2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education, Chengdu 610041, China
简州大耳羊是以简阳本地山羊和努比山羊为育种材料培育出的我国第二个肉用山羊品种，具有肉质鲜美、抗逆性强和高繁殖率等诸多优良性能[1]。肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)含量指沉积在肌肉内的脂肪含量，可影响畜禽肉质的风味和感官特征，如嫩度和多汁性等[2-3]。有研究表明，由肌内前体脂肪细胞高度分化所决定着的肌内成熟脂肪细胞数量和体积的增加均有助于提高IMF含量[4-5]，而前体脂肪细胞的分化过程又受基因表达、信号通路和细胞内生化过程等所调控[6]。Chen等[7]在猪上的研究表明，猪背最长肌和半键肌中IMF含量的差异主要由脂肪分化过程中的成脂关键基因的表达、葡萄糖消耗和脂肪酸组成等所造成。因此，获得山羊-尤其是肉用山羊的IMF沉积功能候选基因具有重要的理论与实际意义。
转录组测序(transcriptome sequencing, RNA-seq)是利用高通量测序技术来检测细胞或组织中转录组序列的一种技术，转录组主要分为mRNAs和非编码RNAs等[8]。RNA-seq技术过程通常包括总RNA的提取与筛选、文库的构建、高通量测序和数据的处理与分析[9]。目前，RNA-seq技术已被应用于揭示环状RNAs(circular RNAs, circRNAs)在人类成年与胎儿时期组织中的表达水平[10], 小鼠小胶质细胞的反应特征[11]和5-羟色胺受体2A(5-hydroxytryptamine receptor 2A, HTR2A)在黄牛脂肪分化中的正向作用等方面[12]。在山羊方面也有一些报道，如杜琛等[13]利用RNA-seq技术获得了绒山羊肌内脂肪细胞成熟前后的相关基因，研究者通过RNA-seq技术确认了长非编码RNAs(long noncoding RNAs, lncRNAs)和mRNAs在山羊优势卵泡选择中的差异表达[14]，施会彬等[15]也基于RNA-seq结果筛选得到有关山羊下丘脑组织的繁殖信号通路及相应的候选基因。但对于肉用山羊肌内脂肪沉积关键功能候选基因的调控网络尚未见报道。
因此，本研究以尚未诱导分化的简州大耳羊肌内前体脂肪细胞和诱导分化5 d的肌内脂肪细胞为试验材料，提取并质检细胞总RNA后利用Illumina Novaseq测序平台对其cDNA序列进行高通量测序，对原始测序数据进行处理，利用DESeq2软件筛选得到细胞分化前后的差异表达基因，并通过cluster -Profiler软件对其进行GO功能和KEGG通路富集，最后利用qRT-PCR技术鉴定了功能候选基因的表达变化情况，以此为本试验测序的准确性提供支撑。本研究结果为最终阐明肉用山羊肌内脂肪沉积的调控网络提供重要的数据。
1 材料与方法 1.1 试验动物本研究用于细胞培养的试验动物为7日龄的健康简州大耳羊公羊(n=3)，购自四川省简阳市大哥大牧业有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 细胞培养与诱导分化 按照本实验室前期的方法获取并分离原代简州大耳羊肌内前体脂肪细胞[16]，将成功分离的细胞冻存于液氮中。将冻存的原代简州大耳羊肌内前体脂肪细胞37℃复苏后培养传代至F3代。当F3代简州大耳羊肌内前体脂肪细胞生长达80%融合时更换为诱导分化液(50 μmol·L-1油酸(Sigma, 上海)+10%FBS(Gemini, 上海)的DMEM/F12培养基(Hyclone, 北京))诱导分化5 d，并利用油红O染色检测肌内脂肪细胞内的脂滴聚集情况。
1.2.2 细胞总RNA的提取与检测 按照TRIzol试剂盒(TaKaRa, 大连)使用说明提取简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化前后两组细胞裂解物样品的总RNA[17]。利用琼脂糖凝胶电泳法和Nano-Photometer光度计对提取的总RNA进行完整性、纯度和浓度检测后通过Agilent 2100 bioanalyzer仪器精确检测样品总RNA的完整性。
1.2.3 文库构建与高通量测序 利用NEBNextⓇ UltraTM RNA Library Prep Kit试剂盒(Illumina, 上海)构建样品的cDNA文库[18]，并将细胞分化前的样品编号为P_IMA1、P_IMA2和P_IMA3，分化后的样品编号为IMA1、IMA2和IMA3。构建文库完成后对cDNA进行初步定量。稀释样品至1.5 ng·μL-1后检测文库的insert size，再对文库进行准确定量。之后，利用Illumina Novaseq测序平台对cDNA文库进行高通量测序并获得待测片段的原始序列信息。
1.2.4 测序数据的处理 获得Fastq格式的原始序列数据(row reads)后，首先除去带接头(adapter)的reads、质量过低的reads和含未知碱基信息的reads等，然后进行筛选过滤得到有效数据(clean data)，再计算clean data的GC、Q20和Q30的含量，最后利用HISAT2比对序列到参考基因组[19]。
1.2.5 定量分析 为了校正基因长度和测序深度，本研究将得到的各样本中所有基因的表达值(FPKM)以小提琴形图展示不同样本基因表达水平的分布情况[20]。此外，基于FPKM值，以组内及组间样本的相关性系数来绘制相关热图。
1.2.6 差异表达基因筛选 使用DESeq2软件对简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化前后两组测序文库的clean data进行差异表达分析。每组样品具有3个生物学重复。以|log2 fold change|>0和由Benjamini & Hochberg方法得到的有效P < 0.05作为基因显著差异表达的阈值。利用GraphPad Prism 8绘制差异表达基因的火山图，并标明待验证的功能候选基因。
1.2.7 差异表达基因的GO功能与KEGG通路富集分析 利用clusterProfiler R包分别对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路中差异表达基因的统计富集。当校正的P < 0.05时，GO条目和KEGG通路通过差异表达基因显著富集。
1.2.8 qRT-PCR验证 依据高差异表达倍数、GO功能、KEGG通路富集结果随机选取与脂肪酸或脂质相关的3个表达上调和3个表达下调的功能候选基因，根据GenBank中各基因在山羊、绵羊和牛中的保守蛋白质编码区序列(coding sequence, CDS)，利用Primer Premier 5设计定量引物(表 1)，再选取泛表达转录子(ubiquitously expressed transcript, UXT)基因作为内参基因来校正检测各基因的表达量[21]。使用RNA-seq的同批细胞总RNA样品，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa, 大连)反转录获得1 μg cDNA样品，将其稀释5倍后用于qRT-PCR试验。利用梯度PCR确定待检测各基因的定量引物最适退火温度(表 1)，qRT-PCR体系：ddH2O 7 μL，TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大连)10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL。qRT-PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，退火(表 1)10 s，72℃延伸15 s，40个循环。通过qRT-PCR得到Ct值后利用2-ΔΔCt法计算每个功能候选基因的相对表达水平，并将每个基因的相对表达水平用以2为底基因相对表达量的对数进行展示。
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表 1 验证基因及其引物信息 Table 1 The information of primers for verified genes |
利用50 μmol·L-1油酸+10%FBS的DMEM/F12培养基诱导简州大耳羊肌内前体脂肪细胞(图 1A)分化，获得了诱导分化5 d的肌内脂肪细胞(图 1B)。诱导分化后，可在肌内脂肪细胞中观察到明显聚集的体积增大的红褐色脂滴。
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A.肌内前体脂肪细胞；B.诱导分化5 d的肌内脂肪细胞 A. The intramuscular preadipocytes; B. The intramuscular adipocytes induced for 5 d 图 1 肌内脂肪细胞诱导分化形态图 Fig. 1 The morphology diagram of induced intramuscular adipocytes |
通过对各样品RNA进行一系列质检，获得完整性良好的总RNA(图 2)，此外，各样品总RNA的A260 nm/A280 nm值均为1.8~2.0。
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M. DNA相对分子质量标准；1~6.样品编号 M. DNA marker; 1-6. The numbers of samples 图 2 RNA凝胶电泳图 Fig. 2 The gel electrophoresis diagram of RNA |
对原始数据过滤后，获得了样本测序有效数据的错误率、GC、Q20和Q30含量(表 2)。其中，样本测序有效数据的错误率均为0.03，Q20均大于97%，Q30均大于93%和GC含量均在53%左右。
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表 2 样本测序数据质量汇总 Table 2 The quality summary of RNA-seq data for all analyzed samples |
由图 3A可知，6个样品统计量中的最大值均大于12，上四分位也都略大于4，中位数则在3附近，下四分位在1.5左右，最小值则为0；此外，各样品中基因表达密度也趋于一致。通过计算样品组内及组间的相关系数可知，组内两两样品的相关系数均大于0.99(图 3B)。
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A.样本基因表达量分布小提琴形图；B.样本间相关性热图 A. The violin plot of samples genes expression distribution; B. The heatmap of pearson correlation among samples 图 3 样本基因表达量分布与样本间相关系数 Fig. 3 The sample gene expression distribution and pearson correlation coefficients among samples |
以|log2fold change|>0和P < 0.05(即-lg padj> 1.301)为筛选条件共得到7 916个差异表达基因，其中4 143个为表达上调基因，3 773个为表达下调基因(图 4A)。图 4B则证明了组内两两样品的基因表达量近乎趋于一致，说明生物学重复的有效；组间样品则存在显著的基因表达变化。
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A.差异基因火山图；B.差异基因热图 A. The volcano plot of differentially expressed genes; B. The heatmap of differentially expressed genes 图 4 差异表达基因分析 Fig. 4 The analysis of differentially expressed genes |
通过对差异基因集进行GO功能富集分析得知，GO功能注释中52.8%为生物过程(biological process，BP)，13.4%是细胞组成(cellular component，CC)，33.8%是分子功能(molecular function，MF)，并选取了表达上调基因和表达下调基因富集最显著的前30个GO功能进行展示(图 5)。此外，表达上调基因在30个富集最显著的GO功能注释中BP占16个，CC占14个，其中前5个BP分别为核糖体合成、核糖核蛋白复合物合成、ATP生物合成、核苷三磷酸合成和嘌呤核苷三磷酸合成，前5个CC为线粒体、线粒体膜、线粒体成分、线粒体包膜和细胞器包膜(图 5A)。表达下调基因在30个富集最显著的GO功能注释中BP占22个，MF占8个，其中前5个BP分别为氧化还原、糖代谢、有机酸代谢、含氧酸的代谢和吡啶核苷酸代谢，前5个MF为氧化反应、辅酶合成、核酸结合转录因子活性、转录因子活性与序列特异性DNA结合和作用于糖基的水解酶活性(图 5B)。
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A.表达上调基因GO富集分析气泡图；B.表达下调基因GO富集分析气泡图；选取最显著的30个GO条目进行展示 A. The bubble chart of GO function enrichment analysis for upregulated expression genes; B. The bubble chart of GO function enrichment analysis for downregulated expression genes; The most significant 30 GO terms for exhibition 图 5 差异表达基因GO功能富集分析 Fig. 5 GO function enrichment analysis for differentially expressed genes |
分析差异表达基因的KEGG通路可知，表达上调基因共富集到305条通路，其中19条通路显著富集；表达下调基因共富集到303条通路，其中5条通路显著富集。选取了表达上调基因和表达下调基因富集最显著的前20个KEGG通路进行展示(图 6)，其中表达上调基因富集最显著的前5条通路(不包含疾病)为氧化磷酸化、蛋白酶体、心肌收缩、核糖体合成和三羧酸循环通路(图 6A)，表达下调基因富集最显著的前5条通路为溶酶体、糖酵解/糖异生作用、碳代谢、轴突导向和甲状腺激素信号通路(图 6B)。
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A.表达上调基因KEGG通路富集分析气泡图；B.表达下调基因KEGG通路富集分析气泡图；选取最显著的20个KEGG通路进行展示 A. The bubble chart of KEGG pathways enrichment analysis for upregulated expression genes; B. The bubble chart of KEGG pathways enrichment analysis for downregulated expression genes; The most significant 20 KEGG pathways for exhibition 图 6 差异表达基因KEGG通路富集分析 Fig. 6 The KEGG pathways enrichment analysis for differentially expressed genes |
利用qRT-PCR分别检测了从RNA-seq结果中选取的3个表达上调和3个表达下调基因(表 1和图 4A)在简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化前后的表达水平。结果显示，qRT-PCR检测的6个功能候选基因(WISP2、ACOX3、APOA1、ACOT11、ACACB、UCP3)在简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化前后的表达水平变化趋势与RNA-seq结果一致(图 7)。
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图 7 qRT-PCR验证差异表达基因 Fig. 7 The differentially expressed genes were confirmed by qRT-PCR |
RNA-seq技术已被广泛应用于检测不同样本中的转录组序列，而且也有利用该技术分析绒山羊肌内脂肪细胞成熟前后比较转录组的报道[13]，但由于绒山羊与肉用山羊具有品种差异，因此拟阐明肉用山羊肌内脂肪沉积的分子调控网络，获得差异调控基因，则需以肉用山羊品种为试验材料进行研究。
本研究在提取诱导分化前后两组细胞的总RNA后进行了RNA-seq。在为了增强基因功能富集显著的情况下以|log2fold change|>0和padj < 0.05为阈值[22]，利用DESeq2软件共得到7 916个差异表达基因，其中3 773个为表达上调基因，4 143个为表达下调基因。在杜琛等[13]的研究中，以Fold Change>4, FDR < 0.01为筛选条件分别得到39个显著上调基因和39个显著下调基因。两个研究结果的不同不仅可能是因为筛选条件的不同，还可能是由于山羊品种的特异性和诱导细胞分化的方法和时间不同。目前，绒山羊作为优良产绒山羊品种，大多数研究旨在探讨调控绒山羊产绒的因素，如王建蒙等[23]研究了褪黑激素在绒山羊皮肤周期性中发挥的作用，赵濛等[24]研究了角蛋白关联蛋白基因表达对绒山羊绒毛生长的作用等。对于我国自主培育的第二个肉用山羊品种——简州大耳羊来说[1]，目前研究多集中在其肉质调控的因素上。由于不同的育种目标，绒山羊和简州大耳羊的遗传背景也自然存在不同。此外，本试验是以简州大耳羊肌内前体脂肪细胞和诱导分化5 d的脂肪细胞为研究对象，利用RNA-seq技术获得相关差异表达基因。在前期研究中，本实验室发现，利用诱导分化液(50 μmol·L-1油酸+10%FBS)诱导肌内前体脂肪细胞分化5 d后，细胞内脂滴数量明显增多，体积增大，可被油红O染成橘红色，说明此时细胞已成脂分化。因此，诱导细胞分化时间的不同也可能是造成本研究结果与以往研究结果的差异。
为进一步分析获得差异表达基因的功能，本研究将差异基因进行GO功能富集，结果，表达上调基因在BP中主要富集到核糖体合成、核糖核蛋白复合物合成、ATP生物合成、核苷三磷酸合成和嘌呤核苷三磷酸合成，在CC中主要富集到线粒体、线粒体膜、线粒体成分、线粒体包膜和细胞器包膜。目前已知过氧化物酶体增殖物激活受体γ(transcription factor peroxisomal proliferator-activated receptor γ, PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins, C/EBPs)对脂肪分化起关键性作用[6]，其他多种蛋白也调控前体脂肪细胞的分化，包括脂肪细胞决定和分化因子1(adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1，ADD1)和固醇调节因子结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1)等[25]。蛋白的合成不仅需要核糖体提供场所[26]，更需要能量，而线粒体正是生物体内产能的主要细胞器[27]，部分核苷三磷酸(ATP和GTP)也作为能量的直接供应物, 因此在肌内前体脂肪细胞分化中有关核糖体、线粒体和核苷三磷酸合成的基因会显著的表达上调。此外，本研究中表达下调基因主要富集到糖、有机酸、含氧酸和吡啶核苷酸代谢的GO功能中，说明在简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化过程中，表达下调基因可影响到细胞内多种物质的代谢过程。
通过分析差异表达基因的KEGG通路可知，表达上调基因显著富集到氧化磷酸化、蛋白酶体、心肌收缩、核糖体合成和三羧酸循环通路中，其中，核糖体合成、氧化磷酸化和三羧酸循环通路均与核糖体及能量产生密切相关[28-29]，这也与本研究表达上调基因的GO功能富集结果相对应。Viguerie等[30]发现，甲状腺激素能调控人脂肪细胞基因的表达，其中，三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine, T3)能够在成熟脂肪细胞中下调固醇调节元件结合蛋白1C(sterol regulatory element binding protein1c，SREBP1c)基因的表达，而SREBP1c基因又能促进脂肪生成并刺激成脂基因的表达[31]，这说明甲状腺激素信号通路在前体脂肪细胞分化过程中可起部分抑制作用。本研究结果表明，在表达下调基因富集到的KEGG通路中，甲状腺激素信号通路是显著富集的通路之一，说明甲状腺激素信号通路中部分基因的表达下调有利于简州大耳羊肌内前体脂肪细胞的分化。
为确定RNA-seq结果中差异表达基因的准确性，并提供对简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化起调节作用的研究对象，本研究选取了UCP3、ACACB、ACOT11、ACOX3、APOA1和WISP2作为功能候选基因，并利用qRT-PCR技术分析其在细胞分化前后的mRNA表达水平。其中UCP3作为解偶联蛋白被发现在棕色脂肪组织和骨骼肌组织中高表达[32]，其对于骨骼肌内的脂肪酸转运和氧化作用起正调节作用[33]。本研究中，UCP3基因在肌内脂肪细胞分化后表达量上调，表明UCP3基因可能促进简州大耳羊IMF沉积，但乔永[34]发现，UCP3基因表达量与各部位肌肉IMF含量成负相关，推测其可能抑制湖羊的IMF沉积。因此，UCP3基因在调控简州大耳羊和湖羊IMF沉积方面的差异可能是由于不同畜种间的脂肪沉积过程存在差异。此外，表达上调的ACACB基因被富集到脂质代谢和合成GO功能中，说明ACACB基因对于简州大耳羊肌内脂肪细胞分化过程中的脂质积累可能具有调控作用。相似地，ACACB也被发现通过控制肝脏内脂肪酸氧化影响了脂肪的积累，而其多态性也与肥胖相关[35-36]。ACOT11作为水解脂肪酸acyl-CoAs酶类中的一员已被推断能够提高脂肪酸利用来促进肺腺癌细胞增殖[37-38]。本研究中，ACOT11基因被富集到脂质结合GO功能中，且其表达量在细胞分化后上调，说明ACOT11蛋白可能在简州大耳羊肌内脂肪细胞分化过程中结合脂质，提高脂质利用率。由GO功能和KEGG通路富集结果可知，ACOX3和APOA1基因均涉及到脂质/脂蛋白的代谢功能和PPAR信号通路，而ACOX3和APOA1基因也在简州大耳羊肌内脂肪细胞分化过程中表达下调，这说明ACOX3和APOA1基因可能作为PPAR信号通路中的一个负控中间分子来调控脂质/脂蛋白的代谢程度，进而影响肌内脂肪细胞的分化。此外，ACOX3被发现是脂质稳态的关键调节酶[39]，APOA1基因的多态性影响了脂质的代谢过程[40]。WISP2作为脂肪因子被发现在人脂肪前体细胞中高表达，但其对于大鼠脂肪前体细胞的分化起抑制作用[41-42]。在本研究中，涉及胰岛素样生长因子结合GO功能的WISP2基因在简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化后表达量显著下降，推测WISP2基因表达的减少可能促进简州大耳羊肌内前体脂肪细胞的分化。但在曹阳[43]的研究中，WISP2基因在杜寒杂交羊背最长肌中表达量相较于小尾寒羊上调，而杜寒杂交羊的肉质又优于小尾寒羊，表明WISP2基因的表达可能对于肉质起着正向调控作用。研究结果的差异表明，WISP2基因在不同畜种中对于IMF的调控也起着不同的作用。经qRT-PCR技术检验，上述6个基因在简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化前后的变化趋势均与RNA-seq结果一致，其变化倍数的差异可能是选取不同的计算方法所导致的。但目前仍未见上述基因调控山羊肌内前体脂肪细胞分化的直接研究结果，因此，本实验室在后续试验中欲以这6个基因作为研究对象，利用分子细胞生物学方法研究其对简州大耳羊肌内前体脂肪细胞分化的作用及调控机制。
4 结 论本研究利用RNA-seq技术筛选得到简州大耳羊肌内前体脂肪细胞成脂分化前后的差异表达基因共7 916个，其中4 143个为表达上调基因，3 773个为表达下调基因；并将差异表达基因显著富集的前30个GO条目和前20个KEGG通路进行了相应阐述；最后利用qRT-PCR技术确认了UCP3、ACACB、ACOT11、ACOX3、APOA1和WISP2基因可作为功能候选基因。本研究为阐明肉用山羊肌内脂肪细胞成脂分化的分子调控网络提供了基础数据和系统资料。
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