2. 杭州康德权饲料有限公司 包膜饲料添加剂省级重点农业企业研究院, 杭州 311107
2. Provincial Key Agricultural Enterprise Research Institute of Encapsulated Feed Additive, King Techina Technology Co., Ltd., Hangzhou 311107, China
单宁酸为多酚类化合物，分为缩合单宁酸和水解单宁酸，两者均可与蛋白质结合形成难分解的复合物，从而降低消化液中消化酶对饲粮养分的消化，因此，定义为抗营养因子[1-2]。然而，近期研究表明，单宁酸具有收敛、抑菌、抗病毒、抗氧化等作用而促进单胃动物的生长和维护肠道健康[3-6]，被作为功能性饲料添加剂使用。因此，在单宁酸的应用上，准确地评价单宁酸影响消化酶的活性及影响饲粮养分消化的程度对消除单宁酸的负面效应有重要的参考意义。Pan等[7]的数据表明，生长猪对高粱的消化能与单宁酸的含量呈显著的负相关关系，因此，采用单宁酸的含量来动态地估测生长猪对高粱的消化能值。体外模拟消化结果表明，单宁酸对淀粉酶、胰蛋白酶活性均具有显著的抑制作用[8-9]。本实验室前期采用猪仿生消化法对一系列单宁酸含量的高粱进行消化，高单宁含量的高粱上样量为1 g和2 g时，前者的干物质、能量消化率远远高于后者，这可能与仿生消化中单宁酸降低了消化酶的活性有关。然而，孙展英等[10]研究表明，乳仔猪饲料中添0.10%单宁酸能够显著提高乳仔猪生长性能、粗蛋白和粗脂肪的消化率以及胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。Mariscal-Landín等[11]研究表明，饲粮中添加单宁酸的浓度为1.0%时能够提高生长猪十二指肠内胰蛋白酶的活性。上述结论显示，单宁酸对猪的消化有抑制和促进的双重作用。这一矛盾的结论是否因不同的研究者所使用单宁酸的来源不同而表现出不同的生理功能？或是单宁酸对消化酶活性的影响因有无饲粮存在而结果有差异？为此，本试验以2种单宁酸为研究对象，探讨在有、无饲粮时体外模拟生长猪胃—小肠消化过程中单宁酸对消化酶活性及饲粮养分消化率的影响，为消除单宁酸对猪消化过程的负面效应提供参考。
1 材料与方法 1.1 单宁酸及试验饲粮单宁酸1，含量80.0%，生产地湖北；单宁酸2，含量73.9%，生产地意大利。生长猪仿生消化所用饲粮根据NRC(2012)推荐的营养需要量，以玉米、豆粕为主要原料配制。用万能粉碎机粉碎后过60目方形筛孔，密封于样品袋后于-20 ℃保存待用，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 玉米-豆粕型饲粮的组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and chemical composition of corn-soybean meal diet (air-dry basis) |
本试验由2部分组成。试验一考察无饲粮下2种单宁酸对猪模拟胃液、模拟小肠液中消化酶活性的影响。采用单因素完全随机设计，其中处理1为对照组，不添加单宁酸；处理2为单宁酸1添加量10 mg(胃液体积为20 mL，小肠液体积为22 mL)；处理3为单宁酸1添加量20 mg；处理4为单宁酸2添加量10 mg；处理5为单宁酸2添加量20 mg。测定各处理的胃蛋白酶、淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。每个处理3个重复。试验二考察玉米-豆粕型饲粮(表 1)添加单宁酸对仿生消化中胃、小肠阶段消化酶活性及养分消化率的影响。采用单因素完全随机设计，其中处理1为对照组，不添加单宁酸；处理2为单宁酸1添加量10 mg·(2 g)-1饲粮；处理3为单宁酸1添加量20 mg·(2 g)-1饲粮；处理4为单宁酸2添加量10 mg·(2 g)-1饲粮；处理5为单宁酸2添加量20 mg·(2 g)-1饲粮。测定仿生消化胃阶段0.5和4 h时胃蛋白酶活性，小肠阶段0.5、4和8 h时淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。每个处理5个重复，每个重复1根消化管。同时采用程控单胃动物仿生消化系统模拟生长猪胃—小肠消化测定各处理的干物质和粗蛋白消化率。每个处理5个重复，每个重复1根消化管。
1.3 仿生消化及消化酶活性的测定生长猪胃—小肠仿生消化过程具体参照《单胃动物仿生消化系统操作手册》[14]和王亚[15]的方法进行，其中胃阶段消化时长为4 h，小肠阶段消化时长为8 h，最终清洗时间为12 h(每次清洗2 h，共6次)。
在试验一单宁酸对胃模拟消化阶段的胃蛋白酶活性影响中，先将单宁酸溶于647.5 U·mL-1的胃蛋白酶溶液(pH=2.0)中，使其浓度分别为0 mg·(20 mL)-1(对照组)，10 mg·(20 mL)-1或20 mg·(20 mL)-1。然后，测定胃蛋白酶活性。在单宁酸对小肠模拟消化阶段的消化酶活性影响中，先将单宁酸溶于20 mL超纯水中，再加入2 mL浓缩模拟小肠液，使单宁酸的浓度分别为0 mg·(22 mL)-1 (对照组)，10 mg·(22 mL)-1或20 mg·(22 mL)-1，然后测定淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。其中浓缩模拟小肠液中淀粉酶活性2 436 U·mL-1，胰蛋白酶活性760 U·mL-1，糜蛋白酶活性95 U·mL-1，其配制参照王亚[15]的描述进行，猪小肠液纯化酶粉剂的制备参考党方昆[16]描述的方法进行。
在试验二单宁酸对猪饲粮仿生消化中消化酶活性及养分消化率的影响中，称取添加单宁酸的饲粮2 g，按王亚等[17]的方法进行胃、小肠的模拟消化。其中模拟胃液中胃蛋白酶活性为890 U·mL-1，浓缩小肠液的配制同试验一。在胃消化0.5和4 h取透析袋内的样品，在小肠消化的0.5、4和8 h取透析袋内的样品，以3 000 r·min-1转速离心10 min，取上清液待测。
胃蛋白酶活性(U·mL-1)的测定参考Anson[18]的方法进行。测定原理：牛血红蛋白为底物生成可溶于三氯乙酸溶液的氨基酸含量在280 nm处的吸光度变化与胃蛋白酶活性具有一定相关性。淀粉酶活性(U·mL-1)的测定参考Dahlqvist[19]的方法进行。测定原理为：可溶性淀粉经淀粉酶作用后的还原物质与3，5-二硝基水杨酸可形成有颜色的络合物，在530 nm下，络合物颜色的深浅与还原物质的量呈线性关系。胰蛋白酶活性(U·mL-1)的测定参考Wirnt[20]的方法进行。测定原理为：对-甲苯磺酸-L-精氨酸乙酯经胰蛋白酶水解成的对-甲苯磺酸-L-精氨酸在247 nm下吸光度的变化速度。糜蛋白酶活性(U·mL-1)的测定参考Wirnt[21]的方法进行。测定原理为：苯甲酰-L-酪氨酸乙酯经糜蛋白酶水解成苯甲酰-L-酪氨酸在256 nm下吸光度的变化速度。
1.4 数据处理与统计方法采用SAS 9.2的MEANS模块计算基本统计量。以GLM模块对试验一、二中各处理的胃蛋白酶、淀粉酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶活性，玉米-豆粕型饲粮干物质、粗蛋白消化率的差异进行方差分析，并以Duncan’s法对各处理均值进行多重比较。用Contrast语句比较空白对照组与4个单宁酸组的差异显著性以及单宁酸1与单宁酸2在两个处理水平上综合效应的差异显著性。以P < 0.05定义为差异显著。
饲粮养分表观消化率计算公式：
粗蛋白表观消化率(DCP，%)=[(N1－N2)/N1]×100；
干物质表观消化率(DDM，%)=[(M1－M2)/M1]×100。
式中: N1为饲料样品粗蛋白重量(g)；N2为残渣中粗蛋白重量(g)；M1为饲料样品干物质重量(g)；M2为残渣干物质重量(g)。
2 结果 2.1 单宁酸对生长模拟猪胃—小肠消化阶段消化酶活性的影响在无饲粮条件下(表 2)，模拟胃液中加入2种来源及2个浓度的单宁酸后胃蛋白酶活性无显著差异(P>0.05)，但数值上均比空白对照组略低。在模拟小肠液中，随着单宁酸1添加水平的增加，淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性依次呈显著性降低(P < 0.05)。随着单宁酸2添加水平的增加，淀粉酶和糜蛋白酶活性依次呈显著性降低(P < 0.05)，而胰蛋白酶活性无显著差异(P>0.05)，但均显著地低于空白对照组(P < 0.05)。从2种单宁酸对生长猪模拟小肠液消化酶活性的影响来看，单宁酸1对淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的降低程度均显著高于单宁酸2。
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表 2 单宁酸对体外模拟胃、小肠阶段消化酶初始活性的影响 Table 2 Effect of tannic acid on initial digestive enzyme activities in in vitro simulated gastric and small intestine digestion |
在模拟生长猪胃—小肠对饲粮的仿生消化中(表 3)，胃阶段消化0.5 h时，胃蛋白酶活性均随2种单宁酸添加量的增加而降低，但单宁酸1组均显著高于对照组(P < 0.05)；单宁酸2在10 mg·(2 g)-1添加水平下与对照组无显著性差异(P>0.05)，而添加20 mg·(2 g)-1水平下显著低于对照组(P < 0.05)。胃阶段消化4 h时，胃蛋白酶活性均随2种单宁酸添加量的增加而降低(P < 0.05)，且2种单宁酸在10 mg·(2 g)-1添加水平下均与对照组无显著性差异(P>0.05)。在20 mg·(2 g)-1添加水平下均显著低于对照组(P < 0.05)。总体上，随着2种单宁含量的增加胃蛋白酶活性均降低，添加单宁酸1的胃蛋白酶活性显著高于添加单宁酸2的相应值(P < 0.05)。在猪仿生消化的小肠阶段，小肠消化0.5 h时，饲粮中添加单宁酸对淀粉酶的活性无显著性影响(P>0.05)；饲粮中添加单宁酸1的胰蛋白酶活性显著高于单宁酸2及对照组，饲粮中添加单宁酸2的胰蛋白酶活性显著低于对照组(P < 0.05)；饲粮中添加单宁酸1和2的糜蛋白酶活性无显著差异(P>0.05)，且均显著低于对照组(P < 0.05)。小肠消化4 h时，饲粮中添加单宁酸1的淀粉酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)，饲粮中添加单宁酸2的淀粉酶活性显著低于单宁酸1添加20 mg·(2 g)-1组和对照组(P < 0.05)。饲粮中添加单宁酸均显著地降低了胰蛋白酶的活性(P < 0.05)，其中单宁酸1 20 mg·(2 g)-1添加水平的胰蛋白酶活性显著低于其他3个单宁酸处理组(P < 0.05)。饲粮中添加单宁酸均显著降低了糜蛋白酶的活性(P < 0.05)，其中，随着单宁酸1添加量的增加糜蛋白酶活性显著降低，而随单宁酸2添加量的增加糜蛋白酶的活性有所回升。总体上，除添加水平为20 mg·(2 g)-1时糜蛋白酶活性外，饲粮中添加单宁酸1消化液中淀粉酶、糜蛋白酶活性高于添加单宁酸2的相应值，而胰蛋白酶活性低于添加单宁酸2的相应值。小肠消化8 h时，随着饲粮中单宁酸1添加量的增加淀粉酶的活性显著下降(P < 0.05)，而单宁酸2随添加量的增加淀粉酶活性却升高。但两种单宁酸在2个水平下淀粉酶活性的平均值无显著差异，且与对照组也无显著差异(P>0.05)。饲粮中添加单宁酸1和单宁酸2的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性不随添加量的增加而显著增加，但是均显著低于对照组(P < 0.05)。单宁酸1在2个水平下胰蛋白酶活性的平均值显著地低于单宁酸2在2个水平的平均值(P < 0.05)，但两种单宁酸在2个添加水平下糜蛋白酶活性的平均值无显著差异(P>0.05)。
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表 3 饲粮中添加单宁酸对生长猪仿生消化中胃、小肠阶段消化酶活性的影响 Table 3 Effect of tannic acid added in diet on digestive enzyme activities in in vitro simulated gastric and small intestine digestion for growing pig |
在饲粮中添加单宁酸对消化率的影响见表 4，4个单宁酸饲粮处理间的干物质消化率差异不显著，但均显著低于空白对照组(P < 0.05)。4个单宁酸饲粮的粗蛋白消化率均显著低于对照组(P < 0.05)，且均随单宁酸1添加量的增加而显著地降低(P < 0.05)。单宁酸1对饲粮的蛋白质消化率的降低程度显著低于单宁酸2(P < 0.05)。单宁酸2在两种添加水平和单宁酸1添加量20 mg·(2 g)-1无显著差异，但显著低于单宁酸1添加10 mg·(2 g)-1时的粗蛋白消化率(P < 0.05)。
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表 4 单宁酸对生长猪仿生消化中玉米-豆粕型饲粮养分消化率的影响 Table 4 Effect of tannic acid on nutrients digestibility of corn-soybean meal in in vitro stimulated digestion for growing pig |
单宁酸为多酚类化合物，因其特殊的化学结构特点，使之易与饲料中的蛋白质、多糖、生物碱结合，也易与溶液中的金属离子发生络合反应生成带有颜色的螯合物[22]。消化酶的本质是蛋白质，因此，单宁酸可与消化酶结合，从而影响消化酶的活性，进而可能影响对饲料养分的消化率[23-24]。本试验研究表明，在没有饲粮存在的条件下，单宁酸会显著降低猪模拟消化液中淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。这与Lou等[8]、Xiao等[9]报道当单宁酸加入酶溶液后能降低淀粉酶、胰蛋白酶活性的结果相一致。然而，在猪仿生消化中，相对于饲粮中不添加单宁酸的对照组，两种单宁酸对小肠模拟消化阶段淀粉酶的活性影响较小，但均显著降低了小肠消化4 h和8 h时胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。这可能是由于在饲粮存在的情况下，单宁酸容易优先与饲粮及溶液中金属离子结合，与消化酶的结合较弱，从而表现出在有/无饲粮时单宁酸对消化酶活性影响不一致的现象。Iji等[25]的研究表明，肉鸡饲粮中添加2.5%单宁酸对肠道中淀粉酶、脂肪酶、麦芽糖酶、蔗糖酶的活性无显著影响。Nyamambi等[26]研究表明，单宁酸对肉鸡体内消化酶活性的抑制作用不明显。一方面是体内消化液呈脉冲式分泌，且个体间差异较大，往往难以从统计学的角度得出单宁酸对消化酶活性的抑制效应；另一方面单宁酸更易与食糜中蛋白质、多糖、金属离子等螯合成稳定的化合物，从而对消化酶活性的螯合作用可能减弱。此外，本试验也呈现猪仿生消化过程中消化酶活性随消化时间而衰减的变化规律，这与王亚等[27]的研究结果相一致。
在本试验中，我们还发现饲粮中添加单宁酸在猪仿生消化的胃阶段和小肠阶段消化液呈现的颜色出现了明显的变化。饲粮中不添加单宁酸的对照组在胃、小肠仿生消化阶段消化液均呈现浅黄色，而含单宁酸的饲粮在胃阶段呈现浅黄色，小肠阶段呈现淡紫色，且小肠阶段颜色变化发生在pH值由胃缓冲液(pH=2.0)自动变换为小肠缓冲液(pH=6.44)的30 min内，此时浓缩的模拟小肠液未自动泵入消化管中。Çakar和Özacar[28]的研究表明，单宁酸与Fe3+络合的程度随着溶液pH的升高而变强。同样，在不同pH下单宁酸与蛋白质的结合能力也不同，在酸性范围内蛋白质随着溶液pH值的升高而增加了对单宁酸的结合位点[29]。本研究中，在无饲粮存在的情况下，单宁酸对胃蛋白酶活性影响较小，可能是由于在pH为2.0酸性条件下，单宁酸与胃蛋白酶结合能力较弱，从而对胃蛋白酶活性影响较小。而在模拟小肠液中消化液的pH呈弱酸性，单宁酸与消化液中的消化酶(蛋白质)结合能力变强，从而表现出无饲粮时显著降低淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。在猪仿生消化中，在胃模拟消化的酸性环境变到小肠模拟消化的弱酸性环境时，单宁酸会优先与饲粮中的成分结合成稳定的螯合物，从而表现出有/无饲粮时单宁酸对模拟小肠液中消化酶活性影响程度不一致的现象。
从单宁酸对玉米-豆粕型饲粮干物质及粗蛋白消化率的影响来看，整体规律呈现单宁酸均降低了饲粮干物质及粗蛋白的消化率。一方面是由于单宁酸降低了消化酶的活性，另一方面是由于单宁酸与饲粮中的化学成分形成了螯合物(前一段所述的颜色反应)，这两者综合作用后降低了消化程度。因此，单宁酸对玉米-豆粕型饲粮粗蛋白消化率的影响程度与无饲粮条件下消化酶活性降低的程度不一致，对模拟消化液消化酶活性降低较大的单宁酸组，其引起饲粮粗蛋白消化率降低的程度并不是最高的。在猪仿生消化中，2种单宁酸在添加量为10 mg·(2 g)-1和20 mg·(2 g)-1两个水平时，玉米-豆粕型饲粮粗蛋白消化率均随着单宁酸含量的增加而呈现降低的现象，这可能主要与糜蛋白酶的活性降低程度有关，而可能与胰蛋白酶活性的变化关系不大。这一结果与王亚等[17]的结果类似。Mariscal-Landín等[11]研究表明，饲粮中添加1%单宁酸虽然对生长猪体内消化酶活性无显著的抑制作用，但却显著降低了饲粮粗蛋白和氨基酸消化率。这进一步说明单宁酸在有饲粮的情况下与饲粮中的化学成分优先螯合，从而降低消化酶对饲粮蛋白质的降解作用。
4 结论在无饲粮时，2种单宁酸均显著降低模拟胃液中胃蛋白酶活性，模拟小肠液中淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性；在添加有单宁酸的饲粮仿生消化中，2种单宁酸均降低消化液中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，但对淀粉酶活性影响不大。单宁酸均显著降低了饲粮粗蛋白的消化率，且随单宁酸含量的增加消化率进一步降低。因此，在猪仿生消化中，单宁酸影响饲粮粗蛋白的消化率可能主要与消化液中糜蛋白酶活性降低以及单宁酸与饲粮中的化学成分形成螯合物降低了小肠消化酶的水解效率有关。
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