2. 南华大学公共卫生学院, 衡阳 421001
, TANG Ting2, ZHANG Xu2, PAN Yiliang2, GUO Zhuang2, QUAN Shufen2, CHEN Lili2
2. School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, China
鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci, Cps)是一类专性细胞内寄生的，革兰染色为阴性的人畜共患病病原体[1-3]。Cps感染动物后，能引起肺炎、结膜炎等一系列病变，并可造成母畜流产和幼仔存活率降低[4]；Cps通过被感染动物的粪便及上呼吸道分泌物感染人类，引起心包炎、气囊炎、肺炎、腹膜炎、肝炎等重症疾病，还成为人眼淋巴瘤的高风险因素之一[5-8]。
Cps与其他衣原体一样具有独特的发育周期，最初具有感染性的原体(elementary body, EB)黏附于易感细胞的表面，经宿主细胞的吞饮作用进入细胞内，形成包涵体(inclusion)；随后在包涵体中，EB发育为始体(或称网状体，reticulate body, RB)，以二分裂方式增殖[9-10]。
在整个感染周期中，衣原体形成了一系列适应性机制帮助其成功逃避宿主的免疫清除[11]。其中，衣原体和宿主之间的相互作用是其生存和致病的重要基础[12]。衣原体可通过分泌蛋白质、多糖等物质影响宿主细胞正常新陈代谢及功能[13-14]。Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system, T3SS)是革兰阴性菌一个进化精细的毒力决定簇，由多组分蛋白复合体组成的复杂的跨膜通道，是目前已知最为复杂的分泌系统，存在于许多革兰阴性致病菌，如耶尔森菌属(Yersinia spp.)、沙门菌属(Salmonella spp.)、福氏志贺菌(Shigella flexneri spp.)[15-17]。衣原体可通过T3SS将特异性的效应蛋白直接递送到宿主细胞质、包涵体膜或包涵体腔隙，促进衣原体的黏附和增殖，引起细胞骨架重组，摄取营养维持生存，引起宿主免疫反应紊乱，或促进衣原体的释放[8, 18-19]。因此，筛选和鉴定Cps T3SS效应蛋白以及进一步探索其功能，对合理设计Cps防治的疫苗与药物有着重要的学术价值。
1 材料与方法 1.1 实验动物、菌株与质粒4~6周龄雌性SPF级BALB/c小鼠购自湖南斯莱克景达公司。Cps 6BC标准株、pGEX-6P-1质粒、E. coli BL21菌株均为南华大学病原生物学研究所保存。
1.2 主要试剂PCR产物纯化回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒和DNA提取试剂盒均购自美国OMEGA公司；高保真DNA聚合酶购自日本TOYOBO公司；GST·Bind纯化树脂购自德国默克Novagen公司。
鼠抗GST单克隆抗体购自美国Sigma公司；HRP-羊抗小鼠IgG抗体，Cy2-羊抗兔IgG抗体，Cy3-羊抗鼠IgG抗体购自美国Jackson ImmunoResearch公司；兔抗Cps全菌抗体由课题组自制并保存。
1.3 Cps T3SS效应蛋白编码基因的预测利用生物信息学软件Effective T3(http://www.effectors.org/)和BPBAac tool(http://biocomputer.bio.cuhk.edu.hk/softwares/BPBAac)，结合文献报道的已知T3SS效应蛋白的结构特征，预测Cps T3SS效应蛋白[20-21]。
1.4 pGEX-6P-1/目的基因原核表达载体的构建及鉴定根据14个目的基因的碱基序列，对照pGEX-6p-1载体上的多克隆酶切位点，设计特异性扩增引物。分别在上游引物(P#1)中引入BamHⅠ酶切位点核苷酸G▼GATCC或EcoRⅠ酶切位点核苷酸G▼AATTC，在下游引物(P#2)中引入NotⅠ酶切位点核苷酸GC▼GGCCGC，同时加上相应保护性碱基。引物由上海Invitrogen公司合成，具体序列见表 1。
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表 1 14个Cps基因的PCR扩增引物 Table 1 PCR amplification primers of 14 Cps genes |
用天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒按照说明书操作从Cps 6BC中提取基因组DNA。经PCR扩增目的基因，连接至pGEX-6p-1空质粒，转化至E. coli BL21感受态细胞中，用含Ampicillin的LB固态培养基培养过夜，筛选阳性克隆并PCR、双酶切鉴定，并将重组质粒送上海Invitrogen公司测序。
1.5 融合蛋白在E.coli中的诱导表达与鉴定取重组质粒pGEX-6p-1/目的基因 E.coli BL21转化菌10 μL，接种到Ampicillin的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。挑取单个阳性菌落于2 mL含Ampicillin的LB液体培养基中，37 ℃水浴振摇培养14 h，同时，设空菌组和空质粒组对照组；次日以(1:50)~(1:100)的比例转种于4 mL含Ampicillin LB液体培养基，OD值为0.6左右时，加入IPTG诱导表达4 h，收集菌体沉淀，超声裂菌，SDS-PAGE分析。检测到有蛋白表达后，按照上述条件进行大规模诱导表达，收集菌体沉淀，超声裂菌，10 000 r·min-1离心20 min，分别收集上清，用MERCK GST·Bind树脂进行纯化。用BCA Protein Assay Kit测定重组蛋白浓度，经去内毒素处理后，分装，保存于-80 ℃冰箱备用。
1.6 Western blot鉴定目的蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，转移至NC膜，室温下TBST洗膜1次，在含5%脱脂牛奶的TBST 4 ℃封闭过夜。以鼠抗GST单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行孵育，用ECL发光试剂显色，X线胶片曝光显影。
1.7 重组蛋白多克隆抗体的制备将100 μg重组蛋白与等体积完全弗氏佐剂(CFA)完全乳化后，皮下接种3~4周龄雌性BALB/c小鼠，每种蛋白免疫3只小鼠。初次免疫后的第21天，用100 μg重组蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂皮下加强免疫3次，每次间隔一周，末次免疫后3 d摘除眼球取血，分离血清。分离的血清与相应空载体转化菌的诱导表达产物等体积混合完全后，孵育过夜吸附，以中和抗GST的抗体，14 000 r·min-1离心20 min，取上清作为吸附纯化的多克隆抗体，加入等体积甘油混匀后，－20 ℃保存备用。
1.8 多克隆抗体效价测定用0.05 mol·L-1 pH9.6碳酸盐缓冲液将重组蛋白稀释至8.0 mg·L-1，包被96孔板，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜，同时设空白对照。用5%脱脂奶粉封闭后，加入倍比稀释的待测小鼠免疫血清，37 ℃温育1 h，充分洗涤，加入HRP-羊抗小鼠IgG，37 ℃温育30 min，洗板5次，加入50 μL四甲基联苯胺(TMB)显色底物，室温避光反应15 min，酶标仪读取405 nm波长的OD值，结果以待测标本OD450 nm值/正常血清对照OD450 nm值≥2:1为阳性，以阳性反应的最高滴度作为血清的效价。
1.9 间接免疫荧光分析假定的效应蛋白在感染细胞的定位在24孔板内置入直径13 mm的圆盖玻片，每孔加入1 mL 4×105·mL-1的HeLa细胞。细胞长至密度约80%时，去培养液，PBS洗2次。以MOI=2感染Cps 6BC，48 h后进行间接免疫荧光试验分析各目的蛋白在细胞内的定位。取出24孔板，去上清培养基，PBS冲洗2次。4%多聚甲醛室温固定30 min后，0.1%Triton作用10 min，用含10%小牛血清的DMEM封闭1 h。分别加入小鼠抗相应蛋白的抗血清和兔抗Cps抗血清，4 ℃孵育过夜或37 ℃孵育2 h。充分洗涤后，加入Cy2-羊抗兔IgG和Cy3-羊抗鼠IgG，并加入DAPI，37 ℃避光孵育1 h。充分洗涤后，取出载玻片，滴加荧光淬灭剂，封片，荧光显微镜下镜观察，照相。
2 结果 2.1 Cps T3SS假定的效应蛋白的筛选2011年，Cps 6BC基因组序列公布，其染色体含有975蛋白编码基因，将其输入Effective T3和BPBAac软件包中进行筛选，然后将两个软件预测为阳性的蛋白编码基因纳入本研究范围，将基因长度过长的基因排除，选取了9个假定的Cps T3SS效应蛋白编码基因。同时，在已经发表的文献中搜索含SET结构域或DUF582的蛋白。共筛选了14个可能的Cps T3SS假定的效应蛋白编码基因：CPSIT_0357、CPSIT_0429、CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT _0844、CPSIT_0846、CPSIT_0019、CPSIT_0020、CPSIT_0968、CPSIT_0969、CPSIT_0942。
2.2 目的基因的PCR扩增以Cps 6BC基因组DNA为模板，PCR扩增14个目的基因，1.5%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在相应位置可见清晰的特异性条带，与预期片段大小相符(图 1)。
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M. DNA相对分子质量标准(DNA molecular weight standard)；1. CPSIT_0357；2. CPSIT _0429；3. CPSIT _0461；4. CPSIT_0463；5. CPSIT_0490；6. CPSIT_0594；7. CPSIT_0785；8. CPSIT_0844；9. CPSIT_0846；10. CPSIT_0019；11. CPSIT_0020；12. CPSIT_0942；13. CPSIT_0968；14. CPSIT_0969 图 1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 Fig. 1 Electrophoretic analysis of PCR products in 1.5% agarose gel |
利用分子克隆技术，构建了14个靶基因的原核重组质粒，测序，BLAST软件对测序结果与GenBank上登录的编码序列进行比对，结果分析14个重组质粒测序结果与GenBank上登录的Cps 6BC基因完全一致，无一碱基突变，且密码子读码框架正确。
2.4 重组蛋白的诱导表达与纯化重组质粒转化至E. coli BL 21表达宿主菌，IPTG诱导表达。除CPSIT_0357、CPSIT_0429、CPSIT_0968、CPSIT_0969外，其余10种重组菌分别表达了相对分子质量(Mr)与预测相对分子质量相近的可溶性蛋白，经GST树脂纯化柱纯化，得到纯化的融合蛋白(图 2)。
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M.蛋白质相对分子质量标准(protein molecular weight standard)；1.CPSIT_0461；2.CPSIT_0463；3.CPSIT_0490；4.CPSIT_0594；5.CPSIT_0785；6.CPSIT_0844；7.CPSIT_0846；8.CPSIT_0019；9.CPSIT_0020；10. CPSIT_0942 图 2 重组蛋白纯化的SDS-PAGE结果 Fig. 2 Purified recombinant proteins after SDS-PAGE analysis |
以鼠抗GST单克隆抗体为一抗，Western blot检测诱导表达的重组融合蛋白，结果出现了明显的特异性反应条带，而未诱导的菌体无特异性条带出现(图 3)。
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1.CPSIT_0461；2.CPSIT_0463；3.CPSIT_0490；4.CPSIT_0594；5.CPSIT_0785；6.CPSIT_0844；7.CPSIT_0846；8.CPSIT_0019；9.CPSIT_0020；10.CPSIT_0942 图 3 GST-重组蛋白的免疫印迹鉴定 Fig. 3 Western blot analysis of the GST-recombinant protein |
用重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠，ELISA测定小鼠血清中特异性抗体效价，结果显示，各融合蛋白均刺激小鼠产生较高滴度的特异性抗体，CPSIT_0785、CPSIT_0844、CPSIT_0846、CPSIT_0019、CPSIT_0020免疫小鼠血清抗体滴度为1:64 000。CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594和CPSIT_0942免疫小鼠血清抗体滴度为1:32 000。
2.7 靶蛋白在细胞内的定位分析以自制的抗Cps全菌抗体和各融合蛋白多克隆抗体为一抗，Cy2-羊抗兔IgG和Cy3-羊抗鼠IgG为二抗，进行间接免疫荧光染色。荧光显微镜下可见，CPSIT_0844、CPSIT_0846与Inc A均位于包涵体膜，而CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT_0019、CPSIT_0020、CPSIT_0942与MOMP类似，位于整个包涵体上(图 4)。
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IncA作为包涵体膜蛋白对照；MOMP作为包涵体蛋白对照IncA is shown as the inclusion membrane protein control, MOMP is shown as the inclusion body protein control 图 4 假定的效应蛋白刺激细胞48 h后在细胞内的定位情况(100×) Fig. 4 Localization of the putative effector proteins within 48 h after stimulation of the cells (100×) |
Cps作为专性细胞内寄生的革兰阴性病原体，不仅可引起禽类、哺乳动物的呼吸道感染，亦可通过密切接触而感染人类，对人类健康和经济发展产生重要影响[22-24]。衣原体和宿主之间的相互作用是其生存和致病的重要机制。衣原体可通过T3SS分泌蛋白质等物质到宿主细胞质、包涵体膜或包涵体腔隙，影响宿主细胞正常新陈代谢及功能[25-27]。因此，筛选、鉴定介导衣原体和宿主细胞交互作用的效应蛋白，对进一步阐明衣原体的致病机制，寻求有效的防治措施具有重要的意义。
尽管各种细菌的T3SS效应蛋白具有相似的结构特点，但由于其结构的高度保守，几乎无同源性[27-29]。因此，T3SS效应蛋白编码基因的预测非常困难。尽管如此，效应蛋白仍然含有一些固定的结构特征，通过对已知效应蛋白集合的研究发现，可应用计算机方法研究已知效应蛋白的序列相似性、模式一致性、相邻基因的结构特点，如G+C含量、N末端氨基酸的富集和贫乏、二级结构的组成等进行预测，目前，也已开发出一些计算机软件应用于多种细菌T3SS效应蛋白的预测[21, 30-32]。其中Effective T3是最早用于预测的计算机方法之一[21]，它是运用ANN模型，基于序列特征建立起来的方法，并通过对其N端30个氨基酸信号的研究而发展起来，该方法选择性高(98%)，但灵敏度低(74%)，主要用于初步筛选。随后发展的BPBAac tool以SVM为模型，是一种研究其特异性氨基酸位点并通过优化参数而建立起来的计算机方法，其灵敏度(97.42%)和选择性(90.97%)均高[32]。然而，计算机方法都有其局限性，因此，笔者联合两种方法进行初步筛选和预测Cps染色体基因组，选取两种方法筛选为阳性的蛋白编码基因纳入本试验，共选取14个蛋白进行分析。
尽管计算机方法用于筛选效应蛋白是一种有效而实用的方法，但是由于存在假阳性和假阴性，所以需要通过试验加以确证，最常用的方法为间接免疫荧光显微镜下细胞内的定位分析。因此，在进行试验之前需要通过基因工程技术获得重组蛋白，并制备相应抗体。
本试验综合考虑蛋白产量高、蛋白可溶性和蛋白纯化方便等多种因素，选用pGEX-6P-1蛋白表达载体。pGEX-6P-1带有tac启动子，可在化学剂的诱导下进行强表达；GST编码序列可提高蛋白的可溶性；其缓冲液温和，有利于保持蛋白天然构象。随后用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，制备得到高滴度的多克隆抗体。
应用相应融合蛋白的抗体进行细胞内定位分析，以已知的包涵体膜蛋白IncA和包涵体蛋白MOMP为对照进行间接免疫荧光试验，发现CPSIT_0844和CPSIT_0846与IncA定位一致，位于包涵体膜上，且经生物信息学分析，CPSIT_0844和CPSIT_0846在N末端都含有疏水性区域，符合大部分Inc蛋白结构的特点；而CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT_0019、CPSIT_0020、CPSIT_0942与MOMP定位一致，位于包涵体内。
本试验结合Effective T3、BPBAac tool生物信息学软件预测和间接免疫荧光定位分析技术，发现了2种衣原体包涵体膜蛋白和8种包涵体蛋白，后续将进一步验证其是否通过Ⅲ型分泌系统分泌及其结构与功能。
4 结论在预测分析的10种鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci, Cps)Ⅲ型分泌系统效应蛋白中，鉴定了2种定位于衣原体包涵体膜的效应蛋白和8种定位于衣原体包涵体中的效应蛋白。
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