血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是2000年发现的一种糖蛋白，在大多数组织中都有表达[1]。ACE2可有效地将血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)降解为血管紧张素1-7(Ang1-7)，与Ang(1-7)和Mas受体共同构成ACE2-Ang(1-7)-MasR轴，成为肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)的另一重要分支。该轴能与经典的ACE-AngⅡ-AT1轴相互拮抗，作为治疗高血压、糖尿病和心血管等许多疾病中的靶点，为开发新的治疗方案提供了可能性[2-3]，多年的研究己证实，ACE2在心肌损伤、肺损伤、糖尿病肾损伤、肝损伤及肠道腹泻炎症等病理过程中具有抗损伤作用[4-8]。ACE2还在协同氨基酸转运载体转运、促进氨基酸吸收、维持肠道微生态平衡和对抗胃肠道炎症等方面发挥重要作用[9-10]。ACE2作为一个新的疾病标志物或药物治疗新靶点在人类医学上受到关注。
新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，是指2019新型冠状病毒感染导致的肺炎，经过对病毒基因组测序发现，COVID-19和已知的6个新型冠状病毒基因序列几乎一致，并且从同源性来看，与SARS-CoV的同源性最高，将其归为Beta型冠状病毒属[11]。冠状病毒是一类主要引起呼吸道、肠道疾病的病原体，除人类外，还可感染猪、牛、猫、犬、貂、骆驼、蝙蝠、老鼠、刺猬等多种哺乳动物及鸟类[12]。ACE2已被确定为SARS-CoV的功能受体和COVID-19的可能受体[3, 13]，研究多种动物ACE2序列差异对于防控冠状病毒跨种族传播的重要性不言而喻。然而，目前在GenBank中，有关ACE2序列报告的物种主要集中在哺乳动物和啮齿动物，尚缺乏鸭等水禽动物ACE2的序列资料，相关的研究相对滞后，尚没有文献报道。
本研究以中国麻鸭为研究对象，得到中国麻鸭ACE2基因序列片段，利用生物信息学方法，对获得的中国麻鸭ACE2基因结构进行系统发育、ACE2蛋白理化性质、高级结构、磷酸化位点等的预测和解析。为ACE2在水禽方面的研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料随机选取8只14周龄市售健康中国麻鸭，颈部放血处死，迅速采集心、肝、肺、肾、十二指肠、空肠、盲肠、直肠、回肠、睾丸组织，用0.9%生理盐水冲洗干净后放于液氮中，后转移至－80 ℃冰箱。
1.2 主要仪器与试剂DYY-8C型电泳仪(美国)；Biometra TAdvanced qPCR仪(德国)；Tanon-3900全自动化学发光图像分析系统(美国)；Polytron 1200CL匀浆器(瑞士)；5804R低温离心机(Eppendorf，德国)；Nandrop2000核酸蛋白分析仪(Eppendorf，德国)；DOXVN立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司)等。
Trizol购自诺唯赞生物科技有限公司(中国，南京)；pMD-19T(含SolutionⅠ试剂)载体、DL5000 DNA Marker、Premix Taq酶购自宝生生物工程(中国，大连)有限公司；Trans Start Fast Pfu DNA Polymerse购自北京全式基因(中国，北京)公司；DNA快速琼脂糖回收试剂盒购自康为世纪生物公司(中国，北京)；DH5α感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司(中国，北京)等。ACE2、β-actin蛋白一抗及相应二抗(鼠抗、兔抗IgG)均购自南京巴奥德生物技术有限公司(中国, 南京)。
1.3 方法 1.3.1 ACE2在中国麻鸭体内的基因和蛋白表达1.3.1.1 中国麻鸭各组织中ACE2基因的表达检测 1) 组织总RNA提取及反转录产物合成。随机取约100 mg麻鸭各组织，彻底匀浆后参照Trizol (Invitrogen，USA)操作步骤分别提取麻鸭各组织总RNA，采用二步法反转录，反转录具体步骤按照反转录酶试剂盒说明书进行，－20 ℃保存所得cDNA。
2) 引物设计。利用Primer Premer5.0软件，根据GenBank中预测的绿头鸭ACE2基因序列(XM-013094461.3)设计RT-PCR引物，如表 1，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
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表 1 RT-PCR引物序列及预期PCR产物长度 Table 1 RT-PCR primer sequences and expected product size |
3) PCR扩增。将RNA反转录成获得的cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系(25 μL)。反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min15 s，72 ℃彻底延伸5 min，32个循环。PCR反应结束后取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.1.2 中国麻鸭各组织中ACE2蛋白表达检测 ACE2蛋白在冠状病毒的跨物种传播中起重要作用，为检测ACE2基因在中国麻鸭体内是否表达为蛋白质，为后期研究该蛋白在鸭上的生理功能奠定基础，对已检测到ACE2基因的心、肝、肺、肾的组织蛋白进行提取，BCA法测定各组织蛋白浓度，将各组织蛋白稀释至统一浓度进行SDS-PAGE电泳，湿转法将凝胶上的相应条带转至PVDF膜上，转印条件为100 V, 90 min。转印后将条带在5%脱脂奶粉中室温封闭2 h，洗掉脱脂奶粉后，分别加入羊抗兔ACE2蛋白一抗(1:3 000倍稀释)和羊抗兔β-actin内参白蛋白一抗(1:10 000倍稀释)，4 ℃过夜，洗膜后，转入辣根酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1:10 000倍稀释)，室温2 h，TBST洗涤，显色后于全自动成像发光系统中拍照。具体方法参照Wang等[14]方法。
1.3.2 ACE2 cDNA基因克隆1.3.2.1 ACE2引物的设计 根据GenBank公布的绿头鸭ACE2的预测序列(XM_013094461.3)设计一对全基因引物，上下游引物分别插入BamH I和Hind Ⅲ酶切位点(见表 2下划线处)，引物序列见表 2，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
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表 2 基因的引物序列 Table 2 Primer sequence |
1.3.2.2 中国麻鸭ACE2 cDNA基因扩增及扩增产物的回收 将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系(50 μL)。反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，59℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 15 s，72 ℃彻底延伸5 min，35个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
DNA琼脂糖凝胶回收纯化参照试剂盒说明书进行，纯化产物-20 ℃保存。
1.3.2.3 ACE2-pMD-19T重组质粒的构建 1) 目的基因的连接。取纯化产物5 μL，加5 μL Premix Taq酶于200 μL EP管中，在PCR仪72 ℃运行10 min后，依次加入0.5 μL pMD19-T载体，4.5 μL上步反应液和5 μL SolutionI，混匀，PCR仪上连接，连接条件：16 ℃，运行14 h。连接产物-20 ℃保存。参照DH5α感受态细胞说明书，将ACE2-pMD19-T重组质粒转化按DH5α感受态细胞，扩大培养后涂布在Amp/X-Gal/IPTG LB培养基平板。
2) 目的基因的菌液PCR和酶切验证。挑取阳性菌落到加有500 μL LB培养基的EP管里，37 ℃震荡培养6 h后取菌液进行PCR验证，具体步骤同“1.3.1.1”。
提取的质粒用HindⅢ单酶切进行验证，1%琼脂糖凝胶电泳。将鉴定的阳性质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.4 中国麻鸭ACE2基因的生物信息学分析使用NCBI网站的ORF Finder预测基因开放阅读框及编码蛋白质；DNAMAN和Mega5.0软件进行同源性比对和系统进化树构建; ExPasy在线软件(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质基本理化性质；TMHMM软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行麻鸭ACE2基因编码蛋白跨膜结构分析；SignalP软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal－4.0/)进行麻鸭ACE2蛋白信号肽分析；NetPhos2.0Server在线软件对ACE2基因编码蛋白质进行磷酸化和糖基化位点预测。
2 结果 2.1 ACE2在中国麻鸭体内的基因和蛋白表达检测采用RT-PCR检测ACE2基因在中国麻鸭体内各组织的分布，检测结果如图 1A。由图 1A可知，在中国麻鸭心、肝、肺、肾组织中均有ACE2基因的单一条带(泳道1、2、3、4)，条带大小为395 bp左右，与预期(395 bp)一致。取检测到ACE2基因分布的心、肝、肺、肾组织进行Western blot，由试验结果(图 1B)可知，在这些组织中有ACE2蛋白表达，说明ACE2在中国麻鸭体内存在并有蛋白表达。
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A.中国麻鸭各组织中ACE2基因表达:M.DL2000；泳道1~13.依次为心、肝、肺、肾、十二指肠、空肠、盲肠、直肠、回肠、肌胃组织、睾丸组织、阴性对照1、阴性对照2和18S rRNA基因。B.心、肝、肺、肾中的ACE2蛋白表达(n=8) A. ACE2 gene expression in various tissues of the duck: M. DL2000; lane 1-13. heart, liver, lung, kidney, duodenum, jejunum, cecum, rectu, ileum, muscle stomach, testicular tissue, negative control 1, negative control 2 and 18S rRNA gene.B.The expression of ACE2 in heart, liver, lung and kidney (n=8) 图 1 CE2基因和蛋白在中国麻鸭组织的表达 Fig. 1 Expression of ACE2 gene and protein in China Sheldrake duck tissues |
结果如图 2，在中国麻鸭心和肝组织样品中均现单一条带，条带大小在2 000~4 000 bp之间，与预期大小(2 435 bp)一致。
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M. DL10000；泳道1.中国麻鸭心ACE2扩增产物；泳道2.中国麻鸭肝ACE2扩增产物；泳道3.阴性对照 M.DNA maker DL10000; lane 1. PCR product of ACE2 in heart; lane 2. PCR product of ACE2 in liver; lane 3.Negative control 图 2 ACE2全基因PCR扩增产物 Fig. 2 The electrophoresis of PCR product of ACE2 gene fragments |
随机挑取8个阳性菌落的菌液进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图 3A)，泳道1~8均出现单一条带，条带大小在2 000~4 000 bp之间，与预期2 435 bp一致。
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A.ACE2-pMD19T转化后单克隆菌落:M.DL10000；泳道1~8为随机挑选的阳性菌落。B.阳性菌落验证电泳图：M.DL10000；泳道1.质粒；泳道2.单酶切 A. ACE2-pMD19T transformed monoclonal colonies: M. DL10000; lanes 1-8 are randomly selected positive colonies. B. positive colony verification electrophoresis map: M. DL10000; lane 1. plasmid; lane 2. Single enzyme digestion 图 3 麻鸭基因克隆验证结果 Fig. 3 ACE2-pMD19T plasmid verification results |
酶切验证结果如图 3B所示。HindⅢ单酶切后发现有1条5 127 bp左右的条带(泳道2和5)，大小与pMD-19T载体(2 692 bp)和目的基因(2 435 bp)总和一致。因此本研究成功克隆了中国麻鸭ACE2基因的CDS序列。
2.4 中国鸭ACE2基因阳性质粒测序利用Sanger测序法对阳性质粒进行测序，结果本试验克隆得到的中国麻鸭ACE2基因cDNA全长为2 435 bp，共编码805个氨基酸(图 4)，测序结果与预测结果大小一致，表明克隆成功，并将测定的中国麻鸭ACE2 mRNA基因序列提交到GenBank，获得序列号为MK836421。
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图 4 中国麻鸭ACE2基因CDS区和编码氨基酸序列 Fig. 4 Nucleotide sequence and amino acid sequence of China Sheldrake duck ACE2 gene CDS region |
2.5.1 中国麻鸭ACE2基因序列同源性分析 通过NCBI在线网站对中国麻鸭ACE2与其他物种的ACE2核苷酸序列进行同源性分析，结果如表 3，该中国麻鸭与人的同源性为66.2%，与其它动物的同源性在60.0%~88.0%。与白羽肉鸡最高为88%。
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表 3 中国麻鸭ACE2基因同源性分析结果 Table 3 Homology analysis of China Sheldrake duck ACE2 gene |
2.5.2 中国麻鸭ACE2氨基酸同源性和分子进化分析 利用在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)对该蛋白质理化性质进行分析，结果该中国麻鸭ACE2基因编码蛋白质由805个氨基酸残基组成，其分子式C4 150H6 307N1 079O1 234S36。用DNAStar软件中MegAlign模块将克隆的中国麻鸭ACE2氨基酸序列与GenBank上收录的其他动物的氨基酸序列进行同源性分析并绘制遗传进化树，发现其与人ACE2基因编码氨基酸数量一致，均为805个氨基酸，同源性为66.4%，且处在不同分支，与其它动物的同源性在65.0%~86.9%(图 5A)。
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A.中国麻鸭与不同物种ACE2氨基酸同源性分析；B.中国麻鸭与不同物种ACE2分子进化树 A.Homology analysis of ACE2 protein; B.Biological phylogenetic tree of ACE2 gene among different species 图 5 中国麻鸭ACE2氨基酸同源性和分子进化分析 Fig. 5 Homology analysis and biological phylogenetic tree of ACE2 |
2.5.3 中国麻鸭ACE2与冠状病毒连接相关氨基酸分析 ACE2和SARS冠状病毒上S蛋白相互作用晶体结构的研究表明，ACE2中有18个氨基酸残基直接同SARS-CoV S蛋白相连接，这些基团的改变会影响S蛋白同ACE2的结合效率[15]。有研究发现，大鼠ACE2第353位氨基酸是组氨酸, 很大程度上抑制病毒蛋白侵入细胞, 与之相比较，将大鼠ACE2的第353位的组氨酸替换为人相应的赖氨酸后，病毒蛋白能与大鼠受体有效结合[16]。因此，本实验室将获得的中国麻鸭的氨基酸序列与NCBI上人的序列对比，筛选出与SARS病毒有关的18个关键氨基酸残基(表 4)，通过比较发现，中国麻鸭除第330和353位氨基酸与人的一样外，其他16个氨基酸均不一致。
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表 4 与SARS-CoV S蛋白受体结合域(RBD)相连的ACE2氨基酸残基 Table 4 ACE2 amino acid residues linked to the SARS-CoV S RBD |
2.5.4.1 二级结构预测 利用JPred4在线软件对该中国麻鸭ACE2蛋白二级结构预测，结果发现该片段有39处α螺旋(39.3%)，20处β-折叠(20.19%)和47处无规卷曲(47.44%)。在Gly399-Ieu443与Ile291-Ser317处出现较大α螺旋，在Val745-Ile758处出现最大β-折叠，在Gln249-Cys261与Met351-Asp355处有较大无规卷曲。
2.5.4.2 ACE2编码蛋白跨膜结构和信号肽分析 对ACE2基因编码蛋白跨膜结构分析，预测结果如图 6A。该蛋白属于I型跨膜蛋白，同已鉴定的人等ACE2蛋白跨膜类型一致。其中第1~739氨基酸为胞外部分，第740~762氨基酸之间有一个跨膜螺旋(图框处)，第763~805氨基酸为胞内部分。
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图 6 中国麻鸭ACE2编码蛋白质跨膜结构和信号肽预测 Fig. 6 The tertiary structure of ACE2 protein and ACE2 gene locus analysis of signal peptides in China Sheldrake duck |
麻鸭ACE2蛋白信号肽分析结果如图 6B：图框处C值最大，S值陡峭，Y值最高峰，在第17~18氨基酸之间存在潜在的裂解位点，该蛋白为分泌蛋白(此处D值为0，711，大于4.50-此为分泌蛋白的判断标准)，信号肽区域在第1~17氨基酸之间，与跨膜区分析预测的结果一致。
2.5.4.3 蛋白质磷酸化、糖基化位点分析 对ACE2基因编码蛋白质进行磷酸化和糖基化位点预测。统计结果如图 7，显示该麻鸭ACE2蛋白有39处磷酸化位点，其中11处Thr磷酸化位点(28%)，14处Ser磷酸化位点(36%)和14处Tyr磷酸化位点(36%)。蛋白质糖基化预测发现蛋白质存在多处N-糖基化位点，无O-糖基化位点。
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图 7 中国麻鸭ACE2基因编码蛋白质磷酸化位点分析 Fig. 7 Analysis of phosphorylation sites of ACE2 gene in China Sheldrake duck |
ACE2首次被发现是作为肾素-血管紧张素系统的重要成员参与机体心血管系统体液调节[17]，其基因定位在人的X染色体上，是一种由805个氨基酸编码的I型跨膜糖蛋白，具有胞外催化结构域，分子量约为120 ku[4, 18]，组织定位主要见于心、肾和睾丸，后发现在结肠、肺以及大脑等多种组织中也存在，但水平较低。早期研究表明，ACE2仅局限于血管内皮细胞，但进一步研究表明，ACE2在心肌细胞以及肾小管上皮细胞的管腔表面均有表达[19]。ACE2基因表达的改变会诱使动物产生多种疾病，如高血压、代谢和行为功能障碍以及影响血清素合成等[20]。
自2000年首次克隆了人ACE2全长cDNA并报道了其序列以来，多种动物的ACE2基因被相继克隆成功，有关ACE2序列报告的物种主要集中在人、小鼠等哺乳动物和啮齿动物，禽类方面研究相对滞后，尚缺乏鸭等禽类ACE2序列资料。本研究首先应用RT-PCR和Western blot检测ACE2在麻鸭上的表达，发现基因水平上，麻鸭的心、肝、肺、肾组织中均可以检测到ACE2，同时在这些组织上也有ACE2蛋白存在。根据NCBI上预测的绿头鸭ACE2基因mRNA序列设计引物，克隆中国麻鸭ACE2基因的完整ORF序列，其ACE2基因mRNA编码区共包括2 435个核苷酸，编码805个氨基酸残基。核苷酸序列和氨基酸序列同源性与人ACE2分别为为66.2%、66.4%，通过结构分析发现，麻鸭ACE2为I型跨膜蛋白，有一个信号肽区域，且存在多处磷酸化位点和N-糖基化位点，这些分析与ACE2在已有人或动物上的研究结果相符。
2002年SARS-CoV冠状病毒爆发，Li等[3]通过体外免疫共沉淀和质谱分析证实，ACE2是SARS冠状病毒的功能受体。ACE2和SARS冠状病毒上S蛋白相互作用晶体结构的研究表明，ACE2上有18个关键氨基酸可与S蛋白受体结合区域相结合，其中第24、27、34、37、238、82、83、90和325位氨基酸的变异并不影响与蛋白的相互作用，剩下的8个关键氨基酸31、41、42、45、79、440、353和354，特别是第41和353位氨基酸对冠状病毒侵染细胞起到关键作用[14]。研究证实，大鼠不能被SARS-CoV感染，但如果大鼠ACE2上第353位组氨酸被人ACE2相应位置的赖氨酸替代时，人SARS冠状病毒则可感染大鼠细胞。这些结果提示：关键氨基酸可能影响了SARS-CoV的跨物种和人与人之间的传播[15]。
2020年初，一种新型冠状病毒(COVID-19)在中国武汉出现，在人体中引起类似SARS-Cov的症状，而最新研究发现，COVID-19也以ACE2为受体[21]，且COVID-19中的几个关键残基与人类ACE2产生了良好的相互作用，这些相互作用显示了ACE2(L 79，M 82)与RBD(F 486)之间的一种潜在的疏水相互作用以及一种阳离子-π相互作用ACE2(K 353)/ RBD(Y 492)，这与COVID-19对人类细胞感染的能力一致，并使得COVID-19已经具备了一定的人际传播能力[22]。而且COVID-19也可能从多种物种(小鼠和大鼠除外)中识别出ACE2，这意味着很多动物物种可能是COVID-19感染的中间宿主或动物模型[23]。通过对比起关键作用的氨基酸发现，中国麻鸭第41位氨基酸谷氨酸与人、果子狸、大鼠、小鼠酪氨酸不一致；中国麻鸭第79位丙氨酸与人亮氨酸不一致；中国麻鸭第82位苯丙氨酸与人蛋氨酸不一致；中国麻鸭第353位氨基酸与人、果子狸一致，皆为赖氨酸，与大鼠、小鼠组氨酸不一致，这说明，虽然还没有发现冠状病毒传播与家禽有关系，但我们知道冠状病毒是一类主要引起呼吸道、肠道疾病的病原体，其危害性除人类外，还可感染猪、牛、禽类等多种动物，又因冠状病毒最初就是1937年从鸡上分离出来，其中以禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus, IBV)引起的禽传染性支气管炎(avian infectious bronchitis, IB)是禽的一种发病迅速、高度接触传播的传染病，除主要引起呼吸道症状外，还感染禽类的其它组织和器官，如肾、生殖器官和消化道等许多组织，导致不同程度的病变，还会引起其它疾病的继发感染，给养殖产业带来重大经济损失[24]，根据已有的研究，ACE2在人及多种动物体内的广泛分布性及其与冠状病毒之间的关系，仍要警惕其存在的风险，明确ACE2的结构及与冠状病毒侵入的确切机制意义重大。
4 结论本研究通过克隆等分子生物学技术获得中国麻鸭ACE2基因全长序列，并对其基因结构、核苷酸及氨基酸组成、蛋白特性等用不同生物软件进行了预测分析，得到了相应结果。所得基因序列已递交GenBank，基因序列号为MK836421，填补了缺乏鸭ACE2全长序列的空白，为ACE2在鸭上及水禽上的研究奠定了基础。
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