畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (6): 1429-1437. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.026    PDF    
引用本文
王素春, 仲焕香, 姜楠, 姜利建, 潘子豪, 孙福亮, 刘华雷, 黄保续, 王楷宬. H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(6): 1429-1437.  
WANG Suchun, ZHONG Huanxiang, JIANG Nan, JIANG Lijian, PAN Zihao, SUN Fuliang, LIU Hualei, HUANG Baoxu, WANG Kaicheng. Establishment of the Quadruple Real-time Fluorescence RT-PCR for Detection of H5, H7 and H9 Subtypes Avian Influenza Virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(6): 1429-1437.  
H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用
王素春1, 仲焕香2, 姜楠3, 姜利建3, 潘子豪2, 孙福亮3, 刘华雷1, 黄保续1, 王楷宬1     
1. 中国动物卫生与流行病学中心, 青岛 266032;
2. 南京农业大学, 南京 210095;
3. 延边大学, 延吉 133000
收稿日期：2019-11-18
基金项目：国家重点研发计划项目(2017YFC1200500)
作者简介：王素春(1985-), 山东人, 硕士, 主要从事家禽疫病研究, E-mail:wangsuchun@cahec.cn.
通信作者：王楷宬, 主要从事兽医微生物研究, E-mail:wangkaicheng@cahec.cn.
摘要：旨在提高对禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）检测效率，及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域，设计并合成了相关探针和引物，建立了禽流感病毒（AIV）四重荧光RT-PCR检测方法，该方法可在检测禽流感病毒（AIV）的同时，确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示，该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10-5 ng·μL-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品，经检测，其中有60份样品为流感病毒阳性，且全部是H9亚型，该结果与行业标准方法（NY/T 772—2013）检测结果一致，κ值为1（P < 0.001）。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测，将在AIV快速检测中发挥重要作用。
关键词：禽流感    H5亚型    H7亚型    H9亚型    四重荧光RT-PCR检测方法    
Establishment of the Quadruple Real-time Fluorescence RT-PCR for Detection of H5, H7 and H9 Subtypes Avian Influenza Virus
WANG Suchun1, ZHONG Huanxiang2, JIANG Nan3, JIANG Lijian3, PAN Zihao2, SUN Fuliang3, LIU Hualei1, HUANG Baoxu1, WANG Kaicheng1     
1. China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China;
2. Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. Yanbian University, Yanji 133000, China
Corresponding author: WANG Kaicheng, E-mail:wangkaicheng@cahec.cn.
Abstract: To shorten the detection time, a quadruple fluorescence RT-PCR method was established for detecting avian influenza virus with the related probes and primers designed and synthesized by analyzing the conservative sequences of M gene, HA gene of H5 subtype, H7 subtype and H9 subtype. This method can detect avian influenza virus, as well as H5 subtype, H7 subtype, and H9 subtype simultaneously. The results showed that the method was quick, specific, and the detection limitation was 10-5 ng·μL-1. Sixty avian influenza viruses were detected from 384 chicken swab samples from 13 living birds markets with the method. All the detected avian influenza viruses were H9 subtype. The results were consistent with the method reported in standard, NY/T 772-2013. The κ value for these two methods was 1 (P < 0.001). This method can realize the detection of avian influenza virus which has the characteristics of safety, specificity, rapidity, sensitivity, simplicity and high throughput. It will play an important role in the rapid detection of avian influenza virus.
Key words: avian influenza virus    H5 subtype    H7 subtype    H9 subtype    quadruple real-time fluorescence RT-PCR    

流感病毒属正黏病毒科流感病毒属，分为A、B、C、D 4型[1]。其中，引起禽流感(avian influenza，AI)的病原是A型流感病毒，称为禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)，该病毒的自然宿主是野生水禽，鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽也可以感染。禽流感病毒(AIV)的核酸是单股负链RNA，分8个节段[2]。根据表面结构蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)对AIV亚型进行了分类。截至目前，已发现18个HA亚型，11个NA亚型，其中，H1~H16亚型，N1~N9亚型在禽中分离到[3]，而H17~H18和N10~N11亚型在蝙蝠中分离到[4]。

根据AIV致病力的不同，可将禽流感分为低致病性禽流感(low pathogenic avain influenza，LPAI)和高致病性禽流感(high pathogenic avain influenza，HPAI)。LPAI虽然相对禽类而言致病性较弱，但是分布广，来源复杂，极容易继发其他致病菌或病毒感染，对养禽业存在较大潜在危害[5-7]，其中，H9亚型AIV流行最广[8-10]。HPAI被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)定为法定报告疫病，在我国被定义为一类动物疫病。我国HPAI病毒有H5和H7亚型，在1996年广东鹅体内首次发现H5N1亚型高致病性AIV并报道[11-12]，在2013年首次发现H7N9亚型AIV，之后又变异为HPAI病毒(HPAIV)[13]。HPAIV能造成家禽发病和死亡，给养殖户带来了巨大损失[14-16]。1997年，在香港的活禽市场流行的H5亚型高致病性AIV，在全球历史上首次感染了人并造成了死亡[17]。此后，欧洲、非洲、东南亚和中东地区也不断出现人因感染HPAIV而死亡的报道，HAPI的流行和疫情的暴发对公共卫生构成极大的威胁[18-23]。为满足AIV高通量快速检测的需要，笔者之前建立了针对AIV M基因的一种能够检测各亚型AIV的实时荧光RT-PCR检测方法[24]，但是该方法不能检测AIV的亚型。因此，本研究在该方法的基础上，建立了禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法，除了已有的针对M基因的引物和探针，又对H5、H7和H9亚型这3个主要流行亚型AIV的HA基因的序列保守区域进行比对分析，设计、合成并筛选了3组探针和引物。将4组引物探针组合，可在检测M基因的同时，又能检测H5、H7和H9亚型的HA基因，即在检测出禽流感病毒的同时，可初步确定其亚型，检测效率高，且有较高的灵敏度和特异性。

1 材料与方法 1.1 主要仪器试剂

PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit(Perfect Real Time)购自宝生物工程(大连)有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip购自BIO-RAD；Optically clear flat 8 Cap Strips购自Thermo Scientific；焦碳酸二乙酯购自上海生物工程技术服务有限公司；异丙醇、无水乙醇、EDTA、RNaseA等试剂均为进口或国产分析纯试剂。用到的设备主要有超净工作台(美国Forma Scientific)、高速台式离心机(德国Heraeus Biofuge primoR)、荧光定量PCR扩增仪(Bio-Rad CFX96 Real-time PCR System)、-70 ℃超低温冰箱(日本三洋MDF-383E型)和-25 ℃低温储存箱(DW-YL270)(中科美菱)等。

1.2 毒株和核酸提取

各亚型禽流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)和传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)毒株由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存，毒株详细信息见表 1。按照说明书操作，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，德国)提取病毒RNA。并使用Qubit核酸浓度测定仪及配套试剂测定RNA浓度。

表 1 病毒毒株信息 Table 1 Information of virus strains
1.3 引物和探针筛选

通过NCBI查找公开的禽流感病毒的M基因，H5、H7和H9亚型HA基因的序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以合适的碱基为目的片段，通过Oligo7引物设计软件进行荧光定量检测引物和探针设计与效果评价。并对多条引物、探针进行组合、筛选与检验，以期筛选出最优的引物和探针。

1.4 反应体系与反应条件

反应液每管50 μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 25.0 μL，5 U·μL-1 TaKaRa Ex Taq HS 1.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 1.0 μL，10 pmol·μL-1 M forward、M reverse和M probe各1.0 μL，10 pmol·μL-1 H5 forward、H5 reverse和H5 probe各1.0 μL，10 pmol·μL-1 H7 forward、H7 reverse和H7 probe各1.0 μL，10 pmol·μL-1 H9 forward、H9 reverse和H9 probe各1.0 μL，RNase Free dH2O 7 μL，待检测的样品RNA模板4 μL。

将检测反应条件设置：第一阶段，反应温度为42 ℃，反应时间为5 min；第二阶段，反应温度为95 ℃，反应时间为10 s，第三阶段，先将反应温度设定为95 ℃，反应5 s，然后，反应温度改为60 ℃，反应20 s(收集荧光)，40个循环。

结果描述及判定：阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤36.0，并出现特定的扩增曲线，则结果有效，否则此次试验结果视为无效。检测样品通道无Ct值并且无荧光扩增曲线，样品判为AIV阴性；出现ROX荧光扩增曲线，且Ct值≤36，没有HEX荧光、FAM荧光和CY5荧光扩增曲线，则判定为其他亚型AIV阳性；出现ROX荧光扩增曲线，且Ct值≤36，同时出现HEX荧光、FAM荧光和CY5荧光扩增曲线中的一种或多种，则判定为该荧光对应亚型的AIV阳性；无ROX荧光扩增曲线，但出现HEX荧光、FAM荧光和CY5荧光扩增曲线中的一种或多种，则需要重新检测进行复核。

1.5 特异性和灵敏度评估

采用上述反应体系与反应条件，检测表 1中的病毒RNA，以评估该检测方法的特异性。提取的A/avian/China/K144/2015、A/avian/China/S1291/2015、A/avian/China/A32/2012毒株核酸经Qubit核酸浓度测定仪测定RNA浓度后，将此3株病毒RNA稀释成1 ng·μL-1，再按照10倍梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6ng·μL-1，分别取4 μL作为反应模板，按照前述加样方法进行实时荧光定量RT-PCR核酸扩增。

1.6 临床样品检测

从某地区的13个场点采集了384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品，置于含有10%甘油和抗生素(含青霉素2 000 IU·mL-1、链霉素2 000 IU·mL-1、制霉菌素1 000 IU·mL-1，BSA 5 mg·mL-1)的PBS(pH 7.2)缓冲液中，-80 ℃保存。采集的样品涡旋混匀后，4 ℃ 10 000 r·min-1离心5 min，取上清使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，德国)提取病毒核酸[25]，-80 ℃保存。以提取出的RNA为模板进行四重荧光RT-PCR检测，根据前述反应体系添加各组分，病毒RNA模板为4 μL。同时采用农业行业标准《禽流感病毒RT-PCR检测方法》(NY/T 772—2013)中提供的方法进行检测[26]。

2 结果 2.1 引物和探针筛选

最终筛选出最适合的AIV通用检测引物M forward、M reverse和探针M probe，H5亚型AIV检测引物H5 forward、H5 reverse和探针H5 probe，H7亚型AIV检测引物H7 forward、H7 reverse和探针H7 probe，H9亚型AIV检测引物H9 forward、H9 reverse和探针H9 probe，其序列已申请发明专利(申请号：201910804140.7)(表 2)。其中，M probe为TaqMan荧光探针，标记ROX荧光，H5 probe为TaqMan荧光探针，标记HEX荧光，H7 probe为TaqMan荧光探针，标记FAM荧光，H9 probe为TaqMan荧光探针，标记CY5荧光。

表 2 最适引物及探针序列 Table 2 Optimal primer and probe sequence
2.2 特异性

结果显示，各亚型禽流感病毒(1~11号样品)RNA均可检测到ROX荧光，显示为M基因检测结果阳性，判定为AIV阳性。A/avian/China/QD1/2014和A/avian/China/K144/2015病毒RNA均可同时检测到HEX荧光，显示为H5亚型HA基因检测结果阳性，判定为H5亚型AIV阳性。A/avian/China/S1291/2015和A/avian/China/1605/2017病毒RNA均可同时检测到FAM荧光，显示为H7亚型HA基因检测结果阳性，判定为H7亚型AIV阳性。A/avian/China/A32/2012病毒RNA可同时检测到CY5荧光，显示为H9亚型HA基因检测结果阳性，判定为H9亚型AIV阳性。新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒及阴性对照对应的通道均未出现扩增曲线。结果表明，本试验筛选的引物和探针通过四重荧光RT-PCR方法检测AIV的特异性强。

2.3 灵敏度

2.3.1 M基因检测引物及探针灵敏度试验 　　结果显示，筛选出的AIV通用M基因检测引物和探针组合检测A/avian/China/K144/2015、A/avian/China/S1291/2015、A/avian/China/A32/2012毒株核酸可以出现有效扩增曲线的最低模板稀释度为10-5ng·μL-1，有较高的灵敏度。阴性对照所对应孔道未出现扩增曲线，试验结果成立(图 1)。

扩增曲线从左到右分别如下：1~7. 100~10-6 ng·μL-1 RNA；8.阴性对照 The amplification curves from left to right were as follows: 1-7.100-10-6 ng·μL-1 RNA; 8. Negative control 图 1 M基因灵敏度扩增曲线 Fig. 1 M gene sensitivity amplification curve

2.3.2 H5亚型检测引物及探针灵敏度试验 　　结果显示，筛选出的H5亚型AIV检测引物和探针组合检测A/avian/China/K144/2015毒株RNA可以出现有效扩增曲线的最低模板稀释度为10-5 ng·μL-1，有较高的灵敏度。阴性对照所对应孔道未出现扩增曲线，试验结果成立(图 2A)。

A.H5;B.H7;C.H9;扩增曲线从左到右分别如下：1~7.100~10-6 ng·μL-1 RNA；8.阴性对照 A.H5;B:H7;C.H9; The amplification curves from left to right were as follows: 1-7. 100-10-6 ng·μL-1 RNA; 8. Negative control 图 2 H5、H7和H9基因灵敏度扩增曲线 Fig. 2 H5, H7 and H9 gene sensitivity amplification curve

2.3.3 H7亚型检测引物及探针灵敏度试验 　　结果显示，筛选出的H7亚型AIV检测引物和探针组合检测A/avian/China/S1291/2015毒株核酸可以出现有效扩增曲线的最低模板稀释度为10-5 ng·μL-1，有较高的灵敏度。阴性对照所对应孔道未出现扩增曲线，试验结果成立(图 2B)。

2.3.4 H9亚型检测引物及探针灵敏度试验 　　结果显示，筛选出的H9亚型AIV检测引物和探针组合检测A/avian/China/A32/2012毒株核酸可以出现有效扩增曲线的最低模板稀释度为10-5 ng·μL-1，有较高的灵敏度。阴性对照所对应孔道未出现扩增曲线，试验结果成立(图 2C)。

2.4 临床试验结果

用建立的禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法对384份临床样品进行检测，从4个活禽市场共检出60份样品为禽流感病毒阳性，且全部为H9亚型。这13个活禽交易市场中H9亚型禽流感病毒场群阳性率为30.77%，个体阳性率为15.62%(表 3)。同时，采用农业行业标准《禽流感病毒RT-PCR检测方法》(NY/T 772—2013)中提供的方法进行检测，结果与该方法一致，符合率达到100%。结果表明，该方法具有一定的实用性，可以用于大量临床样品的快速分型检测。

表 3 临床样品检测结果 Table 3 Test results of clinical samples
3 讨论

在AIV的8个基因片段中，第4片段主要编码病毒颗粒表面可以识别、吸附于红细胞表面受体结构的血凝素(HA)蛋白。第6片段是主要的抗原决定簇之一，能编码从糖蛋白糖链上移除N-乙酰神经氨酸或唾液酸的神经氨酸酶(NA)蛋白。第4和第6片段变异率均较高，导致AIV变异较快，亚型较多。其中，H5、H7和H9亚型因流行较广、危害较大，最受关注[27-28]。目前，AIV的检测方法较多[28-31]，主要有血清学检测和病原学检测。血清学检测方法主要有血凝试验、血凝抑制试验、琼脂凝胶免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验。病原学检测方法中的分子生物学检测方法较常用，其中反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法较为常用。RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法通过设计引物实现特异性基因片段的扩增，可以直接检测病原，确定AIV不同亚型。荧光定量RT-PCR方法已在AIV的检测中得到普遍应用，但多为检测单一亚型或AIV各亚型通用的单重荧光定量RT-PCR方法[32]。本试验建立的AIV四重荧光RT-PCR检测方法，与农业行业标准《禽流感病毒RT-PCR检测方法》(NY/T772—2013)中提供的普通RT-PCR[26]检测方法相比，特异性和敏感度高，且在检测出AIV的同时可初步确定其亚型，提高了检测效率。

笔者用现行农业行业标准中提供的普通RT-PCR检测方法对所有临床样品进行检测，与本研究提供的方法进行结果比较，来确定检测结果的准确性。本研究对384份临床样品进行检测，结果显示，只有H9亚型AIV，而没有其他亚型AIV，因此，缺乏H5、H7亚型AIV临床样品的检测数据，存在不足之处。但是笔者在试验过程中用已知H5、H7亚型AIV核酸阳性的样品进行验证，结果显示方法可用。在设计4对引物和4条探针时，用Oligo7引物设计软件，首先选择特异性的区域作为目的片段，用软件对设计的引物和探针进行评价尽量避免出现引物二聚体、发卡结构等引物常见的特殊结构，筛选的对应各亚型的引物和探针用禽流感病毒核酸进行检测，避免出现交叉反应而造成假阳性、假阴性等问题。检测时使用的试剂提供了最优的反应体系和反应条件，根据提供的最佳条件筛选扩增效果最好的引物和探针。

该方法筛选的4组最佳引物和探针，检测M、H5、H7和H9基因引物探针对RNA模板的检测下限均为10-5 ng·μL-1，且在特异性试验过程中，各亚型AIV RNA模板对应的通道均出现了有效的荧光扩增曲线，其他禽常见病原及阴性对照检测均未出现扩增曲线。结果表明，本试验筛选的引物和探针，具有高灵敏度和特异性的特点，相比一般RT-PCR方法和病毒分离培养方法，四重荧光RT-PCR检测方法在短时间内可获得试验结果，其中通用检测方法的引物和探针可以检测所有亚型的AIV，而且在检测出AIV的同时可初步确定其是否为H5、H7或H9这3种主要流行亚型，大大提高了检测效率，并节省检测试剂，该方法可以应用在禽流感监测工作中。

4 结论

本研究建立的禽流感病毒(AIV)四重荧光RT-PCR检测方法，在检测出禽流感病毒的同时，还可以分型检测出H5、H7和H9亚型等主要流行亚型AIV，该方法特异性好、灵敏度高、耗时短，可以用于AIV的高通量快速检测，并进行初步分型，有较高的实用性。

参考文献
[1] LYONS D M, LAURING A S. Mutation and epistasis in influenza virus evolution[J]. Viruses, 2018, 10(8): 407.
[2] SUN W Q, LI J X, HU J, et al. Genetic analysis and biological characteristics of different internal gene origin H5N6 reassortment avian influenza virus in China in 2016[J]. Vet Microbiol, 2018, 219: 200–211.
[3] FOUCHIER R A M, MUNSTER V, WALLENSTEN A, et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls[J]. J Virol, 2005, 79(5): 2814–2822.
[4] WU Y, WU Y, TEFSEN B, et al. Bat-derived influenza-like viruses H17N10 and H18N11[J]. Trends Microbiol, 2014, 22(4): 183–191.
[5] SAMIR A, ADEL A, ARAFA A, et al. Molecular pathogenic and host range determinants of reassortant Egyptian low pathogenic avian influenza H9N2 viruses from backyard chicken[J]. Int J Vet Sci Med, 2019, 7(1): 10–19.
[6] CARNACCINI S, STOUTE S T, BICKFORD A A, et al. Pathology and tissue distribution of an LPAI H5N8 of north American lineage isolated from an outbreak in commercial Japanese quail (Coturnix c. japonica) in the central valley of california[J]. Avian Dis, 2016, 61(1): 70–76.
[7] CARNACCINI S, CROSSLEY B, BREITMEYER R, et al. Diagnosis and control of a LPAI H5N8 outbreak in a Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) commercial flock in the central valley of california[J]. Avian Dis, 2015, 59(2): 344–348.
[8] SUN Y P, LIU J H. H9N2 influenza virus in China:a cause of concern[J]. Protein Cell, 2015, 6(1): 18–25.
[9] LI X, SUN J, LV X R, et al. Novel reassortant avian influenza A(H9N2) virus isolate in migratory waterfowl in Hubei Province, China[J]. Front Microbiol, 2020, 11: 220.
[10] ALMAYAHI Z K, AL KINDI H, DAVIES C T, et al. First report of human infection with avian influenza A(H9N2) virus in Oman:the need for a One Health approach[J]. Int J Infect Dis, 2020, 91: 169–173.
[11] 陈化兰, 于康震, 步志高. 一株鹅源高致病力禽流感病毒分离株血凝素基因的分析[J]. 中国农业科学, 1999, 32(2): 87–92.
CHEN H L, YU K Z, BU Z G. Molecular analysis of hemagglutinin gene of a goose origin highly pathogenic avian influenza virus[J]. Scientia Agricultura Sinica, 1999, 32(2): 87–92. (in Chinese)
[12] PEIRIS J S M, DE JONG M, GUAN Y. Avian influenza virus (H5N1):a threat to human health[J]. Clin Microbiol Rev, 2007, 20(2): 243–267.
[13] KE Y H, WANG Y F, LIU S W, et al. High severity and fatality of human infections with avian influenza A(H7N9) infection in China[J]. Clin Infect Dis, 2013, 57(10): 1506–1507.
[14] KAKOGAWA M, ONUMA M, SAITO K, et al. Epidemiologic survey of avian influenza virus infection in shorebirds captured in hokkaido, Japan[J]. J Wildl Dis, 2020.
[15] JIANG W M, HOU G Y, LI J P, et al. Antigenic variant of highly pathogenic avian influenza A(H7N9) Virus, China, 2019[J]. Emerg Infect Dis, 2020, 26(2): 379–380.
[16] HASSAN K E, KING J, EL-KADY M, et al. Novel reassortant highly pathogenic avian influenza A(H5N2) virus in broiler chickens, egypt[J]. Emerg Infect Dis, 2020, 26(1): 129–133.
[17] SUBBARAO K, KLIMOV A, KATZ J, et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness[J]. Science, 1998, 279(5349): 393–396.
[18] MAHMOUD S H, MOSTAFA A, EL-SHESHENY R, et al. Evolution of H5-type avian influenza A virus towards mammalian tropism in egypt, 2014 to 2015[J]. Pathogens, 2019, 8(4): 224.
[19] ZHU W F, ZHOU J F, LI Z, et al. Biological characterisation of the emerged highly pathogenic avian influenza (HPAI) A(H7N9) viruses in humans, in mainland China, 2016 to 2017[J]. Euro Surveill, 2017, 22(19): 30533.
[20] YANG L, XIE J F, ZHANG Y, et al. Emergence of waterfowl-originated gene cassettes in HPAI H7N9 viruses caused severe human infection in Fujian, China[J]. Influenza Other Respir Viruses, 2019, 13(5): 496–503.
[21] DHINGRA M S, ARTOIS J, DELLICOUR S, et al. Geographical and historical patterns in the emergences of novel highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 and H7 viruses in poultry[J]. Front Vet Sci, 2018, 5: 84.
[22] SUN X D, KUNG N Y H, GAO L, et al. Social network analysis for poultry HPAI transmission[J]. Transbound Emerg Dis, 2018, 65(6): 1909–1919.
[23] WU L, MITAKE H, KISO M, et al. Characterization of H7N9 avian influenza viruses isolated from duck meat products[J]. Transbound Emerg Dis, 2020, 67(2): 792–798.
[24] 王楷宬, 王素春, 朱琳, 等. 禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国动物检疫, 2019, 36(4): 64–69.
WANG K C, WANG S C, ZHU L, et al. Establishment of real-time RT-PCR for detection of avian influenza virus[J]. China Animal Health Inspection, 2019, 36(4): 64–69. (in Chinese)
[25] QIU Y, CHEN J M, WANG T, et al. Detection of viromes of RNA viruses using the next generation sequencing libraries prepared by three methods[J]. Virus Res, 2017, 237: 22–26.
[26] 中华人民共和国农业部.禽流感病毒RT-PCR检测方法: NY/T 772—2013[S].北京: 中国农业出版社, 2014.
Ministry of Agriculture of the People's Republic of China. RT-PCR detection method for avian influenza viruses: NY/T 772-2013[S].Beijing: China Agri-culture Press, 2014. (in Chinese)
[27] BISWAS P K, GIASUDDIN M, CHOWDHURY P, et al. Incidence of contamination of live bird markets in Bangladesh with influenza A virus and subtypes H5, H7 and H9[J]. Transbound Emerg Dis, 2018, 65(3): 687–695.
[28] MING F, CHENG Y Q, REN C W, et al. Development of a DAS-ELISA for detection of H9N2 avian influenza virus[J]. J Virol Methods, 2019, 263: 38–43.
[29] SHI L, SUN J S, YANG Z P, et al. Development of a DNA microarray-based multiplex assay of avian influenza virus subtypes H5, H7, H9, N1, and N2[J]. Acta Virol, 2014, 58(1): 14–19.
[30] WANG X R, SHI L, TAO Q M, et al. A protein chip designed to differentiate visually antibodies in chickens which were infected by four different viruses[J]. J Virol Methods, 2010, 167(2): 119–124.
[31] XIAO M, XIE K X, DONG X H, et al. Ultrasensitive detection of avian influenza A (H7N9) virus using surface-enhanced Raman scattering-based lateral flow immunoassay strips[J]. Anal Chim Acta, 2019, 1053: 139–147.
[32] LIU L, ZHANG Y, CUI P F, et al. Development of a duplex TaqMan real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of newly emerged H5N6 influenza viruses[J]. Virol J, 2019, 16(1): 119.