畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (6): 1306-1319. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.014    PDF    
引用本文
刘景, 陈炳钿, 李忠荣, 何姝颖, 张世忠, 邱华玲, 缪伏荣, 陈卓, 陈鑫珠. 不同添加水平的磷酸一二钙对肉鸡生产性能、钙磷代谢及盲肠微生物的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(6): 1306-1319.  
LIU Jing, CHEN Bingdian, LI Zhongrong, HE Shuying, ZHANG Shizhong, QIU Hualing, MIAO Furong, CHEN Zhuo, CHEN Xinzhu. Effects of Different Dietary Mono-dicalcium Phosphate Supplementation on Production Performance, Blood Parameters, Bone Calcium, Phosphorus Metabolism and Cecal Microecology in Broilers[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(6): 1306-1319.  
不同添加水平的磷酸一二钙对肉鸡生产性能、钙磷代谢及盲肠微生物的影响
刘景1, 陈炳钿1,2, 李忠荣1, 何姝颖3, 张世忠1, 邱华玲1, 缪伏荣1, 陈卓4, 陈鑫珠1,2     
1. 福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 福州 350013;
2. 福建省新闽科生物科技开发有限公司, 福州 350008;
3. 中化云龙有限公司, 成都 655204;
4. 福建商学院工商管理学院, 福州 350016
收稿日期：2020-01-07
基金项目：省属公益类科研院所（2016R1022-4）；福建省农业科学院对外合作项目（DEC201909）
作者简介：刘景(1967-), 男, 福建长乐人, 副研究员, 本科, 主要从事动物营养需要及资源化利用研究, E-mail:184660569@qq.com.
通信作者：陈鑫珠, 主要从事动物营养与饲料科学方面的研究, E-mail:010622051@163.com.
摘要：本试验旨在研究磷酸一二钙（MDCP）对AA肉鸡生产性能、血液生化指标、胫骨强度、骨骼中钙、磷代谢和盲肠微生态的影响以及在饲粮中完全替代磷酸氢钙的适宜磷酸一二钙添加水平。试验选取健康的1日龄AA肉鸡450只，随机分为5组。对照组（CK）以磷酸氢钙（DCP）补充饲粮非植酸磷，试验组以MDCP补充饲粮非植酸磷，试验1组至试验4组饲粮中非植酸磷水平分别为对照组的60%、80%、100%及120%，即T1、T2、T3和T4。每组6个重复，每个重复15只，试验期42 d。于试验第19~21天和第39~41天进行代谢试验，于第21、42天分别进行生产性能、血液、盲肠微生物等指标测定和样品采集及分析。结果表明：1）与对照组相比，不同试验组均显著提高21 d和42 d肉鸡的生产性能（P < 0.05），其中试验2组欧洲指数最高；2）除试验1组钙表观代谢率外，其他3个试验组21 d钙、磷的表观代谢率显著降低（P < 0.05），试验1组和试验2组42 d的钙、磷表观代谢率显著提高（P < 0.05）；3）试验1组21 d胫骨的钙含量较对照组显著升高（P < 0.05），磷和最大应力显著降低（P < 0.05），试验3组42 d胫骨的钙和磷含量较对照组和试验1组显著提高（P < 0.05），试验2组和试验3组的最大应力显著高于其他处理组（P < 0.05）；4）试验1组21 d血磷含量较对照组显著降低（P < 0.05），试验4组较对照组显著提高（P < 0.05）；5）肉鸡盲肠微生物高通量测序结果表示，对照组和4个试验组21 d肉鸡盲肠微生物有明显差异，聚类分支距离较远，42 d肉鸡试验组的微生物多样性较对照组丰富，其多样性明显高于21 d。综合各项指标结果表明，添加MDCP磷源的量为DCP磷源量的80%时，肉鸡1~21和1~42 d的生产性能，血液、骨骼指标均能达到最佳效果，同时有助于肠道微生物的稳定和健康。
关键词：肉鸡    磷酸一二钙    磷酸氢钙    生产性能    血液生化指标    盲肠微生物    
Effects of Different Dietary Mono-dicalcium Phosphate Supplementation on Production Performance, Blood Parameters, Bone Calcium, Phosphorus Metabolism and Cecal Microecology in Broilers
LIU Jing1, CHEN Bingdian1,2, LI Zhongrong1, HE Shuying3, ZHANG Shizhong1, QIU Hualing1, MIAO Furong1, CHEN Zhuo4, CHEN Xinzhu1,2     
1. Animal Husbandry and Veterinary Medicine Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China;
2. Fujian Xinminke Biology Science and Technology Development Co., Ltd., Fuzhou 350008, China;
3. Sinochem Yunlong Co., Ltd., Chengdu 655204, China;
4. Business Administration College, Fujian Business University, Fuzhou 350016, China
Corresponding author: CHEN Xinzhu, E-mail:010622051@163.com.
Abstract: The purpose of this experiment was to study the effects of mono-dicalcium phosphate (MDCP) on growth performance, serum biochemical indices, tibia indices, metabolism of calcium and phosphorous in bone and cecal microecology of AA broilers and to evaluate the appropriate level of addition for the complete replacement of dicalcium phosphate (DCP) with MDCP in diet. A total of 450 one-day old AA broilers were randomly divided into 5 groups. DCP was used as the control group(CK). Four levels of MDCP were used to replace DCP to provide non-phytate phosphorus which was provided 60%, 80%, 100%, and 120% of the total non-phytate phosphorus labeled as treatment 1 (T1), treatment 2(T2), treatment 3(T3) and treatment 4(T4), respectively, with 6 replicates per group and 15 broilers per replicate for a 42-day trial period. Metabolic traits were conducted from day 19 to 21 and day 39 to 41, respectinely. Data of production performance, blood samples, and cecal microbes were collected and analyzed on 21 and 42 d, respectively. The results showed as follows:1) Compared with the CK group, the MDCP test groups improved the performance of broilers at 21 and 42 d significantly (P < 0.05), and T2 group had the highest European index. 2) The apparent metabolic rate of calcium and phosphorus were decreased significantly in T2, T3 and T4 groups (P < 0.05) at 21 d, and was increased significantly in T1 and T2 groups at 42 d (P < 0.05). 3) Tibia calcium content of T1 group was significantly increased and phosphorus and maximum stress were significantly decreased at 21 d compared with CK group (P < 0.05), tibia calcium and phosphorus content of T3 group were significantly increased compared with CK and T1 group at 42 d (P < 0.05), the maximum stress of T2 and T3 group were significantly higher than the other groups at 42 d (P < 0.05). 4) Compared with CK group, the blood phosphorus content was significantly decreased in T1 group (P < 0.05), and was significantly increased in T4 group (P < 0.05). 5) The results of high-throughput sequencing of cecal microbes in broiler chickens showed that there were significant differences in cecal microbes between the CK group and the T1-T4 groups, and the clustering distance was farther at 21 d. The diversity of cecal microbes at 42 d was significantly higher than at 21 d. The results of various indicators showed that MDCP could replace DCP as a source of non-phytate phosphorus in broiler chickens. According to European index, tibia indices, serum biochemical indices and cecal microbes of broilers, the MDCP at 80% replacement level had the best performance.
Key words: broiler    mono-dicalcium phosphate (MDCP)    dicalcium phosphate (DCP)    growth performance    serum biochemical indices    cecal microbes    

饲料磷酸盐是矿物元素添加剂，参与动物体内新陈代谢，能够提高动物生长和生产性能，防止和减少疾病，主要用于畜禽、水产等养殖动物饲料中[1]。目前，饲料磷酸盐产品主要包括：磷酸氢钙(DCP) [CaHPO4·2H2O]、磷酸二氢钙(MCP) [Ca(H2PO4) 2·H2O]、脱氟磷酸钙(DFP) [Ca3(PO4) 2]、磷酸一二钙(MDCP)[CaHPO4·2H2O·Ca(H2PO4) 2·H2O]等，其他磷酸盐产品，如磷酸一铵(MAP)、磷酸二铵(DAP)、磷酸钙镁、尿素磷酸盐等较少应用在畜禽饲料中[2]。当前DCP是使用最多的磷酸盐，但DCP中磷难溶于水，动物对其有效成分的吸收率低(不到60%)，其余磷、钙元素随粪便排出，会对地下水资源、土壤等造成污染问题[3]。MDCP是磷酸二氢钙(MCP)与磷酸氢钙(DCP)的共晶结合物，有效成分的吸收率高于DCP (>75%)，且粪便中残留的磷较少，其用于取代DCP成为近年来的研究热点之一[2-3]。

磷是家禽必需的矿物质元素，在核酸代谢、能量代谢、骨骼发育和钙化过程中具有重要作用[4]。上世纪90年代，以DCP为主的无机磷源是家禽主要的磷源补充原料[2]。随着科技发展，科学家研制出了一种MCP和DCP的共晶结合物MDCP，因其磷利用率高而被用来替代DCP。相较DCP，MDCP是家禽更好的磷源[1]，动物对其有效成分的吸收率远远高于DCP(>75%)。万敏艳等[5]研究MDCP对肉鸡相对生物学利用率结果表明，相对于DCP(100%)，MDCP对肉鸡的生物学利用率是112.5%。另有报道表明，肉鸡肠道微生物区系受饲粮因素的影响[6]，饲料中的碳水化合物、脂质、粗蛋白质水平及来源、益生元的添加等均对肉鸡肠道微生物有影响[7]。小麦饲粮中的豆油被癸酸和月桂酸替代，肉鸡回肠乳杆菌科(Lactobacillaceae)的乳杆菌属以及细球菌科(Micrococcaceae)和肠球菌科一些菌属的数量显著降低，肠杆菌科数量显著升高，同时回肠食糜pH显著降低[8]。当肉鸡饲粮粗蛋白质水平在NRC(1994)基础上均下调1.8个百分点时，其回肠大肠杆菌的数量有降低[9]。饲喂动物性蛋白的饲粮，肉鸡盲肠中双歧杆菌属数量显著增加[10]。矿物质元素中磷源的改变是否对肉鸡肠道微生物产生影响，目前未见报道。因此，本研究在无植酸酶添加的条件下，采用无抗日粮配方探讨肉鸡饲料中不同添加水平的MDCP对肉鸡生产性能、钙磷代谢及盲肠微生物的影响，以期为MDCP在饲料中经济合理的利用提供科学依据和理论指导。

1 材料与方法 1.1 试验材料

磷酸一二钙(MDCP)和磷酸氢钙(DCP)均由中化云龙有限公司提供，其中饲料级MDCP的钙和无机磷含量分别为14.7%和21.4%；饲料级DCP纯度为99%，钙、无机磷含量分别为23.0%和17.7%。AA肉鸡购于福建圣农集团有限公司。

1.2 试验设计

选取1日龄AA肉鸡450只，随机分为5组，每组6个重复，每重复15只，各组肉鸡初始体重差异不显著。对照组(CK)以磷酸氢钙(DCP)补充饲粮非植酸磷，试验组以磷酸一二钙(MDCP)补充饲粮非植酸磷，试验1至4组饲粮中非植酸磷水平分别为对照组的60%、80%、100%和120%，即T1、T2、T3和T4。试验设计见表 1，试验期42 d。

表 1 试验设计 Table 1 The design of experiments
1.3 试验饲粮

试验饲粮参考《鸡饲养标准》(NY/T33—2004)营养推荐量和AA商品代肉鸡营养标准配制，饲粮中除钙磷水平不同外，其他营养水平均一致，钙与总磷比值(钙磷比)保持在1.2~1.4之间。试验饲粮组成与营养水平见表 2。所有饲粮均添加0.40%二氧化钛作为外源性指示剂。

表 2 试验饲粮组成与营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) 
1.4 饲养管理

试验采用全封闭式鸡舍笼养方式，自由采食和饮水。各组间重复采用随机排列。按(AA)商品代肉鸡饲养管理手册进行日常管理和免疫，粉料食槽投喂，每日记录饲料消耗量和鸡死亡及淘汰数，记录试验鸡疫苗接种情况、疾病发生及治疗情况。

1.5 样品采集与制备

于试验第19~21天和第39~41天进行消化代谢试验，每天下午定时收集全部新鲜粪样(挑出里面的羽毛、饲料、皮屑等杂物)，混合后取20%放于自封袋内，喷洒10%盐酸溶液后4 ℃冰箱保存，最后将3 d收集的粪样于65 ℃烘箱中烘干，置室温下回潮24 h，粉碎过40目筛，待测钙和磷的含量。

于试验期第20和41天晚上20：00起试验鸡禁食，12 h后个体称重，并从每个重复选取2只接近平均体重的肉鸡，翅静脉采血5 mL，静置30 min后，将血液3 000 r·min－1离心10 min，取血清分2份装于1.5 mL冷冻管于－20 ℃保存，待测血清钙、磷含量和碱性磷酸酶活性。采血后的鸡通过颈部移位处死，取鸡的左右腿胫骨，去除肌肉和结缔组织，右胫骨放入－20 ℃保存以备分析胫骨强度。左胫骨用无水乙醇脱脂48 h，再于105 ℃烘干48 h，粉碎以备分析钙和磷的含量。使用无菌操作采集肉鸡盲肠新鲜内容物放入10 mL无菌冻存管中，快速放入液氮罐，带回实验室用－80 ℃冰箱保存。

1.6 指标测定

1.6.1 生产性能 　　以重复为单位，测定试验第1、21和42天肉鸡空腹体重，每天记录各重复饲料消耗量、死淘数，计算1~21和22~42 d平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)及料重比(F/G)。

1.6.2 钙磷表观消化率 　　在1~21和22~42 d两个阶段各3 d收粪期，采取全收粪法代谢试验。试验饲粮和代谢排泄物均测定钙、磷和二氧化钛含量，并测定饲粮系酸力，计算干物质、钙和磷表观代谢率。其中钙和磷含量的测定参考张丽英[11]方法; 按照Short等[12]描述的方法进行二氧化钛含量的测定。

1.6.3 血清生化指标 　　采用DIRUI 600全自动生化分析仪测定血清中的血钙、血磷、全套生化指标。

1.6.4 胫骨强度 　　采用日本岛津AG-IC 20KN骨强度测定仪对解剖剥净的右胫骨进行骨强度测定。

1.6.5 欧洲指数 　　肉鸡欧洲指数(EPI)的计算方法：EPI=[成活率*体重(kg)]/(料肉比*出栏天数)*10 000。

1.6.6 盲肠微生物菌群分析 　　按照粪便基因组提取试剂盒(Omege D40-15)操作说明，提取盲肠内容物总DNA，用核酸浓度测定仪检测其浓度和纯度。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

16S rRNA V3-V4区扩增、基因测序文库构建和Illumina Miseq测序及数据生物学分析委托诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.7 数据统计

试验数据用“平均值±标准差”表示，采用Excel软件对数据进行初步整理统计，采用SPSS19.0对试验数据进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏多重比较检验，P < 0.05判定为差异显著。

2 结果 2.1 MDCP不同添加水平对肉鸡生产性能影响

由表 3可知，4个MDCP试验组21 d的平均活体重(BW)、平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)显著高于对照组(P＜0.05)，料重比(F/G)显著低于对照组(P＜0.05)；另外，试验2组和试验4组F/G显著低于试验1组(P＜0.05)。42 d试验2组、试验3组和试验4组的平均活体重(BW)、平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)显著高于对照组(P＜0.05)。21和42 d各组死亡率均无显著差异(P>0.05)。各组的欧洲指数(EPI)排序为：试验2组>试验3组>试验4组>对照组>试验1组。

表 3 MDCP不同添加水平对肉鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of dietary MDCP supplementation on growth performance of broilers
2.2 MDCP不同添加水平对肉鸡养分表观代谢率的影响

由表 4可见，21 d钙表观代谢率，对照组和试验1组显著高于试验2组、3组和试验4组(P＜0.05)；磷表观代谢率，对照组显著高于4个试验组(P＜0.05)。42 d钙、磷表观代谢率，对照组显著低于试验1组和试验2组(P＜0.05)，试验1组钙、磷的表观代谢率显著高于其他组(P＜0.05)。

表 4 MDCP不同添加水平对肉鸡养分表观代谢率的影响 Table 4 Effects of dietary MDCP supplementation on apparent nutrient metabolic rates of broilers 
2.3 MDCP不同添加水平对肉鸡胫骨指标的影响

由表 5可见，21 d试验1组肉鸡胫骨中的钙含量显著高于对照组(P＜0.05)，磷含量和最大应力显著低于对照组(P＜0.05)；试验3组最大应力显著高于对照组和试验1组(P＜0.05)；42 d试验3组肉鸡胫骨中钙、磷含量和最大应力显著高于对照组和试验1组(P＜0.05)，试验3组的最大应力显著高于试验4组(P＜0.05)；另外，试验2组最大应力显著高于对照组、试验1组和试验4组(P＜0.05)。

表 5 MDCP不同添加水平对肉鸡胫骨指标的影响 Table 5 Effects of dietary MDCP supplementation on tibia indices of broilers
2.4 MDCP不同添加水平对肉鸡血清生化指标的影响

2.4.1 MDCP不同添加水平对肉鸡血钙、血磷和碱性磷酸酶的影响 　　由表 6可见，21 d肉鸡血钙含量对照组与4个试验组无显著差异(P>0.05)，试验1组显著低于试验2组和试验4组(P＜0.05)；对照组血磷含量显著高于试验1组(P＜0.05)，显著低于试验4组(P＜0.05)，试验1组显著低于试验4组(P＜0.05)；各组碱性磷酸酶含量无显著差异(P>0.05)。42 d肉鸡各组的血钙、血磷和碱性磷酸酶含量均无显著差异(P>0.05)。

表 6 MDCP不同添加水平对肉鸡血钙、血磷和碱性磷酸酶的影响 Table 6 Effects of dietary MDCP supplementation on serum calcium, phosphorus contents and alkaline phosphatase activity of broilers

2.4.2 MDCP不同添加水平对肉鸡血清蛋白的影响 　　由表 7可见，21 d肉鸡血清中的白蛋白和球蛋白试验1组显著低于试验2组、试验3组和试验4组(P＜0.05)，总蛋白和白球比各组间无显著差异(P>0.05)。42 d肉鸡血清中的各种蛋白成分均无显著差异(P>0.05)。

表 7 MDCP不同添加水平对肉鸡血清蛋白的影响 Table 7 Effects of dietary MDCP supplementation on serum protein contents of broilers
2.5 MDCP不同添加水平对肉鸡盲肠微生物的影响

2.5.1 OTU分析 　　OTU热图(图 1)分析中，Z值表示菌属的丰度，其颜色越红，Z值越大，菌属丰度越大。21 d肉鸡盲肠微生物中对照组(Step 1.0)Tyzzerella和Eisenbergiella两个属菌Z值较大；试验1组(Step 1.1)Merdibacter、Pseudoflavonifractor和unidentified-Ruminococcaceae 3个属菌Z值较大；试验2组(Step 1.2) Flavonifractor和Fournierella两个属菌Z值较大；试验3组(Step 1.3)Erysipelatoclostridium属菌Z值较大，试验4组(Step 1.4)Anaerostipes、Hydrogenoanaerobacterium和Lactobacillus 3个属菌Z值较大。42 d对照组(Step 2.0)中Bacterioides属菌Z值较大；试验1组(Step 2.1)Akkermansia、Anaerofilum、Desulfovibrio、Helicobacter和Phascolarctobacterium 5个属菌Z值较大，试验2组(Step 2.2)中Bilophila和Alistipes两个属菌Z值较大；试验3组(Step 2.3)Parabacteroides和Butyricmonas两个属菌Z值较大，试验4组(Step 2.4)Megamonas、Methanobrevibacter和Sutterella 3个属菌Z值较大。

Step1.0. 21 d对照组；Step1.1. 21 d试验1组；Step1.2. 21 d试验2组；Step1.3. 21 d试验3组；Step1.4. 21 d试验4组；Step2.0. 42 d对照组；Step2.1. 42 d试验1组；Step2.2. 42 d试验2组；Step2.3. 42 d试验3组；Step2.4. 42 d试验4组。下同 Step 1.0. 21 d CK; Step 1.1. 21 d T1;Step 1.2. 21 d T2;Step 1.3. 21 d T3;Step 1.4. 21 d T4;Step 2.0. 42 d CK; Step 2.1. 42 d T1;Step 2.2. 42 d T2;Step 2.3. 42 d T3;Step 2.4. 42 d T4;The same as below 图 1 MDCP不同添加水平21和42 d肉鸡盲肠微生物OTU表达谱热图 Fig. 1 OTU heat map of 21 and 42 d broiler cecal microbes of different MDCP addition levels

根据物种注释结果，选取每个样本属水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，可直观反映各样本在属水平上，相对丰度较高的物种及其比例(图 2)。结果发现，在21 d肉鸡盲肠中，与对照组相比，试验1组中unidentified-Ruminococcaceae增加，而其他3个试验组减少；试验2组中Flavonifractor增加；各试验组中Intestinimonas和unidentified-Lachnospiraceae增加，Eisenbergiella减少；试验3组和试验4组中Lachnoclostridium减少；42 d肉鸡盲肠中，与对照组相比，各试验组的Bacteroides减少；试验2组中Alistipes增加，而其他3个试验组减少；试验2组和试验3组中Faecalibacterium增加；试验3组中Parabacteroides增加，而其他3个试验组减少。

Others表示图中这10个属之外的其他所有属的相对丰度之和 Others indicates the sum of the relative abundances of all the genus except the 10 genus in the figure 图 2 肉鸡盲肠微生物属水平上的物种相对丰度柱形图 Fig. 2 Spectral relative abundance of cecal microbes of broiler chickens at the level of genus

2.5.2 α-多样性分析 　　MDCP不同添加水平21和42 d肉鸡盲肠微生物基于OTU的花瓣图见图 3。从图中可以看出肉鸡盲肠中微生物的多样性，其中有98种微生物种类是共同的，其余的各组也有不同微生物种类。21 d肉鸡的盲肠微生物多样性中，除试验4组的种类较少外，其他各组微生物的种类数量相似；42 d肉鸡的盲肠微生物多样性中，对照组的微生物种类显著低于4个试验组。

图 3 MDCP不同添加水平21和42 d肉鸡盲肠微生物基于OTU的花瓣图 Fig. 3 Petal map of 21 and 42 d broiler cecal microbes of different MDCP addition levels

2.5.3 β-多样性分析 　　NMDS是基于Bray-Curtis距离来进行分析的非线性模型，根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在二维平面上，应用NMDS分析，根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在多维空间上，而对不同样本间的差异程度，则是通过点与点间的距离体现，能够反映样本的组间和组内差异。NMDS分析中的Stress小于0.001，可以准确反映样本间的差异程度。图 4中21 d对照组(Step 1.0)在第一象限，而其他4个处理组(Step 1.1、Step 1.2、Step 1.3和Step 1.4)均分布在第四象限，与之距离较远。42 d对照组(Step 2.0)分布在第三现象最底部，与其他处理(Step 2.1、Step 2.2、Step 2.3和Step 2.4)的距离也较远。说明21或42 d，MDCP替代DCP对肠道微生物种群分布有显著影响。

NMDS.无度量多维标定法 NMDS. Non-Metric Multi-Dimensional Scaling 图 4 MDCP不同添加水平21和42 d肉鸡盲肠微生物NMDS分析 Fig. 4 NMDS analysis of 21 and 42 d broiler cecal microbes of different MDCP addition levels

为了研究不同替代水平21和42 d肉鸡盲肠微生的相似性，对样本进行聚类分析，构建样本的聚类树。基于Unweighted Unifrac距离的UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)聚类树见图 5。在21 d肉鸡盲肠微生物中，试验3组和试验4组微生物相似性较高，距离最近，首先聚为一类，其次与试验2组聚为一类后，再与试验1组聚为一类，最后才与对照组聚为一类；在42 d肉鸡盲肠微生物中，试验1组和试验4组首先聚为一类，其次与对照组聚为一类后，再与试验2组聚为一类，最后与试验3组聚为一类。这说明21 d时肉鸡试验组盲肠的微生物菌群相似度较高，与对照组相似度距离最远，而42 d时肉鸡试验3组与其他组的距离较远。

图 5 基于Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类树 Fig. 5 UPGMA clustering tree based on Unweighted Unifrac distance
3 讨论 3.1 MDCP不同添加水平对肉鸡生产性能、血液指标、骨骼钙、磷代谢等指标的影响

在体内所有矿物元素之中，磷元素参与了机体构成及体内几乎全部的代谢活动，包括骨骼及牙齿的构成与完成性，参与能量代谢，促进维生素吸收，细胞膜、遗传物质和酶类的结构物质，维持渗透压，维持酸碱平衡，调控动物采食等[13-15]。钟文文等[16]研究报道，磷缺乏日粮显著降低蛋壳厚度，显著降低蛋鸡胫骨灰分和钙的含量。韩进诚等[17]报道，随着饲粮非植酸磷水平升高, 肉鸡体增重、采食量、饲料转化率、血清无机磷浓度、胫骨长度、强度、灰分含量与重量、胫骨磷含量以及粗蛋白质、TP和Ca利用率呈二次曲线上升。刘帅等[18]研究报道，饲粮磷水平对育成期水貂的末重、平均日增重有极显著影响，对平均日采食量、料重比有显著影响。因此，动物饲料中磷的添加非常重要，能够对动物机体的生产性能、骨骼、血液生化指标等产生显著影响。

然而，磷资源是不可再生资源，降低畜禽粪便中磷的排放，减少环境污染，具有重要的现实意义[2-3, 9-10, 19]。除了在饲料中添加植酸酶提高日粮中植酸磷的利用外，选择生物效价较高的磷源是实现减排的另一个有效的措施[19-23]。而MDCP的生物学效价较DCP更高，其做磷源更有优势[19-23]。本试验结果表明，采用MDCP组的肉鸡生产性能显著提高(P＜0.05)，其中80%替代水平的MDCP组的生产性能和欧洲指数最高；采用MDCP的各试验组中肉鸡的钙、磷的表观代谢率、胫骨、磷含量和最大应力及血液中钙、磷含量和生化指标均有一定影响。说明MDCP在肉鸡中的应用效果优于DCP。这是因为MDCP是DCP和磷酸二氢钙(MCP)的共晶物，其水溶磷的含量高达17.5%，远远高于10%的国际标准[23]。Rucker等[24]报道，与不含结晶的磷酸氢钙相比，含有结晶水的磷酸氢钙更易溶于酸性环境，且动物的利用率更高。MDCP为MCP与DCP的络合物，pH值约为4，呈酸性，有利于增强动物口感，提高采食量。本试验结果与许多研究结果相类似，再次证实了MDCP的应用价值。Ghiyasi等[9]研究结果表明，DCP与MDCP同等添加量下，MDCP能够提高肉鸡的体重和体增重。万敏艳等[5]研究表明，磷添加水平提高，肉鸡采食量、体增重显著增加，而料重比和死淘率显著降低。因此，在经济和效益原则下，使用MDCP替代DCP提供非植酸磷总量的80%水平即可有效提高肉鸡的生产性能，具有极高经济价值。

饲料中的钙、磷通过消化道吸收进入血液供机体形成骨骼，二者的作用密切相关，只有在比例约为1~2:1，才能很好地发挥其功能，促进畜禽的生长，其在动物体内的平衡是受机体非常精确地控制的[25-26]。本次试验，设计钙水平固定，磷源和添加水平不同，其钙磷比例在1~2:1范围内，各组生长状况良好，在生产性能上MDCP组显示了其优越性，两个阶段各组表观代谢率、血液指标等的表现不完全一致。21 d钙表观代谢率，对照组和试验1组显著高于试验2组、3组和试验4组，胫骨中的试验1组钙含量显著高于对照组，血钙含量对照组与4个试验组无显著差异，试验1组显著低于试验2组和试验4组；磷表观代谢率，对照组显著高于4个试验组，胫骨中试验1组磷含量和最大应力显著低于对照组；试验3组最大应力显著高于对照组和试验1组；血磷含量，对照组显著高于试验1组，显著低于试验4组，试验1组显著低于试验4组；而42 d钙、磷表观代谢率，对照组显著低于试验1组和试验2组，试验1组钙、磷的表观代谢率显著高于其他组，胫骨中试验3组钙、磷含量和最大应力显著高于对照组和试验1组，试验3组的最大应力显著高于试验4组；各组的血钙、血磷和碱性磷酸酶含量均无显著差异。21 d肉鸡日龄较小，机体的对血钙、血磷等指标的调控能力较弱，因此出现磷水平较低时即试验1组的血磷、血钙等指标与其他组存在较多差异，而到42 d时，肉鸡机体个方面均成熟，在一定范围内，调控能力增强[25]，因此，各组的血钙、血磷和碱性磷酸酶含量均无显著差异。日粮钙磷比过高或过低时都会降低血液、肝以及肌肉组织中的钙磷沉积，且不同钙磷比对血液、肝以及肌肉组织中的钙磷含量影响程度不一，这可能与饲喂条件和时间有关[27]。动物对钙、磷的摄入量与排出量相等，骨组织中的钙、磷与体液中的钙、磷交换量相等，血浆中钙和磷的含量亦保持相对恒定[27-28]。本试验中，21 d钙表观代谢率，对照组和试验1组显著高于试验2组、3组和试验4组，说明试验2、3和4组饲粮中机体可吸收钙磷量较高，因此多余的钙排出较多，另一侧面说明，MDCP的生物学效价较DCP高。余洋[19]研究表明，碱性磷酸酶水平高成骨作用较强。本试验各组间碱性磷酸酶无显著差异，21 d肉鸡正是骨骼生长的旺盛时期，MDCP试验组的碱性磷酸酶水平稍高于DCP组，其胫骨最大应力也稍高，再次说明使用磷源MDCP优于DCP。

3.2 MDCP不同添加水平对肉鸡盲肠微生物的影响

采用16S rDNA高通量测序技术分析肉鸡盲肠菌群组成结果，无论是OTU的热图分析和堆叠图分析，还是花瓣图、无度量多维标定法分析和聚类分析等多样性分析均表明，MDCP替代DCP后，肉鸡盲肠微生物发生明显变化，同时MDCP添加水平不同，其盲肠微生物也会有所差异。本试验肉鸡21 d磷的表观消化率对照组高于试验组，而42 d对照组低于试验1组和试验2组，花瓣图α-多样性分析中结果也显示，21 d中盲肠中对照组的微生物多样性多于试验组，因此，其原因可能与肉鸡肠道微生物多样性有关。磷元素参与体内的生长代谢，对机体的生命活动起着重要的作用，微生物的生长繁殖也离不开磷元素的参与[13-15]。本试验测序结果分析表明，肉鸡盲肠中门水平上OTU top 5的为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)和软壁菌门(Tenericutes)。这与许多报道结果相似[29-33]。林奕岑等[31]利用Illumina MiSeq测序平台对22 d肉鸡盲肠微生物的多样性进行探索研究，结果发现了拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和蓝菌门(Cyanobacteria) 4个共享优势菌门。宫玉杰等[32]报道，肉鸡盲肠菌群中厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门为早期肉鸡肠道内的优势菌门。陈荣等[33]研究表明，拜城油鸡盲肠细菌优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。另外，本试验结果发现，肉鸡盲肠中top10的菌属主要是拟杆菌属(Bacteroides)、另枝菌属(Alistipes)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、副拟杆菌(Parabacteroides)、瘤胃菌科未确定菌属(unidentified-Ruminococcaceae)、黄杆菌属(Flavonifractor)、Intestinimonas属、Eisenbergiella属、梭状芽孢杆菌属(Lachnoclostridium)和毛螺科未确定菌属(unidentified-Lachnospiraceae)。其中盲肠中益生菌菌属有乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)等，虽占比例较低，但与对照组相比，有所提高。林奕岑等[31]也报道，有益菌群如乳酸杆菌属、双歧杆菌属等虽然存在于盲肠微生物中，但相对丰度不高。本研究中，在相对丰度大于1%的优势菌群中，有相当大一部分为尚未命名的菌属，说明有关肉鸡盲肠微生物在属水平上的研究还不够深入，这与技术限制有关，同时也表明肉鸡盲肠微生物有待进一步研究。

肉鸡中磷源不同对盲肠微生物的影响，鲜有报道。万荣等[34]报道，与DCP相比，MDCP和MCP可显著提高空肠总菌数和盲肠乙酸及丙酸含量，有增加空肠和盲肠乳酸杆菌及空肠双歧杆菌趋势，但差异不显著。本试验结果表明，与DCP相比，MDCP提高了盲肠的微生物的种类和数量。这可能与MDCP改善了肠道内环境pH有关。DCP与MDCP的pH值存在较大差异，DCP为7.2~7.9，MCP为2.4~3.0，而MDCP根据DCP和MCP比例的不同，其pH发生相应的改变，水溶性磷为10%时，pH为4.4[35]。环境pH可引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，介质的pH不仅影响微生物的生长，甚至影响微生物的形态[36]。徐运杰等[37]在培养液磷含量和pH对鸡离体小肠磷吸收的影响研究中发现，培养液pH和磷含量对鸡离体小肠的磷吸收量有明显影响，pH 5.0~7.0时，肠囊的磷吸收量线性增加，与pH 5.0比较，pH 7.0时，肠囊的磷吸收量极显著增加，pH 8.0时，肠囊的磷吸收量开始降低；磷含量在50~200 μg·mL-1时，肠囊的磷吸收量与磷含量呈正相关，当磷含量增加到400 μg·mL-1，十二指肠肠囊和空肠肠囊的磷吸收量开始降低。杨胜香等[38]研究不同碳氮磷源改良剂对铅锌尾矿废弃地土壤微生物群落结构的影响中表明，添加不同碳氮磷源改良剂对土壤微生物群落组成、多样性、微生物活性和微生物生物量均有显著性影响。因此，不同磷源的添加，对肉鸡肠道微生物的多样性有影响，其中有益微生物的增多，有益于肉鸡肠道的健康。

4 结论

综上所述，不同磷源对肉鸡生产性能和盲肠微生物有显著影响，与DCP相比，MDCP显著提高肉鸡的生产性能，提高42 d肉鸡盲肠微生物的多样性和有益菌的数量，提高肠道的微生物稳定性和肠道健康。不同MDCP添加量对肉鸡的钙、磷表观消化率有差异，对血液和胫骨的钙、磷含量和胫骨的最大应力等均有一定的影响。使用MDCP替代DCP提供非植酸磷总量的80%水平时，肉鸡的欧洲指数最高，可获得较好的生产性能和经济效益。

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