阿留申病毒(amdoparvovirus)归属于细小病毒科(Parvoviridae)阿留申病毒属(Amdoparvovirus genus)[1]。目前，该属成员包括水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus, AMDV)、小熊猫阿留申病毒(Red panda amdoparvovirus, RpAPV)、臭鼬阿留申病毒(Skunk amdoparvovirus, SKAV)、貉狐阿留申病毒(Raccoon dog and arctic fox amdoparvovirus, RFAV)、赤狐阿留申病毒(Red fox fecal amdoparvovirus, RFFAV)和灰狐阿留申病毒(Gray fox amdoparvovirus, GFAV)[2-8]。阿留申病毒为单链DNA病毒，基因组长约5 kb，其基因组编码结构蛋白VP1、VP2和非结构蛋白NS1、NS2、NS3[9]。VP2是主要的衣壳蛋白，与病毒感染宿主范围、组织趋向性和毒力相关，是开发疫苗的候选蛋白[10]。NS1蛋白是最大的非结构蛋白，与病毒DNA复制、转录调控和衣壳组装密切相关，在病毒的复制过程中起重要作用[11]。AMDV可引起水貂的慢性疾病和持续性感染，以高蛋白血症、浆细胞增多和免疫复合物沉积为主要特征[12-14]。目前，阿留申病毒尚无有效疫苗和特异性药物[15]，预测潜在的表位、选择保护性表位以及构建表位疫苗是提高疫苗保护性免疫的关键。
本试验选取3个不同地区的6株RFAV进行克隆测序，使用不同软件对其VP2和NS1蛋白的理化性质、二级结构、翻译后修饰位点和抗原表位进行预测，并将预测的修饰位点、抗原表位与本实验室之前获得的RFAV及NCBI上公布的其他阿留申病毒种的序列进行比较分析，以期筛选出较保守的T细胞和B细胞抗原表位。此外，将已经验证的AMDV优势抗原表位与RFAV进行比较，总结其在RFAV中的特征。为进一步研究阿留申病毒VP2、NS1蛋白的抗原特征与免疫表位的发掘奠定基础。本研究使用不同的软件进行预测和综合分析，克服了单一参数模型的局限性，通过与阿留申病毒属的病毒进行比较分析，显著提高了抗原表位预测的准确性，为阿留申病毒疫苗的研制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 样品的采集和预处理乌苏里貉血清样品采自3个不同地区的乌苏里貉养殖场。将新鲜的血液样本500ⅹg (Eppendorf 5804/5804R, 德国)离心10 min或放于4 ℃冰箱中过夜，收集血清，-20 ℃冰箱中保存。用于RFAV检测和克隆。
1.2 主要试剂与仪器血液DNA直接PCR试剂盒购自辽宁生物医药有限公司；Trans 2K DNA Marker、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、大肠杆菌Trans感受态细胞、pEASY-T1载体购自北京全式金生物技术有限公司；生物安全柜购自上海博讯实业有限公司；NanoDrop核酸浓度测定仪ND2000购自Thermo公司；离心机购自Sigma公司。AMDV阳性、阴性血清由本实验室保存。
1.3 RFAV的克隆与测序1.3.1 引物设计 根据NCBI上公布的阿留申病毒的序列信息，在保守区域选择引物，并通过Oligo 7.0 (Molecular Biology Insights, Inc.，Cascade, CO, USA, http://www.oligo.net)进行验证。引物由大连TaKaRa生物技术公司合成。本试验引物序列见表 1。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
1.3.2 克隆及测序 用本实验室设计的阿留申病毒保守引物和血液DNA直接PCR试剂盒对乌苏里貉血清样品进行检测，AMDV阳性、阴性血清样本分别作为阳性和阴性对照。3个地区各筛选2份阳性样品进行克隆，分别命名为DA-RD17、DA-RD15、ZJ-L3、ZJ-L5、HB-Y4和HB-Y5。PCR总反应体系为40 μL，3.6 μL核酸释放剂加入到2.0 μL血清样本中裂解10 min。PCR反应液：32 μL PCR reaction buffer，上、下游引物(表 1)各1.5 μL，1 μL Taq酶，加RNase-free H2O至总反应体系为40 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，52~53 ℃ (表 1)退火35 s，72 ℃延伸1~2 min (表 1)，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖电泳验证。阳性产物用胶回收试剂盒纯化，连接pEASY-T1载体，转化Trans-T1感受态细胞，在LB固体培养基中过夜培养，挑取单菌落于LB液体培养基中扩大培养，菌液PCR鉴定正确后送公司测序(库美生物，长春)。用Lasergene软件(DNAStar)对序列进行组装分析，用MEGA 7.0将VP2和NS1基因序列翻译成蛋白序列[16]。
1.4 RFAV VP2和NS1蛋白序列预测分析利用ExPASy’s预测服务器ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)预测VP2、NS1蛋白基本理化性质[17]；GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)预测蛋白二级结构[18]；Motif Scan(https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)预测翻译后修饰位点[19]；Protean(DNAStar)分析其亲水性指数、柔韧性指数、可及性参数以及抗原指数，推测B细胞抗原表位的可能位置，并结合ABCpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)和IEDB(http://www.iedb.org/)方案预测结果筛选一致性B细胞线性表位[20-22]；联合Protean和IEDB在线软件预测T细胞抗原表位，筛选一致性T细胞表位。
以AMDV-G株(JN040434.1)的VP2、NS1蛋白序列作为残基定位参考。对预测的RFAV的B、T细胞抗原表位与NCBI上公布的RFAV、RpAPV、SKAV、RFFAV、AMDV的VP2、NS1蛋白序列进行比对，分析各表位氨基酸差异，排除突变集中区域，综合评价VP2和NS1蛋白的抗原表位区域，最终筛选相对保守的抗原表位。并对翻译后修饰位点的保守性进行分析，筛选完全保守的翻译后修饰位点，可进一步研究翻译后修饰位点对蛋白抗原性的影响。
2 结果 2.1 RFAV近全长序列的扩增RFAV血清样品PCR分段扩增后，产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 1，片段大小与目的条带基本符合，切胶回收并加载到pEASY-T1载体测序。
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A、B.NS-1、NS-2片段；M. Trans 2K DNA分子质量标准；1~6.RFAV样品DA-RD17、DA-RD15、ZJ-L3、ZJ-L5、HB-Y4和HB-Y5 A, B. PCR product of NS-1, NS-2; M. Trans 2K DNA marker; 1-6. RFAV sample of DA-RD17, DA-RD15, ZJ-L3, ZJ-L5, HB-Y4 and HB-Y5 图 1 RFAV PCR产物 Fig. 1 PCR amplification of RFAV |
本研究获得的RFAV基因组长4 327 bp，编码VP2蛋白的636个氨基酸，编码NS1蛋白的641个氨基酸。RFAV样品DA-RD17、DA-RD15、ZJ-L3、ZJ-L5、HB-Y4和HB-Y5的VP2蛋白相似性为96.5%~99.4%，NS1蛋白相似性为92.5%~97.7%。以DA-RD7为代表进行RFAV的抗原性分析。PortParam分析得到RFAV的VP2蛋白理论等电点为5.49，带正、负电荷数氨基酸分别为58、77个，总平均亲水性为-0.730，为亲水性蛋白质；NS1蛋白理论等电点为8.64，带正、负电荷数氨基酸分别为84、75个，总平均亲水性为-0.635，为亲水性蛋白质。B细胞抗原表位应具有亲水性高的特征，有利于与抗体的结合，因此，亲水性与蛋白的B细胞抗原表位密切相关。
2.3 RFAV蛋白二级结构分析GOR4预测结果显示，VP2蛋白二级结构中，α螺旋占17.77%，β片层占25.47%，无规则卷曲占56.76%。NS1蛋白α螺旋占28.97%，β片层占18.54%，无规则卷曲形成占52.49%。说明VP2和NS1蛋白二级结构以无规则卷曲为主。α螺旋、β片层结构规则不易形变，与抗体嵌合能力较差，且经常处于蛋白质内部，因而很少成为抗原表位。无规则卷曲结构易于扭曲、盘旋并位于蛋白质分子表面，有利于抗体嵌合，为B细胞优势抗原表位的可能性较大[23]。
2.4 RFAV翻译后修饰位点分析利用在线软件MotifScan(https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)预测RFAV蛋白翻译后修饰位点，结果如表 2。
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表 2 RFAV蛋白翻译后修饰位点预测 Table 2 Post-translational modification sites of deduced RFAV proteins |
B细胞抗原表位根据Protean、IEDB、ABCpred软件综合分析，VP2蛋白筛选出6个B细胞抗原表位，分别位于296—303、330—338、415—424、519—530、560—568和610—619位氨基酸残基附近。利用同样的方法对NS1蛋白进行综合分析，筛选出4个B细胞抗原表位，分别位186—211、333—338、528—541和581—586位氨基酸残基附近(表 3)。以上B细胞抗原表位均位于蛋白的亲水区和无规则卷曲区。
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表 3 RFAV主要蛋白抗原表位 Table 3 Antigenic epitopes of RFAV proteins |
T细胞抗原表位分别用AMPHI、Rothbard-Taylor和IEDB软件预测，预测结果有差异，也有部分重合，选择重合的部分作为优势T细胞抗原表位。VP2蛋白优势T细胞抗原表位有4个：53—59、197—211、275—310和396—412，而NS1蛋白有2个：225—239和588—602(表 3)。
VP2蛋白部分翻译后修饰位点在预测的RFAV抗原表位内，但多为磷酸化位点，如酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点304—307、421—424，蛋白激酶C磷酸化位点283—285、297—302，酪氨酸激酶磷酸化位点85—93；RFAV的NS1蛋白的翻译后修饰位点有部分位点在预测的RFAV的抗原表位内，如N-糖基化位点205—206、591—594、599—602，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点200—203、338，N-酰基化位点527—532，蛋白激酶C磷酸化位点596—598(表 2)。翻译后修饰对于蛋白的功能发挥具有重要意义，尤其是糖基化修饰，经糖基化修饰的蛋白可以引起特定的免疫反应、降低蛋白抗原的免疫原性，也有研究表明蛋白的糖基化修饰可能在病毒的免疫逃逸过程起着重要的作用[24]。
2.6 阿留申病毒蛋白保守抗原表位、翻译后修饰位点分析以AMDV-G(JN040434.1)株的VP2、NS1蛋白序列为残基位点定位序列，确定RFAV的VP2、NS1蛋白抗原表位、翻译后修饰位点所在氨基酸残基位置。将筛选的VP2、NS1蛋白B/T细胞抗原表位和翻译后修饰位点与本研究克隆的其他5份RFAV样品及阿留申病毒属内病毒相应蛋白进行比较分析。结果显示VP2蛋白B细胞抗原表位296—303、330—338、415—424在阿留申病毒属内变异位点较多，519—530、560—568、610—619相对保守(图 2A)；T细胞抗原表位275—310、396—412在阿留申病毒属内变异位点较多，其中275—298保守；而53—59、197—211相对保守(图 2B)。NS1蛋白B细胞抗原表位186—211、333—338、581—586在阿留申病毒属内变异位点较多，528—541相对保守；T细胞抗原表位225—239、588—602在阿留申病毒属内变异位点较多，但区段231—239、590—600相对保守(图 2C)。
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A. VP2蛋白B细胞抗原表位；B.VP2蛋白T细胞抗原表位；C. NS1蛋白B、T细胞抗原表位 A. Potential B cell epitopes of VP2 protein; B. Potential T cell epitopes of VP2 protein; C. Potential B and T cell epitopes of NS1 protein 图 2 VP2、NS1蛋白的抗原表位分析 Fig. 2 The comparison of the antigenic epitopes on VP2 and NS1 proteins of the typical members within Amdoparvovirus |
VP2蛋白翻译后修饰位点117SPK119、147TVTE150、283STR285、358GLQGSY363、390STR392、447SWEE450、459THFE462、553NLTD556在阿留申病毒属中完全保守，NS1蛋白翻译后修饰位点38YT39、318SKK320、340ED341、399TL400、423GK424、435GTGKTL440、456TTS458在阿留申病毒属内完全保守(图略)。
3 讨论本研究克隆并测序了来自不同地区的6株RFAV，为进一步开展RFAV分子研究提供材料。本实验室已收集RFAV丰富序列信息，为RFAV的主要蛋白VP2和NS1的免疫相关抗原性系统比较分析奠定基础。目前阿留申病毒疫苗的研制主要集中在VP2和NS1蛋白，但均为B细胞抗原表位的预测和验证，T细胞抗原表位尚未解析。已有研究表明AMDV-G的VP2蛋白386QQNFSTRYIYDRN398、428HTAKQPKLRTPPIHHSKID446、459THFEDEV-IYLDYFNF473为B细胞优势抗原表位[25-28]，NS1蛋白302TKVTSKKEVANPVQQPSKKL321为B细胞优势抗原表位[29]。以AMDV非结构蛋白NS1接种水貂，只对接种水貂产生部分保护[30]。将上述优势抗原表位与RFAV进行比较分析，其中，459THFEDE-VIYLDYFNF473在RFAV的VP2蛋白中完全保守。其他优势表位在RFAV中有部分位点发生突变，如VP2蛋白Y395→395F、R436→436S的突变，NS1蛋白K308→308R/G、N312→312E、V314→A314、Q315→315K、L321→321M的突变，但通常是性质相同、相近或种类相同的氨基酸之间发生相互替换。这些位置的氨基酸可能在抗原抗体的识别、结合和相互作用中起重要作用，这些表位也可能是RFAV的优势抗原表位。
本研究结合RFAV的VP2、NS1蛋白的二级结构、亲疏水性特征对其B、T细胞抗原表位进行筛选及分析。结果表明，预测的B细胞抗原表位位于蛋白的无规则卷曲区域，具有亲水性高、柔韧性好、表面可及性大、抗原性指数高的特征。预测的T细胞抗原表位是基于MHC-Ⅱ类分子与抗原肽的结合的分值高低进行筛选，主要是线性短肽。部分B、T细胞抗原表位覆盖翻译后修饰位点。研究表明参与免疫反应的大多数分子是经糖基化修饰后的糖蛋白，例如免疫球蛋白、细胞因子、补体系统等[31-32]。人免疫缺陷病毒(HIV)的gp120分子高度糖基化使机体免疫系统误将gp120分子识别为自身分子或通过空间位阻作用使病毒更易于逃避中和抗体的中和作用[31]。丙型肝炎病毒(HCV)的包膜糖蛋白上的N-糖苷可影响某些抗原表位而抑制适应性免疫应答，使病毒逃逸机体的免疫攻击[32]。说明蛋白的糖基化修饰可能在病毒的免疫逃逸过程起着重要的作用。而磷酸化修饰的病毒蛋白参与调控病毒复制、病毒增殖和病毒粒子装配等一系列病毒的代谢活动，同时，也影响宿主细胞内的信号转导，抑制宿主基因组复制和表达[33-36]。位于RFAV的VP2、NS1蛋白B、T细胞抗原表位区内的翻译后修饰位点是否与蛋白抗原性相关，尚需进一步验证。目前，研究抗原糖基化与免疫之间的关系, 通过糖基化的改变使病毒抗原成为有效的抗病毒疫苗是一种新的研究思路。
在阿留申病毒属内，RFAV的VP2蛋白B细胞抗原表位519—530、560—568、610—619相对保守，这与之前试验确定的AMDV的VP2蛋白B细胞抗原表位386—398、428—446和459—473不同[25-28]，但通过ABCpred软件预测的RFAV的VP2蛋白B细胞抗原表位422—438、442—458可覆盖AMDV的428—448表位，IEDB软件预测的RFAV的B细胞抗原表位382—388、435—444、462—471与AMDV的386—398、428—446、459—473部分覆盖。NS1蛋白B细胞抗原表位528—541相对保守。这与之前试验确定的AMDV的NS1蛋白B细胞抗原表位302—321不同，但通过ABCpred、IEDB、Protean软件预测的RFAV的NS1蛋白B细胞抗原表位298—304、319—324与AMDV的302—321部分覆盖。说明软件预测有一定的可靠性，推测阿留申病毒尚有未发现或验证的抗原表位。VP2蛋白T细胞抗原表位53—59、197—211、275—298相对保守，NS1蛋白T细胞抗原表位231—239、590—600相对保守。但哪些表位能诱导机体发生特异性细胞免疫和体液免疫还需进一步验证。
4 结论成功克隆了貉源阿留申病毒近全长基因组序列(4 327 bp)，全面对RFAV的VP2、NS1蛋白抗原表位、翻译后修饰位点进行预测，并分析其在阿留申病毒属内的保守和变异特征，为阿留申病毒免疫研究提供参考。
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