2. 河南科技大学动物科技学院, 河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室, 洛阳 471003
2. Key-Disciplines Laboratory of Safety of Environment and Animal Product, College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Techology, Luoyang 471003, China
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是巴氏杆菌科的一种革兰阴性小杆菌，可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎或败血症，称为副猪嗜血杆菌病，又称革拉斯病(Glässer’s disease)[1]。该病呈世界性分布，是全球范围内危害养猪业的最主要细菌性传染病之一[2]。1992年，Kielstein和Rapp-Gabrielson[3]通过琼脂扩散试验建立了血清学分型方法，可将HPS分为至少15种血清型。在世界范围内，HPS以4和5型为主要流行血清型，其次是13、14型等，但其时空分布也有一定差异[4-10]。Kielstein和Rapp-Gabrielson[3]还依据参考菌株的仔猪毒力试验结果，将血清1、5、10、12、13、14型归为强毒力菌株，血清2、4、8、15型为中等毒力菌株，血清3、6、7、9、11型为无毒力菌株。然而，后续的研究表明HPS的血清型与毒力之间并不存在必然联系[11]。近年来，HPS的一些毒力相关基因被鉴定出来，但其在HPS感染过程中的分子致病机制均尚未得到证实[12-16]。因此，HPS毒力的鉴定仍然有赖于猪的感染试验。
目前，SPF猪[17-18]、剖腹产未吃初乳(cesarean-derived, colostrum-deprived, CDCD)仔猪[19]、自然分娩未吃初乳(naturally-arrowed, artificially-reared, NFCD)仔猪[20]和9~10周龄HPS抗体阴性仔猪[21-22]等均被成功应用到HPS动物试验相关研究中。但仔猪作为感染模型时，需要高标准的实验条件和环境，且经济成本较高。国内外学者探索了不同品系小鼠作为替代模型的可行性[23-25]，但目前仅BALB/c小鼠得到了广泛的应用。然而，笔者以BALB/c小鼠为替代模型的研究结果时，发现诸多学者的报道并不完全一致，同时, 缺乏BALB/c小鼠替代模型与仔猪相关性的研究[26-29]。
本研究用BALB/c小鼠和8~9周龄HPS抗体阴性的仔猪为攻毒模型，测定了36株HPS国内流行性血清型菌株的毒力，评价了BALB/c小鼠作为感染模型的可靠性，也为及时地了解这些流行性血清型菌株的潜在危害提供新的数据，从而有助于疾病的诊断和预防。
1 材料与方法 1.1 菌株、培养基与试剂36株HPS菌株，包括血清4型8株、5型12株、12型8株、13型8株，由河南科技大学兽医生物制品工程实验室分离鉴定并保存(相关背景资料见表 1)。TSA、TSB培养基购自美国BD公司。新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)购自美国Sigma公司。
1.2 实验动物6~8周龄SPF雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。8~9周龄仔猪购自河南省伊川县散养农户。本试验中所有仔猪均采集鼻拭子经PCR检测方法鉴定为HPS阴性[30]，采集血清经微量平板凝集试验(MAT)检测为HPS抗体阴性[31]。
1.3 小鼠毒力试验将5型H134株接种于含新生牛血清(终体积分数10%)和NAD(终质量浓度100 μg·mL-1)的TSA平板上，37 ℃培养24~48 h，挑取单菌落纯化培养24~36 h，取无菌PBS(pH 7.2)5~8 mL置于培养皿中，用灭菌的三角棒轻轻刮下菌落，并用移液器反复吹打充分混匀，将制备的菌液进行2倍倍比稀释3个梯度。将16只BALB/c小鼠分为4组(4只·组-1)，取上述原菌液及每个梯度稀释菌液分别对1组BALB/c小鼠进行腹腔接种(0.2 mL·只-1)。同时对原菌液活菌计数，确定接种的实际菌量。按同样的方法对其余的HPS培养、攻毒。每批次试验设立1组PBS空白对照。观察并记录发病及死亡情况，死亡小鼠立即剖检，记录病变情况，同时取心血、肺血分菌鉴定，并根据Reed-Muench法[32]计算小鼠半数致死量(50% lethal dose，LD50)。
1.4 仔猪毒力试验参考按“1.3”方法纯化菌种，挑取培养好的单菌落到含新生牛血清(终体积分数10%)和NAD(终质量浓度100 μg·mL-1)的TSB液体培养基中，37 ℃、180 r·min-1摇床培养12~16 h作为种子液。再将上述种子液按1:100的比例转接到相同的TSB液体培养基中，于37 ℃、180 r·min-1振荡培养10~14 h(在活菌含量最大时间点收获菌液，各菌株随时间变化的OD600 nm值及生长曲线详见笔者前期的研究[33])。取培养好的菌液3 mL腹腔注射5头仔猪，接种前仔猪断料、断水4 h，同时，对原菌液进行活菌计数，确定接种的实际菌量[34]。36株HPS分批次进行试验，每一批次均设置1组5头接种无菌PBS为对照。观察、记录发病及死亡情况，持续14 d，死亡猪立即剖检，取其心、肺等组织进行细菌分离鉴定。观察期结束后剖检所有剩余仔猪并检查其病变。根据仔猪的发病死亡情况对各HPS菌株进行量化评分(评分标准见结果部分表 2注释)。
1.5 数据统计分析比较各血清型的小鼠综合毒力时，以平均lgLD50值为参考，其值越大毒力越弱，值越小毒力越强。采用单因素方差分析(ANOVA)对各型菌株的lgLD50值进行检验，P < 0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。
比较各血清型的仔猪综合毒力时，为使比较的样本量和攻毒菌量统一，将血清4、12和13型菌株均与5型相对应的菌株(整体攻毒菌量区间接近的连续8株)进行比较(表 2注释)。以毒力结果的平均得分为参考，其值越大毒力越强，值越小毒力越弱。采用独立样本T检验(Student’s t test)对各型菌株的毒力得分进行检验，P < 0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。
数据分析使用SPSS 25.0软件。
2 结果 2.1 流行性血清型菌株的小鼠毒力试验4种血清型的菌株在攻毒小鼠后，发病小鼠表现出精神萎靡，被毛粗乱，不食或采食减少等症状。小鼠接种后3 d即停止死亡，未死亡小鼠能较快恢复精神状态和正常采食，空白对照组均未出现任何发病症状和死亡。对死亡小鼠剖检，从死亡小鼠的心血和肺血中均能分离到HPS，并能观察到心、肺、肾等器官是以出血、淤血为主的病理特征。
根据Reed-Muench法计算菌株的LD50，结果表明(表 1)，8株13型HPS的LD50介于1.75×108~8.45×108 CFU。其他3个血清型菌株的LD50值分布范围较广，均可分为两个区间。在8株4型HPS中，有4株的LD50为9.80×107~5.51×108CFU，另4株为2.14×109~4.60×109CFU。在8株12型HPS中，有4株的LD50在4.81×107~8.64×108CFU，另4株在1.58×109~7.01×109CFU；在12株5型HPS中，有3株的LD50在2.10×108~5.26×108 CFU，另9株在1.68×109~8.85×109 CFU。
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表 1 副猪嗜血杆菌不同流行血清型菌株的相关信息及其小鼠毒力试验结果 Table 1 Information of Haemophilas parasuis isolates and results of mice virulence tests on different serotypes |
取各lgLD50的几何平均值，从整体上分析各血清型菌株对小鼠的毒力，结果(表 1)表明，HPS 13型菌株的毒力整体表现最强，然后依次是4、12型，毒力最弱的为5型。但通过单因素ANOVA检验各组间的毒力差异进行比较(图 1)，结果表明，仅在5型与13型菌株之间毒力具有显著差异(P < 0.05)，其他各型菌株之间，毒力差异均不显著(P>0.05)。
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图 1 H.parasuis各血清型菌株的小鼠毒力试验对比结果 Fig. 1 Comparative results of mice virulence tests for each serovar strain of H.parasuis |
仔猪攻毒试验结果表明，对照组仔猪均没有出现任何发病症状。各血清型菌株攻毒后均出现典型副猪嗜血杆菌病的发病症状，主要表现为体温升高(40.5 ℃以上)，精神沉郁、食欲减退或废绝、呼吸困难、皮肤发绀、关节肿大，跛行等临床症状，后期出现被毛凌乱，消瘦，卧地不起、死亡等情况。死亡猪立即剖检，呈现以严重的浆液性、纤维素性渗出和败血症为特征(图 2)。从死亡猪的心和肺等各组织器官中均能分离到HPS。
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A.胸腔积液；B.腹腔有大量纤维素性渗出液；肠壁充血，粘连；C.心包增厚，典型“绒毛心”；D.肺淤血、出血、坏死；E.脾边缘梗死、被覆纤维素性伪膜；F.关节周围肿大，剖检呈胶胨状 A. Pleural effusion; B. Peritoneal fibrous exudate; Intestinal wall congestion, adhesions; C. Pericardial thickening, typical "fluff heart"; D. Pulmonary congestion, bleeding, necrosis; E. Spleen edge infarction, covered with fibrous pseudomembrane; F. Periarticular swelling, necropsy in peptone 图 2 副猪嗜血杆菌感染仔猪后死亡剖检症状图 Fig. 2 Symptoms of death after piglets infected with Haemophilus parasuis |
具体试验结果见表 2：5型HPS中，能导致攻毒仔猪全部死亡的有7株(7/12)，其余5株的致死率均在60%及以上。13型中，能导致仔猪全部死亡的有3株(3/8)，其余5株的致死率均为60%。4型中，能导致仔猪全部死亡的有2株(2/8)，能导致60%死亡的有4株，但也有2株仅能导致40%的仔猪死亡。12型菌株整体毒力表现最弱(表 2)。
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表 2 不同流行血清型菌株的仔猪毒力试验结果 Table 2 Piglet virulence test results of different serotypes |
在以5型HPS为参考对象，来比较其他3种血清型的整体毒力时，按照发病症状的严重程度计算综合得分(表 2)，并对其进行统计学对比分析(图 3)。结果表明，5型与4型相比，其综合毒力的平均得分为18.3和14.9，两者差异显著(P=0.039)；5型与12型相比，得分为18.6和13.0，两者差异显著(P=0.033)；5型与13型相比，得分为18.5和17.0，两者差异不显著(P=0.241)。这些数据结果表明，4种血清型中，综合毒力表现最强的为5型菌株，其次是13型、4型，综合毒力最弱的是12型；且5型的综合毒力显著强于4型(P=0.039)和12型(P=0.033)。
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图 3 H.parasuis 4、12和13型菌株与5型菌株的仔猪综合毒力的比较结果 Fig. 3 Comparison of comprehensive virulence of piglets of serovars 4, 12 and 13 with serovar 5 strains of H.parasuis |
小鼠毒力与仔猪毒力试验结果均表明，不同血清型菌株的毒力存在明显差异，同一血清型不同菌株间的毒力也存在明显差异。但在评估各型菌株的综合毒力时，小鼠毒力与仔猪毒力结果不一致。小鼠毒力试验结果表明，各血清型的整体毒力由强到弱依次是13、4、12、5型，且5型与13型相比差异显著(P < 0.05)；但仔猪毒力试验结果表明，各血清型的整体毒力由强到弱依次是5、13、4、12型，且5型的综合毒力显著强于4型和12型(P < 0.05)。另外，在仔猪毒力试验中，从各血清型菌株中分别选择表现为强、中、弱毒菌株各1株，然后与其小鼠毒力(LD50)进行比较分析，判定两者的一致性，结果表明(表 3)，HPS虽可致死小鼠，但所表现的毒力与仔猪毒力均不一致。
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表 3 小鼠与仔猪毒力试验对比分析 Table 3 Comparative analysis of mice and piglet virulence tests |
HPS具有血清型众多、呼吸道常在菌的特性，在体外培养时条件要求苛刻，生长时严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)[1]，但即使在相同的条件下培养，不同HPS分离株的生长速度也有所不同[35]，而当HPS置于生理盐水或PBS中时，42 ℃在1 h内，37 ℃在2 h内，25 ℃在8 h内即不能检测出HPS的活菌，在5 ℃保存8 h活菌数量下降轻微[36]。在做仔猪毒力试验时，HPS的这一生物学特性使各菌株的实际攻毒菌量存在差异，其中，最小攻毒菌量为2.63×109CFU，最大攻毒菌量为8.61×109CFU。2004年，Oliveira和Pijoan[37]研究表明，常规饲养的仔猪经腹腔内接种HPS 108~109 CFU的菌体时表现出纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，而接种106~107CFU的仔猪则不发病。用HPS抗体阴性的8~9周龄的仔猪为模型研究的36株HPS的毒力试验结果表明，该模型经腹腔注射HPS后成功地复制出了Glässer’s病，从而可以客观地评价不同分离株的毒力。据Kielstein-Rapp-Gabrielson血清学分型方案，将血清5、12、13型归为强毒力，血清4型为中等毒力[2]。但本研究中的仔猪毒力试验结果表明，4种血清型的整体毒力由强到弱依次是5、13、4、12型，虽然5型和13型HPS中有能100%致死所有接种仔猪的菌株，它们属于强毒力菌株(H94株、H194株)，但也有部分菌株不能完全致死所接种仔猪，属于中等毒力菌株或弱毒株(H134株、H201株)；8株4型HPS中，各自所接种的仔猪均出现了一定的死亡，部分菌株表现出强毒力(H47株、H57株)，而不能被统一地认定为中等毒力；研究结果以12型菌株的差异最为明显，其中H163株为强毒菌株，而H170、H173和157株虽能造成仔猪发病但死亡率却为0，表现出弱毒力或无毒力。这些结果与血清学分型方案并不完全一致，表明HPS的血清型与毒力之间并非存在着必然的联系。同样，在2010年Aragon等[38]研究中，属于毒力血清型4型和10型中的部分菌株对NFCD猪表现为不致病，属于无毒力血清型7型的菌株在仔猪中发生了严重的疾病；2016年，Yu等[25]对10株HPS分离株的研究表明，同一血清型的菌株对4周龄的约克猪表现出不同的毒力，因而证实HPS血清型与其毒力之间不具有相关性。实际上，HPS血清型和毒力之间的关系并没有很好地建立起来，因为一些血清型的毒力仅是使用每个血清型的参考菌株来确定的[3, 17]。
笔者以BALB/c小鼠为替代模型对国内最为流行的4种血清型HPS菌株的毒力试验结果表明，血清13型HPS的LD50介于1.75×108~8.45×108 CFU，而其他3个血清型菌株的LD50值分布范围较广，这一结果与李昂等[39]、林标声等[40]研究结果均表明HPS可以致死BALB/c小鼠，但与其所不同的是，在评估分离株的毒力时，他们未能将分离的HPS在仔猪上得到毒力的验证。本研究BALB/c小鼠与仔猪毒力试验结果并不一致，小鼠毒力试验结果表明，各血清型的整体毒力由强到弱依次是13、4、12、5型，且5型与13型相比差异显著(P < 0.05)；仔猪毒力试验结果表明，各血清型的整体毒力由强到弱依次是5、13、4、12，且5型与13型相比差异不显著(P>0.05)。同时，结果还表明，即使同一株HPS在小鼠与仔猪上的毒力表现也不一致。另外，从病理解剖的角度，笔者发现攻毒后HPS虽能致死BALB/c小鼠，但小鼠主要是以内脏器官出血性死亡为主。在考虑到猪才是HPS的感染宿主，其毒力结果能更好地说明这些流行菌株的毒力强弱，从而表明BALB/c小鼠作为替代模型测定HPS的毒力时具有一定的缺陷。
4 结论对我国最流行的血清4、5、12和13型副猪嗜血杆菌(共36株)进行了BALB/c小鼠和仔猪毒力试验的比较研究。综合比较HPS的小鼠和仔猪毒力试验结果，得出以下结论：1)4种国内流行性血清型菌株的整体毒力由强到弱依次是5、13、4和12型；2)同一血清型中均存在强毒和弱毒菌株，HPS的血清型与其毒力之间不具有相关性；3)HPS虽能致死BALB/c小鼠，但其毒力结果与仔猪毒力试验结果并不一致，表明其作为替代模型具有一定的缺陷。
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