2. 山东省诸城市畜牧兽医管理局, 诸城 262200
2. Shandong Zhucheng Animal Husbandry and Veterinary Administration, Zhucheng 262200, China
细胞氨基酸转运载体蛋白的表达水平一般取决于其mRNA的表达量，从而反映细胞转运氨基酸的能力[1]。Humphrey等[2]发现，由于日粮营养水平的不同，动物对营养物质的吸收通常以营养转运载体类型以及数量变化的方式进行调控。动物对蛋白质的吸收利用依赖于小肠组织氨基酸和小肽转运载体的转运。碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1在机体的生长发育中发挥着重要的作用，其参与编码的rBAT蛋白是动物b0, +碱性氨基酸转运系统的重要组成部分。迄今为止，对于小肽转运载体SLC15A1的研究主要集中于其组织分布、体外培养条件下的功能特性和其基因结构与蛋白质结构的分析以及各种激素等对其的调节作用[3-5]，关于日粮能量和蛋白质水平对其表达影响的报道还很少。山羊对营养物质的吸收和利用，特别是对氨基酸的吸收利用受到日粮能量和蛋白水平的影响。本试验旨在研究饲喂不同能量和蛋白水平日粮对陕北白绒山羊小肠组织SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1等相关转运载体基因mRNA表达的影响，为揭示反刍动物蛋白吸收机制和日粮优化配制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验处理试验在陕西省榆林市横山区县陕北白绒山羊原种场进行。选取日龄(54±1.60) d、体重(10.23±1.03) kg的健康陕北白绒山羊断奶母羔36只，随机分为4组，每组3个重复，每个重复3只羊[6]。按生长阶段(60~120日龄、121~180日龄)分别饲喂消化能和粗蛋白水平为标准日粮85%、100%、115%和130%的试验日粮。预试期6 d，60日龄开始正式试验至180日龄[6]。试验羊每日投料3次(8:00、13:00、18:00)，自由采食，自由饮水。除试验日粮外，各处理组的饲养管理条件相同。
1.2 试验日粮参考NY/T816—2004肉羊饲养标准，根据增重目标分阶段【10~19 kg(60~120日龄)、15~27 kg (121~180日龄)】设计配方配制标准日粮及消化能和粗蛋白水平为标准日粮的85%、115%和130%(其他营养成分含量基本一致)的试验日粮[7]。各组日粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 试验日粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 The composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
1.3.1 生长性能测定 在正式试验的开始(60日龄)、第一阶段(120日龄)和第二阶段(180日龄)结束当天，晨饲前各组试验羊以重复为单位空腹称重，试验期间准确记录每日采食量，计算平均日增重(ADG)和料重比(F/G)[7]。
平均日增重=(试验末重-试验初始重)/试验天数[6]；试验期羊采食量=试验期内每组羊总给料量-试验期内每组羊总剩料量[6]；
平均日采食量(DMI)=试验期采食量/试验天数[6]；
料重比=平均日采食量/平均日增重[6]。
1.3.2 小肠组织样采集 试验结束后，每个重复选取1只试验羊颈动脉放血至死，分别采集十二指肠、空肠中段、回肠末端组织样品(大小约3 cm2)，于-80 ℃保存备用[6]。
1.4 总RNA提取、cDNA合成以及以及引物设计与合成取各段小肠组织样品，35~55 mg的样品进行总RNA的提取，按照Eastep® Super总RNA提取试剂盒说明操作，提取总RNA，于-80 ℃保存备用[6]。按照Thermo反转录试剂盒(Prime Script TMRTMaster Mix)合成cDNA，于-20 ℃保存备用[6]。
参照GenBank公布的山羊β-actin、SLC7A7、SLC3A1、SLC15A1的mRNA序列，用Primer Primer 5.0软件设计引物，并用Primer-BLAST软件进行引物特异性鉴定，引物序列信息见表 2[8-9]。引物由至西安奥科生物科技有限公司合成，其中山羊β-actin为内参基因。
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表 2 引物序列信息 Table 2 Information of primer sequences |
以山羊β-actin为内参基因，通过荧光染料TB Green TM Premix Ex TaqTMⅡ实时荧光定量PCR测定不同肠段组织SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA的相对表达量[6]。实时荧光定量PCR反应体系为25 μL:上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，2×TB Green TM Premix Ex TaqTMⅡ×12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。将反应体系各物质混合均匀后，进行实时荧光定量PCR，反应程序为：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，进行40个循环；最后进行熔解曲线分析，温度为55~95 ℃[6]。根据熔解曲线是否为单峰判断反应的特异性[6]。将所有样品进行标准化校正，采用2-ΔΔCT法计算SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA的相对表达量。
1.6 数据统计与分析数据以“平均值±标准误(Mean±SE)”表示，n=3，用SPSS23.0统计软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，Duncan′s法进行多重比较，以P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著[6]。
2 结果 2.1 日粮营养水平对陕北白绒山羊断奶羔羊生长性能的影响日粮营养水平对陕北白绒山羊断奶羔羊生产性能的影响见表 3，由表 3可知，第一阶段(60~120 d)115%水平组平均日增重显著高于其他3个水平组(P < 0.05)，第二阶段(121~180 d)115%水平组平均日增重显著高于85%和100%水平组(P < 0.05)，与130%水平组无明显差异。两阶段115%水平组羔羊干物质采食量极显著高于其他三组(P < 0.01)。两阶段料重比115%水平组的显著低于85%、100%水平组(P < 0.05)。
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表 3 日粮营养水平对陕北白绒山羊断奶羔羊生长性能的影响[6] Table 3 Effects of dietary nutrition levels on growth performance of weaned lambs of Shaanbei white cashmere goats[6] |
日粮营养水平对陕北白绒山羊小肠组织SLC7A7mRNA表达量的影响见图 1。由图 1可知，SLC7A7mRNA在小肠各部位的表达量均以115%水平组最高，显著高于其他三组(P < 0.05)，100%水平组显著高于85%和130%水平组(P < 0.05)。各处理组SLC7A7mRNA在小肠各段的表达模式基本一致，均为回肠>空肠>十二指肠。
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同一组织柱图上标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)。下同 Different lower-case letters over the bars of same tissue means significant difference among the treatments(P < 0.05), different capital letters over the bars of same tissue mean extremely significant difference among treatments(P < 0.01). The same as below 图 1 日粮营养水平对陕北白绒山羊SLC7A7 mRNA表达量的影响 Fig. 1 Effects of dietary nutrition levels on SLC7A7mRNA expression level of Shaanbei white cashmere goats |
日粮营养水平对陕北白绒山羊小肠组织SLC3A1 mRNA表达量的影响见图 2。由图 2可知，SLC3A1 mRNA在小肠各部位的相对表达量均以115%水平组最高，显著高于85%和130%水平组(P < 0.05)，85%、100%以及130水平组之间差异不显著(P>0.05)。各处理组SLC3A1 mRNA在小肠各段的表达模式基本一致，均为回肠>十二指肠>空肠。
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图 2 日粮营养水平对陕北白绒山羊SLC3A1 mRNA表达量的影响 Fig. 2 Effects of dietary nutrition levels on SLC3A1 mRNA expression level of Shaanbei white cashmere goats |
日粮营养水平对陕北白绒山羊小肠组织SLC15A1 mRNA表达量的影响见图 3。由图 3可知，SLC15A1 mRNA在小肠各部位表达量均以115%水平组最高，显著高于其他三组(P < 0.05)，100%水平组显著高于85%和130%水平组(P < 0.05)，85%和130%水平组之间差异不显著(P>0.05)。各处理组SLC15A1 mRNA在小肠各段的表达丰度顺序均为回肠>空肠>十二指肠。
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图 3 日粮营养水平对陕北白绒山羊SLC15A1 mRNA表达量的影响 Fig. 3 Effects of dietary nutrition levels on SLC15A1 mRNA expression level of Shaanbei white cashmere goats |
营养物质的吸收量是影响羔羊生长发育的主要因素，由日粮营养水平、采食量和动物对营养物质的消化率决定。日粮营养水平，特别是能量水平会影响动物的采食量[7]。对于反刍动物而言，当日粮能量水平过低时，动物只有通过采食更多的饲料来满足自身需要，此时物理调节机制作用最大；当能量浓度超过一定的阈值(绵羊DE约10.5 MJ·kg-1)时，过高的能量会限制瘤胃微生物的发育，从而降低对日粮的摄入，此时化学调节作用最大[7]。张振伟[8]在中卫山羊羯羔羊上研究表明，在日粮消化能水平为8.71、9.53和10.41 MJ·kg-1时，干物质采食量呈现先升高后降低的趋势。一般来说，在合理范围内日粮蛋白质水平不会显著影响反刍动物的干物质采食量，因为蛋白质水平不会改变食糜在胃肠道的流通速率[9-10]。但是日粮蛋白水平过低会降低采食量，减少消化酶合成量，并抑制瘤胃细菌的发酵作用；日粮蛋白质过高热增耗增加，动物也会通过反馈机制降低采食量[7]。日粮能量与蛋白质水平对反刍动物瘤胃微生物的生长和瘤胃内环境的稳定非常重要[11-12]。断奶羔羊瘤胃微生物区系已逐渐形成，此时饲喂适宜营养水平的日粮有利于充分发挥羔羊的生产潜力，提高饲料利用率[13]。王永军等[14]研究证实，当日粮营养水平一定范围内增加时，断奶羔羊平均日增重与干物质采食量均随之上升。本试验正是基于稳定能蛋比的原则设置了标准日粮消化能和粗蛋白质水平的85%、100%、115%、130% 4个日粮营养水平，结果表明，日粮能量和蛋白质水平过低时(85%组)，难以满足瘤胃微生物对氮源的需求，同时降低了碳水化合物在瘤胃中的利用率。随着日粮能量水平的适量升高，羔羊的采食量也相应提高，羔羊平均日增重随之提高，本试验条件下日粮水平115%组达到峰值，当日粮能量和蛋白质水平为130%时，羔羊的平均日增重以及干物质采食量略有下降，但差异不显著。说明本试验日粮营养水平梯度设置基本合理，可以推断1.15倍的基础日粮营养水平对2~6月龄陕北白绒山羊羔羊具有较佳的增重效果。
3.2 日粮营养水平对陕北白绒山羊小肠组织中SLC7A7、SLC3A1与SLC15A1 mRNA表达量的影响肠道是动物消化吸收养分的重要场所，肠上皮细胞营养物质转运载体的表达丰富度直接影响养分的吸收。氨基酸和小肽转运载体的表达量在不同组织存在差异性，相同组织在不同发育阶段表达丰富度也各不相同[15]。
蛋白质在肠道最终的吸收机制主要有两种，一是由特异性的氨基酸转运载体系统转运游离氨基酸，另一种是由寡肽转运载体(peptide transporter，PepT)转运寡肽[16-17]。氨基酸与小肽的转运与多种因素的共同调节有关，其转运载体表达量可能受物种发育程度、饲粮营养水平、不同生长阶段以及相关激素调节等的影响[18]。SLC15A1一方面在肠道内对小肽的吸收起重要作用，另一方面对氨基酸转运以及机体免疫也存在一定影响[19]。肠道中小肠吸收氨基酸和小肽的能力与日粮营养水平有着密切关系。试验证明，SLC15A1的表达受蛋白质消化产物的影响，底物含量过多或过少都会增加SLC15A1的表达[20]。当底物浓度较高时会增加转运载体的数量和活性来增加对营养物质的转运，充分吸收利用底物，而低浓度时，机体又有一种补偿机制来增加载体的表达，供机体对营养物质的吸收，保证正常生命活动的需要[15]。高浓度的小肽底物可以促进小肠对SLC15A1 mRNA的转录，从而加快了小肠对小肽和氨基酸的转运吸收速率，如肠道中谷氨酸-谷氨酰胺二肽的增加可促进SLC15A1 mRNA的表达量和甘氨酸-肌氨酸二肽的吸收[21]。Pickel等[22]研究表明，日粮蛋白质含量增加时，Ⅰ型肽载体的基因表达量呈上调趋势。Ferraris和Diamond[23]研究发现，相比18%的蛋白饲料，72%的高蛋白饲料会使小鼠空肠对二肽的吸收量提高30%~70%。Chen等[24]研究结果表明，肉仔鸡饲喂12%粗蛋白质饲粮组肠道SLC15A1 mRNA的表达丰富度显著低于18%和24%处理组。Hyde等[25]研究发现，低蛋白质日粮条件下，大鼠肠道部分氨基酸吸收量下降，如赖氨酸、天冬氨酸。Karasov等[26]研究表明，高蛋白质日粮条件下，大鼠肠道多种氨基酸载体吸收转运量均增加，包括必需氨基酸和非必需氨基酸。Pácha[27]却认为，单位面积肠道组织对氨基酸转运能力的下降与肠道内氨基酸总质量的不断增加有关。但过高的日粮营养水平又会降低小肠各段转运载体的表达，原因可能是随着饲粮能量和蛋白质水平的提高，肠道中可消化蛋白质含量增加，氨基酸底物浓度也随之升高，在一定范围内，小肠中转运载体的表达量随着底物浓度的升高而增加，当饲粮蛋白质水平过高时，肠道内氨基酸底物浓度达到饱和，就会出现负反馈调节，小肠中转运载体的表达量随之降低[28]。本试验结果显示，日粮营养水平对小肠各段SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA表达量的影响趋势基本一致，均呈先升高后降低的趋势，115%水平组达到峰值，这也从消化吸收层面上揭示了115%水平组日粮具有较好的日增重和料重比的机制。
蛋白质消化主要依靠胰腺分泌的各类蛋白酶，十二指肠是胰蛋白酶的释放部位，随着食糜流动，蛋白质消化产物小肽和氨基酸在空肠逐步释放，在回肠进行吸收。孙雅君等[29]研究发现，18月龄小尾寒羊SLC15A1 mRNA在小肠各段的表达量由高到低依次为回肠、空肠、十二指肠，且这三个部位表达量差异不显著。周英昊等[30-31]在陕北白绒山羊上的研究发现，相同月龄山羊SLC3A1 mRNA在不同肠段的表达量回肠＞空肠＞十二指肠，SLC7A7 mRNA表达量同样在回肠最高。甄玉国等[32]研究证实，SLC15A1 mRNA在杂交绵羊与荷斯坦奶牛各部位表达量由高到低依次为回肠、空肠、十二指肠和瘤胃。徐晓锋等[33]研究表明，回肠为绵羊吸收游离氨基酸的主要部位。本试验结果显示，相同日粮营养水平下SLC15A1 mRNA与SLC7A7 mRNA表达量在小肠各段表现为回肠＞空肠＞十二指肠，与上述研究结果相同。而张吉顺等[34]通过在外界处理无差异条件下对6月龄湖羊小肠不同部位SLC15A1 mRNA的相对表达量进行定量分析，结果显示由高到低依次为空肠、回肠、十二指肠，且表达量差异极显著，与本试验研究结果不符。造成差异的原因可能有两方面：一是选取试验对象的不同，陕北白绒山羊和湖羊由于地理条件及环境因素使其肠道发育模式存在差异，进而导致小肠各段SLC15A1 mRNA的表达量存在差异；二是试验处理因素不同，本试验饲喂不同营养水平日粮，张吉顺等[34]处理因素为饲喂相同营养水平日粮湖羊的不同组织，由于试验日粮不同，使机体小肠底物浓度不同，进而可能导致小肠各段SLC15A1 mRNA表达量存在差异。
4 结论日粮营养水平对陕北白绒山羊2~6月龄断奶羔羊生长性能及其小肠内氨基酸及小肽转运载体SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA的表达具有显著影响，本试验条件下，日粮消化能和粗蛋白水平为标准日粮的115%时，陕北白绒山羊平均日增重与料重比最优，同时，小肠组织中与氨基酸和小肽转运吸收相关的三个基因SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA在小肠各段的表达量最高。
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