2. 四川省畜牧科学研究院, 成都 610066;
3. 四川省动物疫病预防控制中心, 成都 610041;
4. 成都正大农牧食品有限公司, 成都 610081;
5. 四川大学生命科学学院, 成都 610064
, KANG Runmin2, ZHANG Yi3, XIE Bo4, YU Jifeng2, LI Chun3, ZHANG Bin1, TANG Cheng1, WANG Hongning5
2. Sichuan Animal Science Academy, Chengdu 610066, China;
3. Sichuan Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention, Chengdu 610041, China;
4. Chengdu Chia Tai Agro-industry & Food Co., Ltd., Chengdu 610081, China;
5. College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus, PRRSV)引起的一种急性、高度接触性传染病。1995年末，PRRS首次在我国华北地区发现[1]。2006年，我国大面积暴发高致病性PRRS (HP-PRRS)，给我国养猪业造成了巨大经济损失[2]。2013—2014年，我国再次广泛暴发PRRS，经病原分离鉴定为NADC30-like毒株[3]，表明我国PRRSV毒株流行情况变得愈加复杂。尽管我国目前有数种疫苗使用于临床中，但其保护效果仍不够理想，特别是PRRSV-2 NADC30-like毒株的大量出现，我国PRRS防控面临着新的难题与挑战。
PRRSV基因组为15.1~15.4 kb，编码至少10个开放阅读框(ORF)，包括ORF1a、1b、2a、2b、3~7和5a[4]。基因组两端分别为非翻译区域(UTR): 5′-UTR和3′-UTR。PRRSV主要分为两个基因型：PRRSV-1(代表株Lelystad virus，LV)和PRRSV-2(代表株VR-2332)[5]。根据Shi等[6]利用ORF5基因对全球PRRSV毒株进行遗传演化分析，将美洲型PRRSV毒株分为9个谱系(Lineage)。目前，中国流行的PRRSV-2毒株主要分为5个谱系：谱系8(JXA1-like和CH-1a-like)、谱系5(VR-2332-like)、谱系3(QYYZ-like)、谱系1(NADC30-like)和谱系9[7-8]。
PRRSV作为RNA病毒，其基因组常常会出现突变和遗传重组的现象。本研究为了解我国西南地区PRRSV毒株的全基因组遗传变异情况，将2016至2018年间检测到的8份疑似发生基因重组的PRRSV阳性样品接种于原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进行病毒分离，进一步对分离毒株进行全基因组序列测定和遗传演化及重组分析。
1 材料与方法 1.1 临床样品采集与处理2016—2018年，使用RT-PCR方法先后从我国西南地区(四川、贵州)规模化养猪场的病料中检测到PRRSV阳性样品8份。采集病料组织样品1~2 g，经无菌剪刀剪碎后置于无菌EP管中，加入适量预冷PBS (pH 7.0)后，放入组织研磨机进行研磨(3 000 r·min-1，10 min)，反复冻融3次后，离心(5 000 r·min-1，5 min)，取上清200 μL加入800 μL TRIzol Regent提取总RNA。剩余样品冻存于-80 ℃冰箱备用。
1.2 主要试剂及仪器TRIzol Reagent购于Life Technology公司；PrimeScriptTM RT Reagent kit、pMD19-T载体、DH5α感受态细胞、5′/3′RACE试剂盒等购于TaKaRa公司；DNA Marker、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购于成都擎科生物有限公司；PAMs分离于4~6周龄健康仔猪，分离后冻存于液氮中保存备用。PRRSV N蛋白兔源多克隆抗体购自美国GeneTex公司、羊抗兔IgG荧光抗体购自Proteintech公司。PCR扩增仪、凝胶成像系统为Bio-Rad公司(美国)产品；高速冷冻离心机为Eppendorf公司(德国)产品。
1.3 引物设计及病料样品的RT-PCR扩增根据GenBank中公布的PRRSV-2代表毒株JXA1(EF112445)、VR-2332 (AY150564)、NADC30(JN654459)和QYYZ(JQ308798)等基因序列，设计12对扩增PRRSV的重叠基因片段简并引物，引物参见文献[9]。引物由成都擎科生物有限公司合成。利用TRIzol Regent提取样品总RNA后，经反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA。病毒基因组的5′和3′端序列由5′/3′RACE试剂盒(TaKaRa)扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后采用Gel Extraction Kit回收纯化目的片段，克隆至pMD19-T载体，经鉴定后重组阳性质粒由成都擎科生物公司进行测序。
1.4 PRRSV的分离鉴定取研磨后的组织样品上清液进行稀释，然后经0.22 μm的滤器过滤，感染原代PAMs，病料接种后置于37 ℃、5% CO2培养箱中感染2 h，而后吸出病毒接种液，加入RPMI-1640培养基1 mL清洗后弃掉。每孔补加含有2% FBS的RPMI-1640培养基2 mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养3~4 d，每间隔12 h观察细胞状态，将出现50%以上细胞病变(CPE)的细胞吸取出冻存于-80 ℃冰箱中备用。分别使用RT-PCR和间接免疫荧光法(IFA)对分离的病毒进行鉴定。使用引物为ORF5-F：AATGAGGTGGGCTACAACC/ORF5-R；ORF5-R：GCGTGACACCTTAAGGGCGT，目的片段大小为755 bp。
1.5 PRRSV的全基因组扩增与序列拼接使用上述设计的PRRSV全基因组测序引物，对分离的病毒进行分段PCR扩增，经目的条带切胶回收、克隆pMD19-T载体后挑取阳性单克隆，送至成都擎科有限公司测序。使用5′/3′RACE试剂盒对病毒基因组5′-和3′-UTR端序列进行确定。应用DNAstar软件包中的SeqMan程序对片段序列重叠区进行拼接，得到完整的PRRSV全基因组序列。
1.6 PRRSV毒株全基因组同源性和遗传演化分析应用MEGA 6.0软件用将本研究中获得的PRRSV全基因组序列，以及从GenBank中下载的国内外报道的PRRSV代表毒株进行序列比对。应用MEGA6.0软件和DNAstar软件包中的MegAlign软件对全基因组序列的核苷酸和氨基酸同源性、位点突变分析，使用MEGA软件对全基因组序列进行遗传演化分析。
1.7 PRRSV的全基因组遗传重组分析使用Simplot重组分析软件对分离得到的PRRSV毒株进行全基因组的遗传重组分析，设置200 bp滑动窗口和基因组20 bp的滑动步伐。同时，使用重组分析软件RDP4对毒株的重组事件及重组断点进一步鉴定，选择7种统计方法(RDP、Bootscan、GENECONV、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq)进行分析。
2 结果 2.1 PRRSV毒株分离鉴定PAMs接种病毒液后，在48~72 h后出现明显的细胞病变，大量细胞变性、崩解、脱落，大量死细胞悬浮于培养液中。使用引物对ORF5-F/ORF5-R进行RT-PCR扩增ORF5基因片段，结果表明，均获得了约为750 bp目的片段，与预期相符。IFA试验显示，PRRSV感染组PAMs呈现明显的绿色荧光，而对照组未呈现明显的绿色荧光。RT-PCR与IFA试验均为阳性，结果表明，共成功分离到8株PRRSV毒株(表 1)。
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表 1 8株PRRSV分离株的样品背景和分离信息 Table 1 The information of the 8 PRRSV isolates |
使用设计的简并引物对上述8个PRRSV分离株进行全基因组PCR扩增，电泳结果显示，PCR扩增所得14个片段大小在500~2 000 bp之间，与预期目的片段大小一致(图 1)，无明显非特异性扩增。
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M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1~14.SCcd17株的14个扩增片段 M.DL2000 DNA marker; 1-14. 14 fragments of SCcd17 图 1 PRRSV分离株全基因组RT-PCR扩增凝胶电泳图 Fig. 1 Amplification of PRRSV isolates' whole genome by RT-PCR |
使用SeqMan软件拼接基因序列，获得PRRSV分离株全基因组序列。结果显示，8个毒株全基因组大小在15 010~15 321 nt(不含poly-A尾序列)，分别为SCcd16(15 321 nt)、SCnj16(15 321 nt)、SCcd17 (15 016 nt)、SCN17(15 010 nt)、SCxyz17(15 016 nt)、GZgy17(15 264 nt)、SCya17(15 316 nt)、SCya18(15 015 nt)。
2.4 PRRSV分离株全基因组同源性分析8个PRRSV分离株全基因组核苷酸相似性为80.9%~91.7%；与PRRSV-2代表株VR-2332、CH-1a、JXA1、QYYZ和NADC30核苷酸相似性分别为83.1%~87.1%、82.2%~90.7%、82.1%~93.2%、78.9%~85.9%和81.8%~94.5%；与PRRSV-1代表株LV核苷酸相似性仅为58.3%~59.1%，表明8个分离株均为PRRSV-2型，且基因组相似性差异较大。
2.5 Nsp2和ORF5基因推导氨基酸分析对8条PRRSV分离株的Nsp2高变区基因推导的氨基酸序列进行比对分析，结果显示，4个毒株(SCcd16、SCnj16、GZgy17、SCya17)的Nsp2氨基酸序列显示带有30个不连续氨基酸缺失(1+29 aa)，分别位于第481位点和533—562位点，与HP-PRRSV代表株JXA1缺失位置一致。其中，GZgy17还出现了额外的19 aa缺失。另外4个毒株(SCcd17、SCN17、SCxyz17、SCya18)的Nsp2氨基酸序列显示带有131个不连续氨基酸缺失(111+1+19 aa)，分别位于323—433、483和504—522位点，与PRRSV-2型代表株NADC30缺失位置一致(图 2a)。对ORF5基因推导的氨基酸序列比对结果显示，有3个毒株(SCcd17、SCxyz17、SCN17)的GP5序列均在33位点出现1 aa的缺失(图 2b)。
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NADC30-like毒株Nsp2 aa缺失模式( )；HP-PRRSV-like毒株Nsp2 aa缺失模式( )；中国西南地区PRRSV毒株Nsp2其他aa缺失模式( ，图a)；ORF5 aa缺失模式(，图b)
aa deletions in Nsp2 of NADC30-like strains(); aa deletions in Nsp2 of HP-PRRSV-like strains(); aa deletions in Nsp2 of other PRRSV strains in southwestern China(, Fig.a); aa deletions in ORF5(, Fig.b)
图 2 Nsp2(a)和ORF5(b)基因推导的氨基酸序列比对分析
Fig. 2
Alignment analysis of Nsp2 (a) and ORF5 (b) deduced amino acid sequences
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8株PRRSV分离株全基因组遗传演化分析表明，3个分离株(GZgy17、SCcd16和SCya17)属于谱系8(JXA1-like)毒株，4个分离株(SCcd17、SCN17、SCxyz17和SCya18)属于谱系1(NADC30-like)毒株，没有谱系3(QYYZ-like)和谱系5(VR-2332-like)毒株，剩余1个分离株(SCnj16)则分化较大，处于谱系1和谱系5之间(图 3)。
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▲.分离株；■.代表株 ▲. Isolates; ■. Reference strains 图 3 8株PRRSV分离株全基因组遗传演化分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis of 8 PRRSV isolates based on the full-length genomic sequences |
使用重组分析软件(RDP4和SimPlot软件)对这8株病毒全基因组进行遗传重组分析。将分离毒株作为目的比对序列，各亚群代表毒株(JXA1、VR-2332、CH-1a、QYYZ和NADC30)或中国流行的PRRSV毒株作为参考序列，使用重组分析软件Simplot和RDP4对其毒株全基因组序列进行遗传重组分析。结果显示，2016—2018年8株西南地区的PRRSV分离株共表现出6种不同的重组方式，分别如下，1) SCnj16: L8+L1; 2) SCxyz17: L1+L5; 3) SCya18: L1+L3; 4) GZgy17: L8+L3; 5) SCcd17和SCN17: L1+L8+L5; 6) SCcd16和SCya17: L1+L8+L3(图 4)。
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a. SCnj16; b. SCcd16; c. SCcd17; d. SCya17; e. SCN17; f. GZgy17; g. SCxyz17; h. SCya18 图 4 8株PRRSV分离株全基因组重组分析结果 Fig. 4 Results of the recombination analysis of 8 PRRSV isolates based on the whole genomes |
PRRSV是造成我国养猪业中严重经济损失的重要病原之一。2006年，以Nsp2中含有独特的不连续30 aa缺失的HP-PRRSV毒株在我国大范围暴发，造成我国养猪业严重的创伤[2]。随后的十年中，我国HP-PRRSV毒株的遗传多样性通过快速突变和重组事件而大量激增[10]。特别是QYYZ-like毒株和NADC30-like毒株在我国开始出现后，更加增加了我国PRRSV临床毒株的遗传多样性和复杂性[3, 11]。
重组现象在RNA病毒中较为常见。自从2013—2014年NADC30-like毒株(L1)在中国流行以来，临床上发现了大量NADC30-like毒株和其他谱系毒株发生重组的毒株，如与JXA1-like毒株(L8)重组的JL580、FJ1402、HENAN-HEB、15HEN1和HNhx等毒株[12-15]，与VR-2332-like毒株(L5)重组的HENAN-XINX、Chsx1401和HNyc15等毒株[3, 14, 16]，表明NADC30-like毒株具有易于与其他谱系毒株发生基因重组的特点。自2010年QYYZ-like毒株(谱系3)在广州地区首次出现后，也出现与RespPRRS MLV疫苗株(L5)重组的现象，(GM2毒株)和与JXA1-like毒株重组的现象(GD1404和GDsg毒株)[17-18]。
本研究通过对8个PRRSV毒株全基因组遗传重组分析发现，8个毒株表现出6种不同的重组方式，其中4个毒株(SCnj16、SCxyz17、GZgy17和SCya18)表现为两个谱系间不同的重组方式(L1+L8、L1+L5、L1+L3和L8+L3)，而另外4个毒株(SCcd16、SCya17、SCcd17和SCN17)显示为3个谱系间的重组(L1+L8+L5和L1+L8+L3)。而L1+L3、L1+L5+L8和L1+L3+L8重组方式均为我国西南地区率先报道[19-21]。随后，山东地区也报道出现3个谱系间重组的PRRSV毒株SD17-38(MH068878)，其重组方式同样是L1+L5+L8[22]。根据Liu等[23]最近报道，我国福建地区发现更为复杂的PRRSV重组毒株，FJLIUY-2017，全基因组遗传重组分析该毒株来自于4个谱系间的重组，即L1+L3+L5+L8。以上PRRSV不同重组方式的出现，其原因可能是我国PRRSV临床毒株具有丰富的遗传多样性，一个养殖场里可能有两种或多种谱系毒株共存，导致PRRSV基因组经历着错综复杂的遗传变异过程。同时，本研究中也发现了NADC30-like毒株(SCN17和SCxyz17)和疫苗株(RespPRRS MLV)重组的现象，而NADC30-like毒株与其他PRRSV疫苗株(JXA1-R、TJM-F92和HuN4-F112)的重组毒株也均有报道[24-26]，因此，我国的PRRS防控形势非常严峻。
2015年，Zhao等[12]报道了一株高致病性PRRSV重组毒株JL580，重组方式为NADC30-like毒株(L1)和HP-PRRSV毒株(L8)重组，该毒株对6周龄仔猪死亡率高达100%，而2016—2018年间我国报道的各种类型的重组毒株表现出不尽相同的致病性[12, 27-30]，可能与毒株重组方式或亲本株有关。本研究在2016—2018年间四川和贵州地区共发现了6种不同重组方式的PRRSV毒株，其重组方式是否导致毒株致病性的改变还需进一步探究。总之，本研究对我国西南地区PRRSV毒株进行流行病学监测，对该地区PRRS防控工作有重要意义。
4 结论对我国西南地区2016—2018年间分离到的8株PRRSV毒株进行全基因组测序分析，结果显示，8个毒株表现出多种类型的氨基酸缺失模式，并且还出现PRRSV-2毒株间多种不同谱系间的重组，表明该地区PRRSV毒株不仅多种谱系毒株并存，并且各谱系毒株间经历着复杂的遗传重组事件，因此，应继续对我国的PRRSV毒株进行密切关注和跟踪监测，及时了解PRRSV最新变异情况，本研究对PRRSV基因组遗传变异和新型毒株预警具有重要意义。
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