和ORF1b编码两个多聚蛋白，经蛋白酶切割产生至少16个非结构蛋白，ORF2~ORF7分别编码GP2、E、GP3、GP4、GP5a、GP5、M和N蛋白[5-6]。其中GP5和Nsp2具有高度变异性，常用作PRRSV遗传变异及进化的分析[7-9]。
根据地域分布及遗传差异，PRRSV可以分为PRRSV-1 (European genotype，欧洲型)和PRRSV-2 (North American genotype，美洲型)[4]。PRRSV-1和PRRSV-2均在我国猪群中流行，但总体上是以PRRSV-2为主[10-13]。基因组的高度变异是PRRSV的显著遗传特征，Shi等[14]在分析了全球8 500余条PRRSV-2的ORF5序列的基础上，将PRRSV-2分为9个谱系：lineage 1~9，目前，我国流行的PRRSV-2毒株主要属于lineage 1、lineage 3、lineage 5和lineage 8[10-11, 14]。Lineage 1(NADC30-like)自2013年在我国报道以来，已在我国猪群中广泛流行，且该毒株很容易和我国流行的高致病性毒株(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)发生基因重组，极大增加了PRRSV的遗传变异及临床流行毒株的复杂性[10, 15-16]。本实验室2017年从河南漯河地区的临床病料中分离到1株PRRSV，为更好地了解该毒株的分子特征，笔者对该毒株进行了全基因组测序，并利用生物信息学软件分析了其基因组的遗传变异特征。
1 材料与方法 1.1 毒株HeNLH2017毒株由本实验室从2017年河南漯河地区临床病料中分离获得。
1.2 主要试剂病毒核酸提取试剂MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、反转录试剂PrimeScriptTM RT Master Mix和高保真DNA聚合酶PrimeSTAR® Max DNA Polymerase等购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit购自Omega Bio-tek, Inc.；cDNA末端快速扩增试剂SMARTer RACE 5′/3′Kit购自Clontech Laboratories；pEASY®-Blunt Cloning kit购自北京全式金生物技术有限公司。
1.3 病毒核酸提取及RT-PCR取第5代病毒感染猪原代肺泡细胞的培养物，提取病毒RNA，然后按照反转录试剂的说明书进行反转录，合成cDNA。以获得的cDNA为模板，扩增PRRSV的基因组片段，具体反应体系及条件如下：25 μL反应体系，模板cDNA 2 μL，上下游引物(5 μmol·L-1)各0.5 μL，2×高保真DNA polymerase 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：98 ℃预变性2 min；98变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃依据2 kb·min-1确定延伸时间，共30个循环；最后72 ℃扩增5 min。按照SMARTer RACE 5′/3′Kit的说明书扩增5′和3′的非翻译区序列。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.4 引物合成与序列测定全基因组序列扩增的引物主要参考已有的文献报道(表 1)[17]，引物序列均由生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，连接至pEASY®-Blunt载体中，然后转化DH5α感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB平板，37 ℃培养箱过夜。菌落PCR筛选阳性克隆，最后每个样品选择3份阳性克隆送生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
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表 1 扩增PRRSV全基因组的引物序列 Table 1 The primers used for amplification of the PRRSV genome sequence |
使用NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)进行糖基化位点的预测分析。利用DNAstar MegAlign(Clustal W method)软件进行序列同源性分析和氨基酸序列的多重比对分析。利用MEGA6.0软件邻位法(Neighbor-joining tree with 1 000 bootstrap)构建系统进化树[18]。利用重组分析软件Recombination Detection Program v.4.24 (RDP 4.24)和Simplot 3.5.1对HeNLH2017毒株可能的重组事件进行检测和分析[19]。本研究中用到的毒株序列信息见表 2。
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表 2 本研究所用到的毒株序列信息 Table 2 The sequence information in this study |
通过RT-PCR和RACE技术成功扩增到目的片段(图 1)，经克隆测序后，成功获得了HeNLH2017毒株的全长基因组序列，并提交至GenBank数据库(GenBank No. MN823730)。HeNLH2017基因组全长15 054 bp，包含长度为197 bp(1—197)的5′非翻译区和178 bp(14 876—15 054)的3′非翻译区。中间开放阅读框包括ORF1a (198—7 316, polyprotein 1a)、ORF1b (7 304—11 686, polyprotein 1b)、ORF2 (11 688—12 458, glycoprotein GP2)、ORF3(12 311—13 075, glycoprotein GP3)、ORF4 (12 856—13 392, glycoprotein GP4)、ORF5 (13 403—14 005, glycoprotein GP5)、ORF6 (13 990—14 514, membrane protein M)和ORF7 (14 504—14 875, nucleocapsid protein N)。
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A. RT-PCR扩增(M.DNA相对分子质量标准；1~6分别为N1~N6对应的基因片段)；B. RACE扩增(M.DNA相对分子质量标准；1. 5′非翻译区序列；2.3′非翻译区序列) A. RT-PCR (M.DNA marker; Lane 1-6. products of N1-N6); B. RACE (M.DNA marker; 1. 5′ untranlated sequence; 2. 3′ untranlated sequence) 图 1 HeNLH2017基因序列的扩增 Fig. 1 The genome sequence amplification of HeNLH2017 |
全基因组及各基因序列的同源性分析见表 3，HeNLH2017基因组与其他代表性毒株VR-2332、NADC30、CH-1a、JXA1和QYYZ的核苷酸相似性分别为84.5%、93.4%、84.2%、83.9%和82.1%。同时，各个基因序列也均与NADC30具有较高的相似性[nt/aa, (88.5%~98.5%)/(86.2%~100.0%)]，提示HeNLH2017可能为类NADC30毒株。具体来说，非结构蛋白Nsp1-2、Nsp7与其他代表性毒株之间基因序列相似性较低[nt/aa, (75.2%~84.0%)/(67.0%~86.1%)]，遗传变异较大，而Nsp3-6、Nsp8-12的序列相似性则相对较高[nt/aa, (80.6%~91.7%)/(88.7%~100.0%)]；结构蛋白中，GP3和GP5与其他毒株之间序列差异较大[nt/aa, (81.3%~86.9%)/(78.4%~86.1%)]，而GP2、GP4、M和N的基因序列则相对较为保守[nt/aa, (84.4%~89.8%)/(86.4%~93.7%)]。
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表 3 分离株与代表性毒株的相似性 Table 3 The similarity of the isolate with the other representative strains |
为进一步确定HeNLH2017与其他毒株的遗传进化关系，笔者利用MEGA6.0邻位法(Neighbor-joining method)分别构建了基于GP5和Nsp2高变区的系统进化树，如图 2所示，我国流行的PRRSV-2毒株分为lineage 1、lineage 3、lineage 5和lineage 8，HeNLH2017毒株与NADC30-like毒株处于同一进化分支，属于lineage 1。
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●.分离株HeNLH2017 ●.The isolate HeNLH2017 图 2 基于GP5序列(A)和Nsp2高变区序列(B)构建的系统进化树 Fig. 2 The phylogenetic analysis based on amino acid sequences of GP5 gene (A) and partial Nsp2 gene (B) |
ORF5编码PRRSV的主要囊膜蛋白GP5，是一个变异很大的基因，常被用作研究PRRSV遗传变异和进化演变的参考基因。GP5氨基酸序列比对分析显示(图 3)，与其他参考毒株相比，第15P、47I、121V、168D和192I是NADC30-like毒株特有的保守氨基酸位点。NADC30-like毒株GP5 N端主要线性表位分析显示，与广谱性中和抗体相关的抗原表位epitope B(37SHLQLIYNL45)序列相对较为保守，而诱骗表位epitope A(27—30 aa)和与同源中和性抗体相关的抗原表位epitope C(52—62 aa)则存在较大的氨基酸位点变异，分离株HeNLH2017具有独特的epitope A(27ALAT30)和epitope C(52GTDWLNKKFDW62)序列。在已证实的糖基化位点中，N44和N51在所有毒株中均高度保守，而30—35位的氨基酸位点则存在较大的差异，NADC30-like毒株的糖基化位点主要在34位。
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▼.糖基化位点；*. NADC30-like毒株保守的氨基酸位点 ▼. Glycosylated sites; *. The conserved sites of NADC30-like strains 图 3 GP5蛋白氨基酸序列比对 Fig. 3 The amino acid alignment of GP5 protein |
Nsp2是PRRSV基因组中变异最大的非结构蛋白，常伴随着核苷酸序列的插入和缺失，因此是PRRSV重要的分子遗传标志，Nsp2高变区序列比对显示(图 4)，分离株HeNLH2017在323—433位、483位、504—522位具有NADC30-like毒株特征性的131个不连续氨基酸的缺失。
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图 4 Nsp2高变区氨基酸序列比对 Fig. 4 The amino acid alignment of hypervariable regions of Nsp2 |
PRRSV基因组具有较高频率的基因重组现象。笔者利用RDP 4.24分析了HeNLH2017是否存在基因重组，结果显示HeNLH2017可能是主要亲本类NADC30和次要亲本类JXA1的重组病毒(表 4)；进一步利用Simplot 3.5.1软件分析确定了具体发生重组的位点(图 5A)，位于Nsp2区(1 340—2 082 nt)，与之相一致的是该区域(1 340—2 082 nt)与JXA1对应序列的相似性为98.6%，而与NADC30对应序列的相似性仅为78.3%；进一步的系统进化树分析显示，重组位点(1 340 nt)前和重组位点(2 082nt)后的区域与NADC30-like毒株处于同一进化分支(图 5B)，而重组区(1 340—2 082 nt)与JXA1-like毒株处于同一进化分支(图 5C)。
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表 4 利用RDP4.0软件分析HeNLH2017的基因重组 Table 4 The recombination events detected by RDP4.0 |
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A.利用Simplot 3.5.1软件分析重组位点；B.基于重组区以外的序列(1—1 339、2 083—15 054)构建的系统进化树；C.基于重组区序列(1 340—2 082)构建的系统进化树 A. The breakpoints were determined by Simplot 3.5.1 software; B. The phylogenetic tree based on the regions of 1-1 339 and 2 083-15 054; C. The phylogenetic tree based on the recombination regions (1 340-2 082) 图 5 HeNLH2017基因重组分析 Fig. 5 The recombination analysis of HeNLH2017 |
自我国在1995年首次报道PRRS以来，PRRSV在我国猪群中已广泛流行20余年，并呈现出很大的遗传多样性和致病性差异[2, 13, 20-21]。根据Shi等[22]提出的PRRSV-2全球分类系统，我国流行的PRRSV毒株主要属于PRRSV-2的4个谱系：lineage 1、lineage 3、lineage 5和lineage 8[22]。其中lineage 5以VR-2332、BJ-4为代表性毒株，尽管1996年就报道了该谱系毒株在我国的流行[23]，但是临床检出率一直很低，该类毒株很可能是弱毒疫苗RespPRRS MLV的衍生毒株[10, 24]；Lineage 8以CH-1a和JXA1为代表，CH-1a-like毒株主要在1995-2005年流行，而JXA1-like毒株主要从2006年开始，在我国猪群中广泛流行，因该类毒株对猪表现为强的致病性，临场表现为高的致死率，因此也称为高致病性毒株(HP-PRRSV)，目前比较一致的观点是HP-PRRSV是由我国CH-1a-like毒株在流行过程中不断变异而产生的[3, 10, 25]。Lineage 3则主要在我国南方(如福建、广东、广西等)地区流行，代表性毒株——GM2、QYYZ是在2010年从广州地区分离获得的[26]。Sun等[20]最新的研究显示，最早在1988年我国台湾地区报道的PRRSV毒株序列属于lineage 3，因此，lineage 3很可能是由台湾地区传播到东南沿海地区，而后向内陆地区扩散的。Lineage 1主要以JL580和CHsx1401为代表，因与北美地区流行毒株NADC30遗传关系很近，该类毒株很可能是由北美地区输入我国的，在我国也称为类NADC30毒株，该类毒株自2013年在我国首次报道以来，目前已在我国猪群中广泛流行[15-16, 27-30]。在一些地区已经取代HP-PRRSVs, 成为田间流行的优势毒株[24]。因此，做好PRRSV流行的临床监测检测工作，对于把握PRRSV遗传变异规律，有针对性地制定预防控制策略具有重要意义。
本实验室从2017年的临床病料中分离到1株PRRSV，为更好地了解该毒株的遗传变异特点，进行了全基因组序列的测定和分析。结果显示，该毒株和NADC30的核苷酸相似性为93.4%，而与VR-2332、CH-1a、JXA1和QYYZ的相似性分别为84.5%、84.2%、83.9%和82.1%。基于系统进化树分析显示，该毒株和NADC30处于同一进化分支，属于lineage 1。GP5是主要的囊膜糖蛋白，常作为分析PRRSV进化演变的靶基因，并且与PRRSV的免疫保护和逃逸具有一定的关系[15, 31]。已有的研究显示，GP5蛋白N端有3个线性抗原表位：Epitope A(27—30 aa)也称为诱骗表位(decoy epitope)，可以诱导早期大量非中和性抗体的产生；Epitope B(37—45 aa)的氨基酸序列具有较高的保守性，目前认为是一个广谱性中和抗体表位；Epitope C(52—62 aa)主要诱导同源中和性抗体的产生，与PRRSV感染过程中的反弹及持续性感染具有一定的关系[31-32]。与其他毒株相比，分离株HeNLH2017具有独特的epitope A(27ALAT30)和epitope C(52GTDWLNKKFDW62)序列，其生物学意义有待进一步的研究。此外，糖基化位点也与病毒的感染或免疫逃逸相关，分离株HeNLH2017在34位、44位和51位发生了糖基化，其中44和51位两个位点的糖基化高度保守，30—35位糖基化位点则不同毒株之间存在较大差异。糖基化位点或数目的变化可能会影响中和抗体与相关表位的结合[15, 32]。
Nsp2是PRRSV基因组中变化最大的基因，常伴随着核苷酸片段的插入或缺失，可以作为一些毒株的遗传标志，如HP-PRRSV毒株的Nsp2有30个(481，533—562)不连续氨基酸的缺失[33]；QYYZ-like毒株在300—301位缺失两个氨基酸，而在815—850位有36个氨基酸的插入[2]。分离株HeNLH2017的Nsp2具有131个(323—433，483，504—522)不连续氨基酸的缺失，这与NADC30-like毒株的序列缺失模式一致。
PRRSV易发生基因重组[9, 34]，特别是类NADC30毒株出现以后，与我国田间流行的毒株发生了广泛的基因重组，包括与HP-PRRSV毒株(JXA1)、经典毒株(CH-1a、VR-2332)、疫苗衍生毒株(TJM-like、JXA1-P80)等[10, 29, 35-36]，最近也有报道在多个谱系之间的基因重组，如Zhou等[35]报道了两株在lineage 8 (JXA1)、lineage 1(NADC30)和lineage 3(QYYZ)之间发生多个位点重组的毒株；Liu等[37]报道了一株在lineage 1、lineage 3、lineage 5和lineage 8四个谱系之间发生基因片段重组的毒株[37]。Yu等[38]系统分析了我国1991—2018年间PRRSV-2毒株间的基因重组现象，发现1991—2013年谱系间的毒株重组区域易发生在Nsp1和Nsp11区域，而2014—2018年谱系间的毒株重组更易发生在Nsp9和GP2-GP3区域；同样，亲本毒株也发生了相应的变化，1991—2013年所利用的亲本毒株分属于多个谱系(lineage 1、lineage 3、lineage 5和Lineage 8)，而2014—2018年则逐步演变为以lineage 1和lineage 8为主要亲本或次要亲本；而谱系内毒株之间的基因重组则没有明显的热点区域[38]。本研究确定分离株HeNLH2017也是1株重组毒株，且以NADC30(lineage 1)为主要亲本、JXA1(lineage 8)为次要亲本，重组区位于Nsp2(1 340—2 082 nt)，本研究进一步补充了lineage 1和lineage 8之间毒株可能发生基因重组的区域。基因重组现象的频繁发生极大增加了我国PRRSV毒株遗传变异的复杂性及致病性的差异，基因重组毒株在田间的广泛流行对PRRSV的诊断和防控构成了很大的挑战。
4 结论成功测定、分析了1株类NADC30毒株的基因组遗传特征，进一步确定了其在Nsp2(1 340—2 082 nt)区和类JXA1毒株发生了基因重组。提示PRRSV通过基因重组在不断发生遗传演化，开展持续的PRRSV流行及遗传变异监测对于该病的防控具有重要意义。
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