2. 四川省动物疫病预防控制中心, 成都 610041;
3. 四川省动物卫生监督所, 成都 610041;
4. 红原县科学技术和农业畜牧局, 红原 624400;
5. 松潘县科学技术和农业畜牧局, 松潘 623300
, XIANG Yang1, YUAN Dongbo2, YANG Aiguo2, FAN Xiaohu3, TAN Xiong4, ZHONG Yeqing5, HAO Lili1
2. Center for Animal Disease Control and Prevention in Sichuan Province, Chengdu 610041, China;
3. Sichuan Anima Health Supervision Institution, Chengdu 610041, China;
4. Hongyuan County Bureau of Science and Technology for Agriculture and Animal Husbandry, Hongyuan 624400, China;
5. Songpan County Bureau of Science and Technology for Agriculture and Animal Husbandry, Songpan 623300, China
巴尔通体(Bartonella)是根瘤菌目(Rhizobiales)巴尔通体科(Bartonellaceae)的唯一属，是一种兼性胞内细菌，经蜱、蚤、白蛉等吸血节肢动物传播，广泛存在于自然界中的动物体内，可感染多种哺乳动物(包括猫科动物、小型兽类、有蹄类动物、兔科动物)的红细胞和内皮细胞[1-3]。巴尔通体是人类感染卡里翁病、猫抓病、风疹热、细菌性血管瘤病的病原体[4]，还可引起多种心血管、神经和类风湿疾病[5]。近年来，越来越多的巴尔通体被鉴定为人类病原体，目前，至少有15种巴尔通体与人类疾病有关[3, 6]。无形体病由立克次体目无形体科无形体属(Anaplasmas)病原体引起的人兽共患病，包括噬吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、边缘无形体(Anaplasma marginale)、中心无形体(Anaplasmacentrale)、山羊无形体(Anaplasma capra)、牛无形体(Anaplasma bovis)、绵羊无形体(Anaplasma ovis)和血小板无形体(Anaplasma platys)[7]。其中，噬吞噬细胞无形体、山羊无形体均有感染人的病例报道[7-8]。
松潘县位于阿坝藏族羌族自治州东北部(北纬32°06′~33°09′，东经102°38′~104°15′)，地处青藏高原东缘，地形复杂，海拔悬殊(1 049~5 576 m)。松潘县主要以畜牧业为主，牦牛是当地数量最多的家畜(约24万头), 但整体养殖方式粗放，驱虫意识淡薄。牧民日常生活中与牦牛接触频繁，易被牦牛体表蜱叮咬继而感染相关蜱媒病。除牦牛外，高原鼠兔是当地最多的啮齿类动物，也是一些蜱媒病(巴尔通体、无形体)的主要宿主之一。目前，对松潘县动物巴尔通体和无形体病流行现状的调查研究处于一片空白，因此，本试验于2018年5—10月采集样本，对牦牛体表蜱和高原鼠兔感染此两类病原情况展开了前期调查。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 蜱、高原鼠兔 于2018年5月和10月于松潘县进安乡、山巴乡、下八寨乡各采集牦牛体表蜱102、97和131只(每个乡选2~3家农户的牦牛群，每头牦牛体表采集5~6只)，装入收集管并塞入潮湿脱脂棉，形态学分类后，放入75%乙醇溶液，4 ℃保存；从进安乡、山巴乡、下八寨乡采用弓箭法各捕获高原鼠兔23、28和30只，无菌条件下剖检、分离脾，于-80 ℃保存待检。
1.1.2 主要试剂 组织基因组DNA提取试剂盒(EasyPure Genomic DNA Kit)、Trans 2K Plus DNA maker、2×EasyTaq PCR SuperMix、1×TAE溶液和琼脂糖均购自北京全式金公司；引物合成、测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.1.3 主要仪器 电泳仪电源(北京六一仪器厂，DYY-6C型)、Leica S9D体式显微镜、台式高速离心机(eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯乐梯度PCR扩增仪(PTC240型)及Bertin Precellys 24研磨器等。
1.2 方法1.2.1 蜱形态分类 根据《中国畜禽寄生虫形态分类图谱》[9]及《中国经济昆虫志》[10]，在体式显微镜下对蜱进行形态学观察，依据形态特征对蜱的种类进行初步分类，后续再结合分子鉴定最终确定种类。
1.2.2 DNA提取 根据本实验室前期所采用的方法提取蜱DNA[11]，取出用75%酒精保存的蜱，无菌水洗涤晾干后，沿纵向中轴线切割，分别装入EP管，半只于-80 ℃冰箱冻存，另外半只加入500 μL无菌水于Bertin Precellys 24研磨器充分研磨，参数：每管加入陶瓷珠(直径0.5 mm的20珠和2 mm的5珠)，5 500 g研磨2次；4 000 g研磨1次。取研磨液200 μL，用EasyPure Genomic DNA Kit按照说明书提取DNA，于-20 ℃保存备用；将高原鼠兔的脾组织剪碎后，用Easy Pure Genomic DNA Kit按照说明书提取DNA，于-20 ℃保存备用。
1.2.3 PCR检测 蜱及巴尔通体、无形体的分子鉴定分别采用Black等[12]、Norman等[13]和Han等[14]报道的方法，引物见表 1。3种引物扩增均采用25 μL反应体系，2×EasyTag PCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL混匀。巴尔通体和无形体分子鉴定设阳性对照(B. melophagi，A. phagocytophilum DNA由本实验室保存)和阴性对照(去离子水)。蜱16S rRNA基因扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温。巴尔通体rpoB基因扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸23 s，40个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温。无形体16S rRNA基因扩增程序：第1轮：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min 26 s，40个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温，第2轮:94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸56 s，40个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温。取2 μL PCR扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中, 80 V电泳30 min，凝胶成像仪中观察结果。
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表 1 PCR引物 Table 1 PCR primers |
1.2.4 序列分析及统计分析 PCR产物送生工生物工程公司成都分公司测序，所得序列用DNAStar软件进行拼接，然后，在NCBI中BLAST进行比对，再应用MEGA6.0软件以Neighbor-Joining法构建进化树，并用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。
2 结果 2.1 蜱的采集及形态鉴定在松潘县进安乡、山巴乡、下八寨乡各采集牦牛体表蜱102、97和131只，共计330只，均为饱血蜱。经体视显微镜观察，主要特征：青海血蜱雄蜱与雌蜱形态特征大致相同，假头基呈矩形位于躯体前端，躯体窄长，饱血后呈卵圆形，须肢粗短，躯体背面覆盖有几丁质盾板，肛沟围绕肛门之后；无珐琅斑无眼，足基节只有一个距，各基节均有粗短内距，末端钝，略微超出该节后缘，各附节较粗短，口下板齿式5/5，压舌板形；雄蜱气门板呈长逗点形，雌蜱气门板呈椭圆形。因此，经形态学初步鉴定，疑似为青海血蜱，如图 1所示。
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A.青海血蜱背面；B.青海血蜱腹面 A. Dorsal surface of Haemaphysalis qinghaiensis; B. Ventral surface of Haemaphysalis qinghaiensis 图 1 青海血蜱的形态特征 Fig. 1 Morphological characteristics of Haemaphysalis qinghaiensis |
以提取的蜱组织DNA为模板，扩增蜱16S rRNA基因片段，部分样本电泳后如图 2所示，均在约430 bp处出现条带，与预期相符。
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M.DL5000 marker；1.阳性对照；2.阴性对照；3~8.蜱样本 M. DL5000 marker; 1. Positive control; 2. Negative control; 3-8. Tick samples 图 2 松潘县部分蜱16S rRNA基因PCR反应后电泳图 Fig. 2 The PCR products of 16S rRNA gene of tick samples in Songpan |
共选取14个阳性PCR产物进行测序，将测序后的序列两两比对后，共得3条unique序列，彼此相似性在99.5%~99.8%，分别命名为H. qinghaiensis JA、H. qinghaiensis XB、H. qinghaiensis SB。选取经NCBI网站BLAST比对后相似性最高的序列2~4条以确定种，再选取国内报道主要血蜱的16S rRNA基因序列等作为参考序列，并以西藏革蜱作为外群，构建进化树。3个分离株均与甘肃临洮(MF629893)、青海湟源(MF629882)、甘肃永靖(MF629847)分离的青海血蜱亲缘关系最近(图 3)，相似性达99.01%~99.75%。
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图 3 基于16S rRNA基因的蜱种系统进化树分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis of ticks based on 16S rRNA gene |
以提取的蜱组织、鼠兔脾DNA为模板，扩增巴尔通体rpoB基因、无形体16S rRNA基因片段，部分样本电泳如图 4所示，巴尔通体rpoB基因片段大小约379 bp，无形体16S rRNA基因片段大小约426 bp，与预期相符。
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M. DL 5000相对分子质量标准；1、20.阳性对照；2、21.阴性对照，3~9、22~25.蜱样本；10~19.鼠兔脾样本 M. DL 5000 marker; 1, 20.Positive control; 2, 21.Negative control; 3-9, 22-25. Tick samples; 10-19. Pika spleen samples 图 4 松潘县部分样本巴尔通体rpoB (A)、无形体16S rRNA (B) PCR反应后电泳图 Fig. 4 The PCR products of rpoB of Bartonella spp. (A) and 16S rRNA of Anaplasma spp. (B) in Songpan |
对所有PCR阳性产物均进行测序，所得巴尔通体rpoB基因序列互相比对后共得6条unique序列，提交到GenBank, 其中，从蜱中检测到2条，对应序列号为MN296287和MN2962878；从高原鼠兔中检测到4条，对应序列号为MN296286、MN296292、MN296293和MN296294。分别选取BLAST比对后相似性最高的序列以及不同种类巴尔通体的rpoB基因序列等作为参考序列，构建进化树。如图 5所示，从蜱中检测到的MN296287和MN2962878均与分离自绵羊的B. melophagi(EF605288)亲缘关系最近，聚于1支，相似性分别为100%和99.40%。而从高原鼠兔中检测到的MN296293与未定种的巴尔通体ms-60株(JN403042)亲缘关系最近，聚于1支，其相似性达99.13%；MN296294单独1支，但BLAST比对显示与日本的Bartonella sp. Tokushima 10-1株(AB529489)的相似性最高，为92.58%；MN296292与湖北的B. queenslandensis strain SD-13株(MH748136)亲缘关系最近，聚于1支，相似性达99.69%；MN296286与日本未定种的Bartonella sp. Tokushima 10-1株(AB529489)和日本已定种的B. grahamii(AB426697)聚于1大支，相似性分别为96.55%和95.65%。
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图 5 基于rpoB基因的巴尔通体进化分析 Fig. 5 Phylogenetic tree of Bartonella based on the rpoB gene |
对所有无形体16S rRNA PCR阳性产物均进行测序，所得序列相互比对后共得3条unique序列，提交到GenBank，对应序列号分别为MN933910、MN933911和MN933912。分别选取BLAST比对后相似性最高的序列1~2条以确定种，再选取其他无形体种的16S rRNA基因序列等作为参考序列，构建进化树。3个序列均与牛无形体(A. bovis)亲缘关系最近(图 6)，其中MN933910和MN933912与甘肃地区未定种无形体sh65-3株(KM186932)的相似性最高，分别为100%和99.74%；与已定种的日本牛无形体KUM7株(LC012813)的相似性分别为99.74%和99.48%。MN933911与俄罗斯远东地区的牛无形体Am-Hc60株(JX092092)的相似性最高，为100%。
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图 6 基于16S rRNA基因的无形体体系统进化树分析 Fig. 6 Phylogenetic tree of Anaplasma spp. based on the 16S rRNA gene |
如表 2所示，蜱源巴尔通体与B. melophagi亲缘关系最近，进安乡、山巴乡和下八寨乡检出率分别为16.7%、8.2%和18.3%，其中，下八寨乡检出率显著高于进安乡(P < 0.05)；蜱源无形体进安乡、山巴乡和下八寨乡检出率分别为9.8%、12.4%和26.7%，下八寨乡检出率显著高于进安乡(P < 0.01)，检出的无形体均与牛无形体(A. bovis)亲缘关系最近；鼠兔巴尔通体感染情况：只有下八寨乡检出B. queenslandens，感染率为6.7%；进安乡、山巴乡和下八寨乡检出的巴尔通体与B. grahamii亲缘关系最近，感染率分别为8.7%、17.9%和13.3%，3个点检出率无显著差异；Bartonella sp. (MN296294)仅在进安乡检出，Bartonella sp. (MN296293)仅在山巴乡检出，两个点检出率无显著差异；与蜱均检出无形体不同，3个点的高原鼠兔均未检出无形体。此外，蜱和高原鼠兔均未发现2种及2种以上病原混合感染情况。
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表 2 松潘县巴尔通体和无形体检出率 Table 2 The detection results of Bartonella spp. and Anaplasma spp. in Songpan county |
青海血蜱目前仅发现于国内，广泛分布于青藏高原西部(包括青海、甘肃、四川和西藏)海拔2 000~ 4 200 m，是三宿主蜱[10]，可侵染大中型哺乳动物(牛、马、羊等)，但也可在牦牛上完成整个生活史。松潘县境内平均海拔2 850 m，其中进安乡、山巴乡和下八寨乡海拔分别为2 849、3 200和3 080 m，而本次调查中在上述3个地点均采集到了青海血蜱，说明青海血蜱是当地优势蜱种，也和文献报道中青海血蜱活动范围相符[15-16]。由于本试验中样本采集地点、方法有限，后期可从以下方面进行详尽调查：1)从不同地点、生态环境采集蜱；2)从不同动物宿主体表采集(羊、马、高原鼠兔等)；3)采用拖旗法采集，从而为松潘县蜱的种类及地理分布提供详实的数据。
巴尔通体是古老病原体，蜱等节肢动物是巴尔通体的主要传播媒介，野生的鼠形动物是巴尔通体重要的自然宿主和贮存宿主。rpoB基因(RNA聚合酶β亚基)为巴尔通体遗传学分类的主要标志[17]，在国内外已被广泛应用于巴尔通体的诊断和研究。研究表明，若与已知种同源性≥95.4%，则可认定为同一个种[18]。本试验中以rpoB为靶基因，对牦牛体表蜱及高原鼠兔体内巴尔通体进行了检测，巴尔通体营养要求十分苛刻，体外培养生长缓慢，分离培养和增殖培养不易，但相对于从蜱体内分离培养巴尔通体，以鼠形动物为宿主的巴尔通体的生长速度较快[19]。因此，对于本试验中源自高原鼠兔的2个未定种可在后期进行菌株的培养，分离纯化后应用诸如多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)方法，对巴尔通体多个基因(ITS、ftsZ、gltA、groEL、gyrB、nuoG、ribC和rpoB)在种的水平上进一步的鉴定。
现已证实巴尔通体中B. melophagi、B. grahamii、B. henselae、B. elizabethae等15个种均可导致人类疾病[20]：有报道从人的血液中通过PCR方法检测到B. melophagi[21]，同样，也从牛血[22]、羊血和羊蜱蝇中通过PCR方法检测到B. melophagi[23-24]。本试验中，也曾对3个乡的牦牛全血部分样本进行了检测，和高原鼠兔结果一致，均未检出B. melophagi。迄今为止，也无从啮齿类动物体内检出B. melophagi的报道，上述现象可能和不同种的巴尔通体对不同哺乳动物红细胞的侵染力有关[25]。此次在松潘县检测到青海血蜱巴尔通体总的携带率为14.85%(49/330)，远低于唐天才等[11]在四川省石渠县青海血蜱巴尔通体携带率(79.07%)，石渠县位于甘孜州，平均海拔4 000 m以上，是四川省海拔最高的地区。松潘县则位于阿坝州，平均海拔在3 000 m以下，两地自然环境差别巨大。因此，独特的自然环境可能是导致两地青海血蜱巴尔通体携带率差异显著的原因之一。
野生鼠形动物是巴尔通体最大的贮存宿主，有超过40种的鼠类体内检测到近30种的巴尔通体种及亚种。在亚洲，日本最早开展鼠形动物的巴尔通体研究，并分离到B. acomydis、B. callosciuri、B. jaculi、B. japonica、B. pachyuromydis和B. sylvatica 6种巴尔通体[26-27]。目前，对啮齿目动物感染巴尔通体报道众多，但对兔形目尤其是高原鼠兔巴尔通体感染情况研究甚少。国内最早于1999年在云南省首次证实巴尔通体在鼠形动物中流行，感染率在27.3%~44.3%[28]，现已在云南、浙江、福建、海南、内蒙古、山西等省(自治区)开展鼠形动物巴尔通体感染的研究，例如，浙江省于2010年首次从黑线姬鼠脾中分离出1株巴尔通体，与对人类致病巴尔通体B. grahamii的遗传关系最近[29]。目前，公开发表的高原鼠兔感染巴尔通体的报道只有1篇：栗冬梅等[27]于2013年在海北藏族自治州祁连县捕获79只高原鼠兔，巴尔通体总阳性率为18.99%(15/79)，共分离出15株菌株，其中，3株为B. taylorii，12株为B. grahamii。在本试验中进安乡、山巴乡和下八寨乡3个乡的高原鼠兔检出检出的巴尔通体与B. grahamii亲缘关系最近，与B. queenslandensis亲缘关系最近的巴尔通体只检出于下八寨乡，其余2个未定种分别在进安乡、山巴乡高原鼠兔体内检出，一定程度上表明B. grahamii可能是松潘县高原鼠兔体内巴尔通体优势种。B. queenslandensis于1999年分离自澳大利亚昆士兰岛小型哺乳动物血液[30]，目前，尚无B. queenslandensis感染人的报道，这也是首次在高原鼠兔体内检出疑似B. queenslandensis的巴尔通体。
许多家养和野生反刍动物都是A. bovis的宿主，包括牛、水牛、山羊、绵羊和鹿等。Ooshiro等[31]从日本一家牛场的15头日本肉牛上检出A. bovis，感染率达53.3%(8/15)。殷宏课题组Li等[32]2013年对甘肃省祁连山脉和陇山红鹿和梅花鹿无形体感染情况进行调查后发现，两地鹿群A. bovis感染率分别为9%和15%。姜理平等[33]对浙江省金华市金东区捕获的184只鼠进行了检测，其中4只检出A. bovis，但迄今为止，尚无人感染A. bovis的报道。在本试验中，高原鼠兔均未检出A. bovis，也未检出其他种无形体，后期可进一步扩大调查范围和增加高原鼠兔样本数量，以确定松潘县高原鼠兔无形体感染情况。
4 结论首次对松潘县牦牛体表蜱和高原鼠兔巴尔通体与无形体感染情况进行了调查，青海血蜱携带巴尔通体和无形体，而高原鼠兔只检出巴尔通体。该检测结果提示当地居民存在一定的感染风险，后期应进一步加强这两类病原流行情况的监测，为当地巴尔通体、无形体的研究和防控提供数据支持。
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