旋毛虫(Trichinella spiralis，T. spiralis)是一种能感染哺乳动物、鸟类和爬行类等100多种宿主的呈世界性分布的线虫，是重要的人兽共患病病原之一[1]。旋毛虫病在世界范围内流行，造成重大的公共卫生安全隐患[2]，现已被世界卫生组织列入复发性公共卫生疾病[3]。
二肽基肽酶1(dipeptidyl-peptidase 1, Dpp1)是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶家族的溶酶体蛋白酶，也称为半胱氨酸组织蛋白酶C[4-5]。Dpp1在人上的研究较多，已证实这一基因的突变会导致早发性牙周炎等疾病[6]。寄生虫中的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶在虫体生长、细胞分化、信号传导和宿主侵袭中具有不可或缺的作用[7]，并通过蛋白水解降解宿主免疫系统而充当毒力因子[8]。在旋毛虫体内也有不同类型的半胱氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶B已证实在旋毛虫入侵肠黏膜过程中发挥作用[9]。研究发现二肽基肽酶1负责在弱酸性条件下非特异性蛋白质降解并降低溶酶体的环境[10]，提示其在寄生虫的入侵以及免疫逃避等环节发挥作用，在弓形虫上的研究发现其对虫体侵入细胞发挥重要作用，针对弓形虫组织蛋白酶C研发的DNA疫苗被证实对大鼠抗弓形虫有效[11]。本实验室前期所做的旋毛虫差异蛋白组学结果发现，旋毛虫二肽基肽酶1为差异表达蛋白[12]，其在旋毛虫肌肉幼虫中的表达量是新生幼虫的15倍，研究不同阶段旋毛虫差异性表达的蛋白有助于进一步了解旋毛虫的发育过程和入侵感染的机制。但Dpp1在旋毛虫以及对宿主的功能尚不清楚，因此，本研究选取旋毛虫二肽基肽酶1进行研究。
本试验根据GenBank上公布的旋毛虫Dpp1基因序列(Tsp_02997)，对该基因进行了克隆和原核表达，通过体外试验分析rDpp1对大鼠PBMCs的影响，为探究该蛋白质与宿主间的相互作用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料1.1.1 实验动物和虫株 实验动物为Wistar大鼠和BALB/c小鼠，购自扬州大学实验动物中心。虫株为中国河南猪旋毛虫分离株，国际编号ISS534，由本实验室传代保存于BALB/c小鼠体内。
1.1.2 质粒和菌种 大肠杆菌DH5α、BL21菌种及pET-32a(+)载体均由本实验室保存。
1.1.3 主要试剂 T4DNA连接酶、限制性内切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、DL2000、DL5000 DNA Marker以及2×Phanta® Master Mix品牌为宝生物(TaKaRa)；Cy3标记的山羊抗大鼠IgG(H+L)、DAPI细胞核染液、抗荧光淬灭封片液、Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、NO检测试剂盒和细胞凋亡试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司；FITC-dextran为Sigma公司产品；Millcell® Hanging Cell Culture Inserts为Merck-Millipore公司产品；Annexin V-FITC Kit为南京福麦斯生物公司产品；大鼠外周血淋巴细胞分离液为北京索莱宝科技有限公司产品；RPMI 1640细胞培养液和青链霉素从Gibco公司购买；胎牛血清为Lifetechnologies公司产品；12孔、24孔、96孔Costar®细胞培养板购自Corning公司。
1.2 Dpp1基因的克隆与表达1.2.1 引物的设计 根据旋毛虫Dpp1基因序列(GenBank登录号：Tsp_02997)设计引物，序列全长1 347 bp，根据其序列推导出氨基酸序列，并对蛋白进行生物信息学分析。用Primer 5.0软件设计引物，上游引物：5′TCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGGATGGCCGACACACCCTG3′；下游引物：5′GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAAATGTTGGAATGGGTGTT3′，斜体序列代表pET-32a载体同源臂，下划线处序列分别代表上下游引物的酶切位点Hind Ⅲ和Xho Ⅰ，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
1.2.2 目的基因扩增与原核表达载体构建 使用本实验室保种的旋毛虫提取RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，用以上引物进行PCR反应。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
扩大反应体系，胶回收反应产物。用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切pET-32a(+)载体，使用同源重组方法进行连接，转化连接产物至DH5α感受态细胞中，挑取单克隆，选取阳性质粒，命名为pET-32a(+)-Dpp1。将质粒转化至BL21感受态细胞，挑取单克隆。
1.2.3 重组蛋白的表达与纯化 将单克隆接种于LB液体培养基中，添加氨苄青霉素(终质量浓度50 μg·mL-1)，37 ℃，180 r·min-1振荡培养，于OD600 nm值为0.4~0.6时加入IPTG(终浓度1 mmol·L-1)再诱导5 h。离心收集菌体沉淀，沉淀重悬后进行超声破碎，SDS-PAGE检测蛋白分布情况。扩大体系，收获表达产物，使用His蛋白纯化柱进行纯化，经SDS-PAGE验证后，将重组蛋白质(记作rDpp1)放入含梯度浓度(6、4、2、0 mol·L-1)尿素的复性缓冲液中分别复性透析，浓缩蛋白并测定其浓度，过滤后分装冻存。
1.2.4 重组蛋白抗血清的制备 取雌性Wistar大鼠，将200 μg重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，在大鼠背部皮下注射进行第1次免疫。两周后将与首免同等体积的重组蛋白混合弗氏不完全佐剂乳化后，进行第2次免疫。之后，每隔1周进行第3次免疫和第4次免疫。第4次免疫1周后，眼眶采血，分离血清并分装，-20 ℃冻存备用。
1.2.5 重组蛋白的Western blot分析 取重组蛋白进行SDS-PAGE并转印于PVDF膜上；5%脱脂奶粉配成的封闭液4 ℃封闭过夜；分别以感染旋毛虫的小鼠血清以及健康小鼠血清为一抗(1:100稀释)，37 ℃孵育2 h，TBST清洗3次；以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5 000稀释)，37 ℃孵育2 h，TBST清洗3次。以DAB显色后拍照。
1.3 重组蛋白与大鼠PBMCs的结合及对细胞功能的影响1.3.1大鼠PBMCs的分离与培养从Wistar大鼠眼眶下静脉无菌采取抗凝血，按说明书分离大鼠PBMCs，用台盼蓝染色检验，确定细胞活力均在95%以上。用含10%灭活FBS、1%双抗的RPMI 1640培养液重悬细胞，将细胞浓度调整为1×106·mL-1，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。
1.3.2 重组蛋白与大鼠PBMCs的结合 在12孔细胞培养板中，每孔加入1 mL PBMCs悬液，分别加入终质量浓度为10 μg·mL-1 rDpp1和同浓度的pET-32a载体蛋白，另外设置空白细胞对照组，37 ℃ 5%CO2培养箱培养1 h。离心收集细胞，PBS洗涤3次，用PBS重悬，滴加于防脱载玻片上，室温静置10 min；滴加4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3次；滴加5%BSA封闭液，37 ℃封闭30 min；弃去封闭液，滴加含有大鼠抗rDpp1血清(1:100稀释)的封闭液，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次；滴加Cy3标记的山羊抗大鼠IgG(1:1 000稀释)，避光条件37 ℃孵育1 h，PBS洗3次；滴加DAPI染色液，避光室温孵育5 min，PBS洗3次；最后滴加抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片，激光共聚焦显微镜观察重组蛋白与大鼠PBMCs的结合情况[13]。
1.3.3 重组蛋白对大鼠PBMCs增殖的影响 在96孔细胞培养板中加入100 μL PBMCs悬液，各孔加入不同质量浓度(10、20、40 μg·mL-1)rDpp1，同时设pET-32a载体蛋白对照组和空白对照组，37 ℃，5% CO2培养箱培养48 h。每孔加入10 μL CCK-8，避光孵育4 h。另设置只加了CCK-8的培养基作为调零组。酶标仪测定OD450 nm的吸光度，按照公式“细胞增殖指数=(试验组OD450 nm-调零组OD450 nm)/(对照组OD450 nm-调零组OD450 nm)”计算增殖指数[14]。
1.3.4 重组蛋白对大鼠PBMCs迁移的影响 在24孔细胞培养板中每孔加入1 mL PBMCs悬液，各孔加入不同质量浓度(10、20、40 μg·mL-1)rDpp1，同时设pET-32a载体蛋白对照组和空白对照组，37 ℃，5%CO2培养箱培养24 h，计数细胞；将细胞小室放入空的培养板，小室下加入500 μL 10%灭活FBS、1%双抗的RPMI 1640培养液，小室内加入200 μL已知数量的细胞，37 ℃ 5%CO2培养箱培养2 h，收集迁移至小室下的细胞并计数，计算细胞迁移率[15]。
1.3.5 重组蛋白对大鼠PBMCs分泌一氧化氮的影响 取PBMCs悬液离心，用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基重悬，调整浓度至1×106·mL-1，在24孔细胞培养板中每孔加入1 mL PBMCs悬液，各孔加入不同质量浓度(10、20、40 μg·mL-1)rDpp1，同时，设pET-32a载体蛋白对照组和空白对照组，37 ℃ 5%CO2培养箱培养24 h，离心收集细胞上清，按照总一氧化氮检测试剂盒说明书进行测定[16]。
1.3.6 重组蛋白对大鼠PBMCs吞噬功能的影响 在24孔细胞培养板中每孔加入1 mL PBMCs悬液，各孔加入不同质量浓度(10、20、40 μg·mL-1)r Dpp1，同时设pET-32a载体蛋白对照组和空白对照组，37 ℃ 5%CO2培养箱培养48 h后收取细胞。用4 ℃预冷的PBS洗涤一次，用100 μL PBS重悬PBMCs细胞，加入100 μL 1 mg·mL-1 FITC-dextran，分别放入4和37 ℃培养箱避光静置1 h。4 ℃预冷的PBS缓冲液(含2%灭活FBS)洗涤细胞，用500 μL体积的PBS稀释细胞，流式细胞仪检测细胞平均荧光强度(MFI)，按照公式“细胞吞噬指数(PI)=MFI试验组/MFI细胞对照组”计算吞噬指数[17]。
1.3.7 重组蛋白对大鼠PBMCs凋亡功能的影响 在24孔细胞培养板中，每孔加入1 mL PBMCs悬液，各孔加入不同质量浓度(10、20、40 μg·mL-1)rDpp1，同时，设pET-32a载体蛋白对照组和空白对照组，37 ℃ 5%CO2培养箱培养24 h后，收取细胞，用PBS洗涤两次，取100 μL结合缓冲液重悬细胞，再加入10 μL的Annexin V-FITC，避光孵育15 min，PBS洗涤两遍，取500 μL结合缓冲液重悬细胞，加入碘化丙啶，转入流式管，使用流式细胞仪检测细胞凋亡[18]。
1.4 数据分析利用GraphPad Prism 6软件对数据进行分析，组间数据的比较是采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，数据表示为“ x±s”。
2 结果 2.1 旋毛虫Dpp1基因的克隆与表达Dpp1基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，在1 380 bp左右有一条带(图 1A)，与目的条带大小相符。
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A.Dpp1基因的扩增(M.DNA相对分子质量标准DL2000；1.PCR扩增产物)；B.pET-32a(+)-Dpp1的酶切鉴定(M.DNA相对分子质量标准DL5000；1.重组质粒经Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切)；C.rDpp1的表达(M.蛋白质相对分子质量标准；1.诱导表达5 h细菌裂解产物；2.表达产物上清；3.表达产物包涵体)；D.rDpp1的纯化(M.蛋白质相对分子质量标准；1.纯化前的包涵体蛋白；2.纯化后的包涵体蛋白) A.PCR result of Dpp1 (M.DNA marker DL2000;1.Products of PCR); B.Identification of pET-32a(+)-Dpp1 by enzyme digestion (M.DNA marker DL5000;1.Recombinant plasmid digested by Hind Ⅲ and Xho Ⅰ); C.Expression of rDpp1(M.Protein molecular weight marker; 1.Bacterial lysate induced by IPTG; 2.Supernatant of expression products; 3.Inclusion body of expression products); D.Purification of rDpp1(M.Protein marker; 1.Inclusion body before purification; 2.Purified protein) 图 1 旋毛虫Dpp1基因原核表达载体构建及蛋白表达 Fig. 1 Construction of Dpp1 gene expression vector and protein expression |
软件分析发现Dpp1基因的ORF为1 380 bp，编码459个氨基酸，理论等电点为6.73，理论相对分子质量52.76 ku，无信号肽，无跨膜区，有1个肽酶(peptidase_C1A)的结构功能域。
表达载体pET-32a(+)-Dpp1质粒经Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，分别有1条5 900 bp左右的载体片段和1条大小约为1 400 bp的目的片段，与预期相符(图 1B)。将pET-32a(+)-Dpp1质粒转入大肠杆菌进行诱导表达，重组蛋白主要以包涵体的形式存在，获得的重组蛋白相对分子质量约为72 ku(图 1C)。经His蛋白纯化柱纯化，得到较纯的蛋白(图 1D)。
2.2 Western blot分析取重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜上，以感染旋毛虫的小鼠血清为一抗，健康小鼠血清为对照。感染血清组在72 ku附近有一条带，而对照组无条带(图 2)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.rDpp1与感染小鼠血清的Western blot分析；2.阴性对照 M.Protein marker; 1.rDpp1 recognized by serum from infected mouse; 2.Negative control 图 2 重组蛋白的Western blot分析 Fig. 2 Western blot analysis of rDpp1 |
如图 3所示，rDpp1孵育的细胞发出红色荧光，细胞核发出蓝色荧光，而pET-32a蛋白组、阴性血清组以及未处理孵育抗血清组只发出蓝色荧光, 未观察到红色荧光(图 3未彩印，染色效果见OSID服务)。
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A. rDpp1预处理的PBMC孵育rat anti-rDpp1 IgG试验组；B. rDpp1预处理的PBMC孵育negative rat IgG(对照)试验组；C. pET-32a空载体蛋白预处理的PBMC孵育rat anti-rDpp1 IgG试验组；D.未处理的PBMC孵育rat anti-rDpp1 IgG对照组 A. rDpp1 pretreated PBMCs incubated rat anti-rDpp1 IgG group; B. rDpp1 pretreated PBMCs incubated negative rat IgG group; C. pET-32a empty vector protein pretreated PBMCs incubated rat anti-rDpp1 IgG group; D. Untreated PBMCs were incubated with the rat anti-rDpp1 IgG control group 图 3 rDpp1与大鼠PBMCs的结合(400×) Fig. 3 Binding of rDpp1 to rat PBMCs(400×) |
如图 4所示，rDpp1刺激大鼠PBMCs后，与空白细胞对照组比较，40 μg·mL-1时对PBMCs增殖表现极显著的促进(P < 0.001)。
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与空白细胞对照组(Control)比较, ns表示差异不显著；*表示差异显著(P < 0.05)；* *表示差异显著(P < 0.01)；* * *表示差异极显著(P < 0.001)。下图同 Compare with the control group, ns means no significant difference; * means significant difference(P < 0.05);* * means significant difference(P < 0.01);* * * means highly significant difference. The same as below 图 4 rDpp1对大鼠PBMCs增殖的影响 Fig. 4 Effect of rDpp1 on rat PBMCs proliferation |
如图 5所示，rDpp1刺激大鼠PBMCs后，与空白细胞对照组比较，各质量浓度蛋白都对PBMCs的迁移表现显著的促进作用，10 μg·mL-1时能显著促进细胞迁移(P < 0.05)，20及40 μg·mL-1时表现极显著的促进作用(P < 0.01)。
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图 5 rDpp1对大鼠PBMCs迁移的影响 Fig. 5 Effect of rDpp1 on rat PBMCs migration |
如图 6所示，rDpp1刺激大鼠PBMCs后，与空白细胞对照组比较，20与40 μg·mL-1质量浓度的重组蛋白极显著促进NO的释放(P < 0.001)。
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图 6 rDpp1对大鼠PBMCs分泌NO的影响 Fig. 6 Effect of rDpp1 on NO production of rat PBMCs |
如图 7所示，rDpp1刺激大鼠PBMCs后，与空白细胞对照组比较，各质量浓度蛋白都对PBMCs的吞噬功能表现显著的促进作用，20与40 μg·mL-1时表现为极显著的促进作用(P < 0.01，P < 0.001)。
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图 7 rDpp1对大鼠PBMCs吞噬功能的影响 Fig. 7 Effect of rDpp1 on the phagocytosis of rat PBMCs |
图 8A为流式细胞术结果。各组细胞凋亡的比例(包括早期凋亡的Q3区和晚期凋亡的Q2区)统计结果如图 8B所示。空细胞对照组和pET-32a空载体诱导表达蛋白组之间无显著差异(P>0.05)。与空白细胞对照组比较，各质量浓度蛋白都对PBMCs的凋亡表现极显著的促进作用(P < 0.001)。
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图 8 rDpp1对大鼠PBMCs凋亡功能的影响 Fig. 8 Effect of rDpp1 on rat PBMCs apoptosis |
旋毛虫病主要采用药物(如甲苯咪唑和阿苯达唑)进行防治。但是，这对于完全清除体内病原体的效果不理想[19]。目前，仍未有针对旋毛虫的可靠且广泛适用的疫苗[20-21]。因此，有必要找到具有免疫保护作用的特异性抗原，并开发出高效的疫苗。探索蛋白质在旋毛虫入侵以及感染过程中的作用，对于筛选旋毛虫疫苗的候选分子至关重要[22]。
本试验选取旋毛虫Dpp1基因进行克隆表达，序列分析发现其存在有1个肽酶(peptidase_C1A)的结构功能域，属于木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶家族的溶酶体蛋白酶，也称为半胱氨酸组织蛋白酶C。表达Dpp1重组蛋白，经Western blot分析表明rDpp1具有良好的免疫原性，间接免疫荧光试验又证明其能与大鼠PBMCs结合，说明rDpp1具有对免疫细胞功能进行调节的潜力[13]。
为了解Dpp1重组蛋白对免疫细胞功能的影响，本试验选择了外周血单个核细胞，其包括了淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞，是免疫系统的重要组成部分[23]。通过测定细胞增殖、迁移、吞噬、凋亡以及NO分泌等免疫指标，从而明确Dpp1重组蛋白与宿主免疫细胞的作用关系。
细胞增殖和迁移是与免疫反应密切相关的重要过程，是细胞有效参与宿主防御和抵抗病原体入侵的重要体现[24]，由免疫细胞大量增殖引起的细胞免疫利于抗寄生虫[25-26]。本研究结果表明，高浓度的rDpp1能显著提高PBMCs的增殖和迁移，有利于机体清除病原。NO是由参与免疫反应的细胞所释放的一种普遍存在的信号分子，参与针对多种寄生虫的非特异性免疫防御，在保护机体免受寄生虫感染过程中发挥重要作用[27]。它可以限制病原体生长，例如对旋毛虫的抗性[28]。结果表明，Dpp1重组蛋白可促进NO分泌，且随着蛋白浓度上升作用加强，增强了机体防御能力。
单核细胞或巨噬细胞被活化后，吞噬能力增强，能清除体内病原体和损伤的细胞[29]。结果表明，Dpp1重组蛋白能显著增强PBMCs的吞噬功能，加强机体的防御能力。Dpp1重组蛋白能通过加强免疫细胞的增殖，促进免疫细胞向寄生虫所在部位的迁移，提升免疫细胞的吞噬以及NO分泌能力，通过多种机制调节宿主免疫细胞发挥作用，有利于机体排除或杀死旋毛虫。
细胞凋亡是一种自然发生的现象，对促进清除衰老损伤细胞、生物体进化、机体内环境稳态的维持等有着重要作用[30]。旋毛虫或其排泄分泌蛋白可以促进多种细胞的凋亡，如淋巴细胞[31]、肝癌细胞[32]、小肠细胞[33]等，这有利于寄生虫的寄生。本研究结果表明，Dpp1各浓度重组蛋白都能极显著促进PBMCs的凋亡。但入侵时旋毛虫体内的Dpp1蛋白浓度能否达到体外试验的浓度并不明确，而虫体内微量浓度的Dpp1蛋白能否引起宿主免疫细胞的凋亡有待探究，而且诱导细胞凋亡的机制和信号传导途径尚需进一步研究。
综合以上结果，rDpp1与大鼠PBMCs发生作用主要是刺激细胞活化、增殖、分化发挥免疫作用，清除外来抗原，表明rDpp1具有很强的抗原性，对促进免疫细胞功能具有重要作用。该蛋白在防治旋毛虫方面具有作为疫苗候选抗原的潜力，值得进一步研究，后续会通过体内试验进一步研究对机体免疫保护机制的影响。
4 结论体外试验发现旋毛虫二肽基肽酶1重组蛋白能够刺激宿主PBMCs的增殖、迁移，促进NO分泌以及吞噬功能，诱导PBMC细胞凋亡，表明该蛋白可通过多种途径调节宿主的外周血单个核细胞免疫反应。
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