2. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070
2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
温室效应引起的全球气温变暖、海平面上升、极端气候频发等一系列问题已经严重威胁到了人类生存，如何减缓温室效应的加剧成为近年来全球亟待解决的问题。甲烷(CH4)与二氧化碳(CO2)同为温室气体，但CH4在大气中更加稳定，无法同CO2一样被植物利用；且CH4具有更高的升温潜力，是同体积CO2的20~25倍，占全球气候变暖贡献率的15%~20%[1]。大气中的CH4占人类活动温室气体排放总量的16%[2]，其中由反刍动物肠道微生物发酵产生的CH4大约占整个农业生产行业的45%[3]。CH4排放不仅给大气环境带来了负担，同时造成了大量的能量浪费，据估计，反刍动物以CH4消耗的能量约占日粮总能量的2%~12%[4]。因此，降低家畜CH4排放已经成为一个研究的热点问题，目前也提出了许多关于CH4减排的添加剂，例如化学制剂、生物及其代谢产物和植物提取物等[5-6]。
白藜芦醇(RES，3, 5, 4-三羟基二苯烯)是一种二苯烯类化合物。RES作为一种多酚类天然植物提取物，广泛存在于葡萄果皮和籽实(红葡萄果皮中尤为丰富)、桑葚和中草药虎杖中，由于其具有抗氧化、抗衰老、抗癌等作用，目前在医疗、保健、膳食等领域已经得到了广泛应用[7-8]。陈丹丹等[9]和Ma等[10]研究表明，在肉羊饲粮中添加RES能够有效降低CH4排放并促进动物生长。但上述研究中使用的饲粮以粗料为主(约70%)，李岩等[11]和赵臣等[12]研究表明，饲粮组成和营养结构会对添加剂的效果产生不同影响，高精料条件下RES的作用效果是否与高粗料一致，还不明确。此外，调整饲粮营养结构也是一种目前被广泛证明有效的CH4减排途径[13-14]。因此，本试验通过研究在高精/粗料底物条件下，RES添加水平对CH4排放、底物降解率的影响；同时检测发酵液中微生物群落的变化情况，以期为研究不同RES水平下CH4排放规律及减排机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验地点与时间本试验于2018年8—11月在中国农业科学院南口试验基地进行。
1.2 试验材料试验中的RES(纯度≥98%)购自湖南省长沙世唯生物科技有限公司。发酵底物的精粗比分别为为68:32(高精料，HC)和28:72(高粗料，HF)，基础底物原料和营养水平见表 1，原料过1 mm筛。
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表 1 基础发酵底物组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal fermentation substrate (dry mater basis) |
选择3只健康无疾病、体重相似((50±2.3)kg)、安装永久性瘤胃瘘管的杜寒杂交肉羊作为瘤胃液供体。预试期为15 d，试验期为4 d。试验羊采用单栏单饲，每天定时(08：00和16：00)饲喂两次，饲喂量按维持需要确定。自由饮水，每周定时消毒和清理粪便。饲粮为精粗比4:6的全混合颗粒料，其中精料为玉米、大豆粕和小麦麸，粗料为羊草。
1.4 瘤胃体外发酵体外产气试验：在试验前一天，分别称取两种基础发酵底物0.3 g(精确到0.000 1 g)和4个添加水平的RES于培养管(Haberle labortechnik, Germany)底部，共计85个(两种底物×4个RES添加水平×两个采样时间点×5个重复+5个空白)培养管，并按照Menke和Steingass[15]的方法配制瘤胃缓冲液。晨饲前2 h，采集3只瘘管羊的瘤胃内容物，经4层纱布过滤后将瘤胃液等量混合，再转移至保温瓶(CO2环境，39 ℃预热)带回试验室。将瘤胃液与缓冲液按2:1比例混合，整个过程维持CO2环境。定量移取30 mL瘤胃培养缓冲液到每一个培养管中，并将其迅速转移入水浴恒温振荡器培养(39 ℃，50 r·min-1)(DSHZ-300A，太仓实验设备厂)。在发酵12和24 h两个时间点分两批冰浴终止发酵，记录总产气量并用集气袋收集气体用于CH4产量检测，收集对照组和14.3%组的发酵液保存于－80 ℃冰箱用于微生物检测。
体外降解试验：利用Ankom DaisyII型模拟培养箱(Ankom Technology Corp，Macedon，NY)进行。采用韩璐璐[16]的方法进行瘤胃缓冲营养液配置。称取两种底物各8 g(精确到0.000 1 g)和2个添加水平(0%、14.3%)的RES至F510(50 μm孔径，50 mm×100 mm)滤袋中，并用封口机封口，共计45个(两种底物×两个RES添加水平×两个采样时间点×5个重复+5个空白)滤袋。将采集的新鲜瘤胃液与瘤胃缓冲液(39 ℃，CO2环境)按照1:4的比例加入2 L的培养瓶中，将所有滤袋按不同处理分别投入8个培养瓶内，缓慢通入CO2气体2 min。随后将培养瓶移至培养箱，恒温(39 ℃)振荡培养。在培养的第12、24小时分批取出所有的滤袋，用清水轻柔漂洗至水澄清。随后在65 ℃烘48 h至恒重，检测发酵残余物中的营养成分。
1.5 测定指标与方法1.5.1 CH4产量 使用气相色谱仪(GC126，上海仪电分析仪器有限公司，上海)检测气体样品中CH4的含量。以CH4含量为1.99%作为标准气体(北京海谱气体有限公司，北京)，填充气体为高纯氮气。仪器检测条件为：5A分子筛色谱柱，载气为高纯N2，流速40 mL·min-1；燃气为高纯氢气(由空气经氢气发生器制取)，流速40 mL·min-1；助燃气为干燥空气，流速400 mL·min-1；色谱柱温80 ℃；进样口温度150.0 ℃；FID检测器温度150.0 ℃，灵敏度为1×108。
1.5.2 瘤胃降解率 取65 ℃烘干的发酵残余物，参照张丽英[17]的方法分析样品中干物质(DM)、有机物(OM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量，并参照刘洁[18]的方法计算各养分在各处理下的降解率。
1.5.3 DNA提取及16S rDNA测序分析 利用试剂盒对发酵液样品进行瘤胃微生物DNA提取，并利用NanoDrop 2000(Thermo Scientific，Wilmington，USA)进行DNA浓度和质量检测。质检合格后扩增16S rDNA基因V3-V4区，PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司，上海)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱。由NextflexTM Rapid DNA Seq Kit(Biooscientific，Austin，USA)构建Miseq文库，并使用Hiseq 250平台(Illumina，San Diego CA，USA)测序。
对原始数据进行过滤、筛选得到优质序列。对所有序列进行OTU(相似度97%)划分，采用RDP Classifier算法对OTU代表序列进行比对分析，并在各个水平(门、纲、目、科、属和种)注释其群落的物种信息。计算α多样性：多样性指数(Shannon)和丰富度指数(Chao 1、Observed_species)；β多样性，将数据降维处理后，用二维主成分分析(PCA)图将最高的两个主成分进行差异性展示。
1.6 数据统计分析试验数据首先使用Excel 2016进行初步整理，再进行下一步统计分析。所有产气和降解率指标，均利用SPSS 20.0软件中一般线性模型(GLM)，选用交互模型进行RES和底物两因素方差分析，得到底物、RES和互作效应；然后对不同RES水平进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较；同时，对不同RES水平下的CH4产量和产气量(GP)的变化趋势进行线性(Linear)和二次(Quadratic)曲线估计。
所有微生物指标均利用R 3.6.1软件中ARTool包进行非参数双因素统计，以RES和底物作为两个因子进行分析，分别得到底物、RES和互作效应；然后分别对不同底物条件下的RES处理进行非参数Mann-Whitney U(二样本)检验。均以P < 0.05作为差异显著判断标准，结果用平均数表示，变异程度用标准误(SEM)表示。
2 结果 2.1 RES对发酵产气量和CH4排放量的影响由表 2可知，随发酵时间的延长各处理的GP和CH4产量上升。底物类型和RES水平对体外产气量和CH4产量具有显著影响(P < 0.05)，且两因素存在互作效应(P < 0.05)。在相同底物条件下，HC底物中，产气量(GP)和CH4产量随RES添加水平的增加显著地线性和二次降低(P < 0.05)，除发酵24 h CH4产量外，以25.0%组最低；两指标的变化在HF底物中也呈现了相似的趋势。在相同RES处理下，相较HC，HF中GP和CH4产量均显著降低(P < 0.05)，且两因素对两指标的变化存在交互作用。另外发现，HF中两个发酵时间点的GP在3个RES添加水平组间的变化均不显著(P>0.05)。
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表 2 白藜芦醇对不同底物体外产气及甲烷排放的影响 Table 2 Effect of resveratrol on gas production and CH4 emission under different substrates |
两种底物条件下RES对底物营养成分降解率的影响见表 3。随着发酵时间延长，干物质降解率(DMD)、有机物降解率(OMD)、粗蛋白降解率(CPD)、中性洗涤纤维降解率(NDFD)和酸性洗涤纤维降解率(ADFD)均增加。相同底物条件下，在HC中添加RES后各营养成分的均有显著降低(P < 0.05)，在HF中也呈相似趋势；相同RES处理下，HC的各营养成分降解率均显著高于HF(P < 0.05)。同时发现，两因素对发酵12 h CPD和发酵24 h NDFD及ADFD存在交互作用(P < 0.05)。
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表 3 白藜芦醇对不同底物养分降解率的影响 Table 3 Effect of resveratrol on nutrient degradation rate under different substrates |
如表 4，利用QIIME软件对所有微生物样品操作分类单元(OTU)进行菌落多样性指数(Shannon)和丰富度指数(Chao 1、Observed_species)计算。两种底物条件下，相较CON组，添加RES各指标的变化均未达显著水平(P>0.05)；相同RES处理下，HC的各指标的值均显著低于HF(P < 0.05)。说明细菌群落多样性和丰富度差异受RES的影响较小，随发酵底物类型改变而发生明显变化。
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表 4 白藜芦醇对细菌群落物种丰富度和α多样性的影响 Table 4 Effects of resveratrol on species richness and α diversity of bacterial community |
在OTU基础上，利用主成分分析(PCA)观察在发酵两个时间点RES和底物因素对发酵液中细菌群落结构的影响(图 1)。可以发现，在不同的发酵时间，HC和HF的样本都形成了不同的两个大簇，能很好的分离。相同底物下，在HC中添加RES，除了个别样本，CON与RES基本可以形成两个不同的小簇；且相较发酵12 h，在发酵24 h两小簇聚集更加明显，各样本间的距离增加。在HF中HCCON表示高精料底物不添加白藜芦醇；添加RES，CON与RES的各样本有分离的趋势，但并不明显。相较RES因素，不同类型形成样本簇之间的距离更远，分离更加明显。以上结果说明，底物类型和添加RES可以影响菌落的结构。
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HFCON表示高粗料底物不添加白藜芦醇；HCRES表示高精料底物添加白藜芦醇；HFRES表示高粗料底物添加白藜芦醇。A、B两部分依次为发酵第12和24小时产生的结果。下同 HCCON represents high concentrate substrate without resveratrol; HFCON represents high forage substrate without resveratrol; HCRES represents high concentrate substrate supplement with resveratrol; HFRES represents high forage substrate supplement with resveratrol. The two parts A and B in the figure are the results produced at 12 and 24 h of fermentation, respectively. The same as below 图 1 OTUs主成分分析 Fig. 1 Principal component analysis of OTUs |
如图 2，在发酵的两个时间点分析了瘤胃菌群中前5种优势菌门的相对丰度。其中拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、互养菌门(Synergistetes)和变形菌门(Proteobacteria)均为两个发酵时间点共同优势菌群，丰度占总菌群94%以上。在发酵第12小时，相同底物条件下，分别在HC和HF中添加RES，变形菌门丰度均显著升高(P=0.032)。同一RES水平处理下，相较HC，HF中变形菌门显著升高(P < 0.001)，放线菌门显著降低(P=0.001)。另外发现，底物类型和RES在厚壁菌门存在互作效应(P=0.044)，其它变化均未达到显著水平(P>0.05)。在发酵24 h，相同底物条件下，在HC中添加RES导致变形菌门丰度显著升高(P=0.008)；在HF中添加RES添加导致变形菌门显著升高(P=0.002)，互养菌门显著降低(P=0.008)。同一RES水平处理下，相较HC，HF中变形菌门丰度显著升高(P < 0.001)，其它变化均未达到显著水平(P>0.05)。同时发现，随着发酵时间的延长，发酵液中的拟杆菌门丰度降低，而厚壁菌门丰度升高，第5优势菌群由放线菌门变为疣微菌门(Verrucomicrobia)。以上结果说明，发酵时间、底物和RES均对瘤胃微生物菌落结构产生影响。
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图 2 瘤胃液样品中细菌在门水平上的相对丰度 Fig. 2 Relative bacterial abundance in rumen fluid samples at the phylum level |
两个发酵时间点属水平相对丰度排名前15的优势细菌见图 3。对这些优势菌属按细菌门归类后发现，它们均属于前4优势菌门。在两个发酵时间点属水平的前3优势菌属依次为，Prevotella_1(普雷沃氏菌_1)、Quinella和Fretibacterium，三者共占菌落的45%左右；随发酵时间的延长，普雷沃氏菌_1丰度降低，其它两种菌属丰度均升高，此结果与图 2对应门水平丰度变化结果一致。在发酵第12小时，相同底物条件下，在HC中添加RES，普雷沃氏菌_1丰度显著降低(P=0.032)，Succinivibrionaceae_UCG-002和Succinivibrio显著升高(P= 0.032，P=0.008)；在HF添加RES，Rikenellaceae_ RC9_gut_group、Prevotellaceae_NK3B31_group、Christensenellaceae_R-7_group、Succinivibrionaceae_ UCG-002、Ruminobacter和Succinivibrio丰度均显著升高(P < 0.001，P=0.032，P=0.022，P= 0.016，P=0.002，P=0.032)。相较HC，HF中Prevotellaceae_UCG-001、Prevotellaceae_NK3B31_group和Christensenellaceae_R-7_group丰度显著降低(P < 0.001，P < 0.001，P=0.001), Succinivibrionaceae_UCG-002、Ruminobacter和Succinivibrio丰度显著升高(P < 0.001，P=0.001，P < 0.001)。且两因素对Succinivibrio丰度变化存在互作效应(P=0.021)，其它变化均未达到显著水平(P>0.05)。在发酵第24小时，相同底物条件下，在HC中添加RES，Ruminobacter显著升高(P < 0.008)；在HF中添加RES，Prevotella_1、Veillonellaceae_UCG- 001和Lachnospiraceae_XPB1014_ group丰度显著降低(P=0.008，P=0.025，P=0.014)，Prevotellaceae_UCG-001、Phocaeicola、Prevotellaceae_NK3B31_group、Succiniclasticum、Christensenellaceae_R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group和Ruminobacter丰度显著升高(P=0.009，P=0.024，P=0.004，P=0.007，P < 0.001，P=0.030，P=0.008)；且两因素对Prevotella_1、Succiniclasticum、Veillonellaceae_UCG-001和Lachnospiraceae_XPB1014_group的丰度变化存在互作效应(P=0.020，P=0.007，P=0.006，P=0.004)。
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图 3 瘤胃液样品中细菌在属水平上的相对丰度 Fig. 3 Relative bacterial abundance in rumen fluid samples at the genus level |
反刍动物摄入的饲粮主要在瘤胃内由复杂的微生物降解，这个过程中伴随着大量气体的产生，其中包括温室气体CH4。Becker和Van Wikselaar[19]的体外试验和陈丹丹等[9]和Ma等[10]的动物试验均表明，RES可以有效减少CH4排放。本试验得出了相似的结论，在两种底物中添加RES后GP和CH4产量均显著降低。相关酚类植物次级代谢产物的研究中，杨德莲等[20]研究了葡萄籽花青素对底物产气的影响，发现发酵24 h GP和CH4产量均显著降低；邸凌峰等[21]和李晓鹏[22]在底物种添加单宁后也得出相似结论，而且李晓鹏[22]指出，呈现这种结果的原因是酚类化合物具有普遍的抗菌性，影响了瘤胃发酵。
有关试验表明，高精料底物通过瘤胃体外发酵产生了更多的CH4[23-24]，本试验研究也得出了相似结论。其原因可能是以淀粉为主的底物中NFC快速分解促进了瘤胃原虫和其它微生物的繁殖，产生了大量的代谢终产物(H2、CO2、挥发酸等)，为CH4的合成提供了更多的原料。此外，瘤胃发酵产生的CH4产量还与饲料在瘤胃中的停留时间有关[25]，体外试验底物发酵是在一个相对封闭的环境，而动物瘤胃中的食糜是在不断更新和向后肠道移动。饲粮中精料比例升高更有利于瘤胃微生物的降解，加快了食糜的移动速度，这也可以部分解释为什么不同精粗比饲粮在动物试验和体外试验中CH4产生规律不一致。同一RES水平下高精料组GP显著高于低精料组，说明产气量受饲粮中粗纤维比例的影响，这与陈光吉等[26]以及朱智和朱伟云[27]研究结果相似。其原因是纤维素表面覆盖着一层含结构域、糖苷键等复杂结构的纤维素晶体，高NDF含量的底物中表面具有更大面积的纤维素结晶，进而抑制了碳水化合物的降解[28]。
3.2 不同底物条件下RES对底物降解率的影响本试验中，添加RES显著降低了两种底物DM、OM、CP、NDF和ADF降解率。Ma等[10]的研究表明，在肉羊饲粮中添加RES促进了OM、NDF和ADF的表观消化率，造成结果差异的部分原因可能与RES添加水平有关。相较动物试验，体外试验的植物提取物添加剂量可接受范围更大，Meta分析显示，体外试验植物提取物添加剂量范围为0.03~500 g·kg-1[29]。另外，对与RES同属于酚类化合物单宁的研究表明，畜禽肠道中适当的单宁酸可以发挥抗菌、驱虫和抗病毒的作用；反之，高浓度的单宁会降低饲粮的摄入量和养分消化率[30-31]。所以，本试验在Ma等[10]研究的基础上探索了添加高水平RES对瘤胃发酵的影响。另外可能是体内和体外试验的不同产生了差异，Becker和Van Wikselaar[19]的体外研究结果与本研究相似，发现RES在降低CH4排放的同时，也抑制了底物的降解。在有关单宁[32]、葡萄渣[20]等富含酚类物质的体外试验也得出了与本研究相似的结果。其主要原因是，酚类化合物在瘤胃中可以与饲粮蛋白质形成结构复杂的蛋白复合物，甚至酚类物质可以与细菌细胞表面的细胞结合性胞外酶作用[33]，从而普遍降低瘤胃微生物活性，影响CPD。酚类物质虽然抑制了蛋白的降解，但这个过程可以增加过瘤胃蛋白的量，保护饲粮中的优质蛋白进入皱胃和后肠道，因而合理的添加水平有利于饲粮的高效利用[34]。同时本试验发现，相较HC，HF底物条件下各养分的降解率均显著降低，这与陈光吉等[26]研究结果相似。陈光吉等[26]利用体外发酵技术研究了5种不同NFC/NDF在瘤胃环境中的降解，发现各养分的降解率随发酵底物NDF的升高而降低；李岚捷[35]通过研究4种不同NFC/NDF饲粮犊牛消化代谢试验也证明了这一结论。
因此本研究推测，添加高水平的RES通过抑制蛋白质的降解和酶活性，影响瘤胃微生物的活性进而抑制瘤胃发酵。另外，在高精料条件下，降解淀粉的微生物占优势，而在高粗料条件下，分解纤维的微生物占优势，可能是RES对淀粉分解微生物的抑制作用更强，而对纤维素分解菌的抑制作用相对较弱。所以，在两种类型的底物中添加高水平RES各养分降解率降低，作用效果在不同的底物条件下又有一定的差异。
3.3 不同底物条件下RES添加水平对瘤胃微生物区系的影响反刍动物CH4排放量和降解率变化与瘤胃微生物有关，瘤胃微生物群落的变化又受到饲粮营养结构和外源添加剂的直接影响。拟杆菌门和厚壁菌门是已知瘤胃微生物中最重要的两个的优势菌门[36]。在本试验的两种底物中，随发酵时间延长厚壁菌门丰度升高，拟杆菌门丰度相对降低，但是优势地位并未发生改变。拟杆菌门中以普雷沃氏菌_1菌属丰度最高，其主要与饲粮中淀粉和蛋白的降解有关[37]，在本试验发酵的第12和24小时的HC中均发现了较高丰度的普雷沃氏菌_1，也间接证明了这一观点；厚壁菌门则主要包括瘤胃球菌(Ruminococcus)和纤维杆菌(Fibrobacter)等，负责饲粮中纤维类物质的降解[38]。
Patra和Yu[39]的研究发现，当处理组CH4的产生受到抑制后，微生物群落中的互养菌门丰度相应降低，本试验在CH4排放量较低的添加了RES的HF中也发现互养菌门的丰度更低。另外本试验发现，互养菌门丰度随发酵时间延长而升高，这说明互养菌门与发酵后期纤维物质的降解又有一定关系。李彦红[40]通过研究不同产CH4阶段菌群结构的变化，发现互养菌门(Synergistetes)、螺旋菌门(Spirochaetae)、和绿弯菌门(Chloroflexi)均为产CH4阶段的新增菌群。本试验中，在CH4产量较高的HC底物中也观察到了这三个菌门，分别位于第3、8和9优势菌门，而在HF底物中的前10优势菌门中只发现了第5、7优势位的互养菌门(Synergistetes)、螺旋菌门(Spirochaetae)，这可能是HC条件下产生更多CH4的部分原因。同样，我们在HF底物中观察到了更高丰度的产琥珀酸菌(Succinivibrio和 Succinivibrionaceae_UCG-002)，该菌可以捕获瘤胃内的氢从而形成终产物琥珀酸[41]。产甲烷菌在自然界中可以作为一种清除剂，利用微生物产生的代谢产物(包括乙酸、丙酸、甲醇、CO2和H2等)合成CH4，4H2+CO2=CH4+2H2O是其合成的主要途径[42-43]，此过程为瘤胃内维持相对较低的氢分压提供了保证。当瘤胃内产琥珀酸菌丰度升高时，与氢营养型的产甲烷菌形成竞争关系，这也可以部分解释为什么在HF底物中产生了更少的CH4。
通过当前的研究观察到，在两种底物条件下添加RES后，变形菌门均显著升高。尽管与厚壁菌门和拟杆菌门相比，该门的相对丰度要低得多，但它仍然在瘤胃代谢中发挥着重要作用，例如，生物膜的形成和可溶性碳水化合物的消化[44]。李巍伟[45]观察了RES处理的3种革兰阳性葡萄球菌的形态变化，发现在细胞表面产生了多刺状突起、大小不等，导致细胞器结构不清晰，甚至细胞壁破裂，发生细胞质的流失。在其它酚类物质研究中，如牛至油(主要成分为百里酚)显著降低了丁酸纤维丝状杆菌(Butyrivibrio fibrisolvens，革兰阳性细菌)在瘤胃中的丰度[39]。Vasta等[5]也指出，多酚类植物提取物可以抑制降解纤维的革兰阳性纤维分解菌和纤毛虫。本研究结果显示，底物中添加RES显著增加了变形菌门(革兰阴性菌)的丰度，显著降低了高精料条件下厚壁菌门和互养菌门(二者均为革兰阳性菌)的丰度。这与两类菌的细胞壁结构有关，革兰阳性菌的细胞壁中含有较大量的肽聚糖，但缺乏革兰阴性菌所拥有的第二层膜和脂多糖层，所以革兰阳性菌通常被认为更易受外来因素影响[46-47]。普雷沃氏菌_1是瘤胃中广泛存在且数量最多的一类菌属，它不仅是瘤胃中最主要的淀粉和蛋白降解菌，也参与纤维物质降解[48-49]。本试验发现，在高精/粗底物中添加RES导致普雷沃氏菌_1相对丰度均大幅度下降，依次下降了3.91%和6.48%。这可能是导致两种底物各养分降解率降低的直接原因；另外，普雷沃氏菌_1相对丰度大幅下降可能同时产生了补偿效应，进而也解释了为什么HF(发酵24 h)中约2/3优势菌属丰度上升的主要原因。本试验虽然可以通过降解率指标确定RES抑制了普雷沃氏菌_1生长，但是对其它菌属具体的作用还无法确定，可能还需要结合qPCR技术对发酵液中的关键菌属从数量的变化做进一步解释。
4 结论综上所述，在高精/粗底物中添加RES均有效减少了瘤胃环境中产气量和CH4的排放量，而且在高精料条件下显示出了更强的剂量效应。高添加水平的RES抑制了各养分在瘤胃中的降解，这与瘤胃内微生物菌群结构的变化有直接关系。RES在门水平增加了革兰阴性菌(变形菌门)的丰度，降低了革兰阳性菌(互养菌门和纤维杆菌门)的丰度；在属水平主要降低了普雷沃氏菌_1的丰度。因此本研究推测，高水平RES通过抑制普雷沃氏菌_1为代表的淀粉和蛋白降解菌，从而抑制了瘤胃发酵，减少了瘤胃环境中CH4的排放。
| [1] |
王贝.饲粮NDF/NFC对不同泌乳阶段奶牛瘤胃甲烷排放量、营养物质表观消化率及生产性能的影响[D].阿拉尔: 塔里木大学, 2019.
WANG B. Effects of Dietary NDF/NFC on Rumen Methane Emissions, Nutrient Apparent Digestibility and Production Performance of Dairy Cows during Different Lactating Stages[D].Alaer: Tarim University, 2019. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10757-1019150144.htm |
| [2] | PORTER J R, CHALLINOR A J, HENRIKSEN C B, et al. Invited review:intergovernmental panel on climate change, agriculture, and food-a case of shifting cultivation and history[J]. Glob Chang Biol, 2019, 25(8): 2518–2529. DOI: 10.1111/gcb.14700 |
| [3] | MEALE S J, MCALLISTER T A, BEAUCHEMIN K A, et al. Strategies to reduce greenhouse gases from ruminant livestock[J]. Acta Agric Scand Sec A Anim Sci, 2012, 62(4): 199–211. DOI: 10.1080/09064702.2013.770916 |
| [4] | JOHNSON K A, JOHNSON D E. Methane emissions from cattle[J]. J Anim Sci, 1995, 73(8): 2483–2492. |
| [5] | VASTA V, DAGHIO M, CAPPUCCI A, et al. Invited review:plant polyphenols and rumen microbiota responsible for fatty acid biohydrogenation, fiber digestion, and methane emission:experimental evidence and methodological approaches[J]. J Dairy Sci, 2019, 102(5): 3781–3804. |
| [6] | ZHANG Z W, CAO Z J, WANG Y L, et al. Nitrocompounds as potential methanogenic inhibitors in ruminant animals:a review[J]. Anim Feed Sci Technol, 2018, 236: 107–114. DOI: 10.1016/j.anifeedsci.2017.12.010 |
| [7] | WANG H L, GAO J P, HAN Y L, et al. Comparative studies of polydatin and resveratrol on mutual transformation and antioxidative effect in vivo[J]. Phytomedicine, 2015, 22(5): 553–559. |
| [8] | ATHAR M, BACK J H, TANG X W, et al. Resveratrol:a review of preclinical studies for human cancer prevention[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2007, 224(3): 274–283. |
| [9] |
陈丹丹, 马涛, 刁其玉, 等. 桑叶黄酮和白藜芦醇对肉羊气体代谢及甲烷排放的影响[J]. 动物营养学报, 2014, 26(5): 1221–1228.
CHEN D D, MA T, DIAO Q Y, et al. Effects of mulberry leaf flavonoids and resveratrol on gas metabolism and methane emission in mutton Sheep[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2014, 26(5): 1221–1228. (in Chinese) |
| [10] | MA T, CHEN D D, TU Y, et al. Effect of dietary supplementation with resveratrol on nutrient digestibility, methanogenesis and ruminal microbial flora in sheep[J]. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl), 2015, 99(4): 676–683. DOI: 10.1111/jpn.12264 |
| [11] |
李岩, 丁耿芝, 姚倩倩, 等. 活性酵母添加对饲喂不同精粗比日粮肉牛血浆代谢组的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2019, 46(1): 89–100.
LI Y, DING G Z, YAO Q Q, et al. Effect of Saccharomyces cerevisiae on plasma metabolomics of steers fed diets with different concentrate to forage ratios[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2019, 46(1): 89–100. (in Chinese) |
| [12] |
赵臣, 陈志龙, 曾燕霞, 等. 不同精粗比日粮中添加甘露寡糖对绵羊体外消化率的影响[J]. 中国饲料, 2014(20): 25–28.
ZHAO C, CHEN Z L, ZENG Y X, et al. Effects of adding different mannan-oligosaccharide to diets with different ratio of concentration to roughage on in vitro digestibility of sheep[J]. China Feed, 2014(20): 25–28. (in Chinese) |
| [13] | VAN WYNGAARD J D V, MEESKE R, ERASMUS L J. Effect of concentrate level on enteric methane emissions, production performance, and rumen fermentation of Jersey cows grazing kikuyu-dominant pasture during summer[J]. J Dairy Sci, 2018, 101(11): 9954–9966. |
| [14] |
李斌昌, 董利锋, 王贝, 等. 日粮不同精粗比对9月龄后备奶牛甲烷排放与生长性能及营养物质消化率的影响[J]. 饲料工业, 2019, 40(11): 12–18.
LI B C, DONG L F, WANG B, et al. Effects of concentrate-to-forage ratio on methane emissions, growth performance and apparent digestibility of nutrients in 9-month-old dairy cows[J]. Feed Industry, 2019, 40(11): 12–18. (in Chinese) |
| [15] | MENKE K H, STEINGASS H. Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid[J]. Anim Res Dev, 1988, 28: 7–55. |
| [16] |
韩璐璐.体外模拟环境下日粮粗蛋白水平对绵羊瘤胃发酵和养分降解的影响[D].沈阳: 沈阳农业大学, 2016.
HAN L L.Effects of dietary crude protein levels on ruminal fermentation and nutrient degradation of sheep in artificial simulation[D].Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2016.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10157-1016149216.htm |
| [17] |
张丽英.
饲料分析及饲料质量检测技术[M]. 2版.北京: 中国农业大学出版社, 2003.
ZHANG L Y. Feed analysis and quality test technology[M]. 2nd ed.Beijing: China Agricultural University Press, 2003. (in Chinese) |
| [18] |
刘洁.肉用绵羊饲料代谢能与代谢蛋白质预测模型的研究[D].北京: 中国农业科学院, 2012.
LIU J.Prediction of metabolizable energy and metabolizable protein in feeds for meat sheep[D].Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2012.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-82101-1012415986.htm |
| [19] | BECKER P M, VAN WIKSELAAR P G. Effects of plant antioxidants and natural vicinal diketones on methane production, studied in vitro with rumen fluid and a polylactate as maintenance substrate[J]. Anim Feed Sci Technol, 2011, 170(3-4): 201–208. |
| [20] |
杨德莲, 童津津, 张婕, 等. 葡萄籽原花青素对奶牛瘤胃体外发酵参数及微生物区系的影响[J]. 动物营养学报, 2018, 30(2): 717–725.
YANG D L, TONG J J, ZHANG J, et al. Effects of grape seed procyanidine on rumen fermentation parameters and microflora of dairy cows in vitro[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2018, 30(2): 717–725. (in Chinese) |
| [21] |
邸凌峰, 曹雪, 秦炜赜, 等. 两种含单宁饲草对反刍动物应用的价值研究[J]. 饲料工业, 2017, 38(7): 43–50.
DI L F, CAO X, QIN W Z, et al. The research of two kinds of forage containing tannin for the application value of ruminants[J]. Feed Industry, 2017, 38(7): 43–50. (in Chinese) |
| [22] |
李晓鹏.缩合单宁对体外发酵特性的影响[D].兰州: 甘肃农业大学, 2009.
LI X P.Effect of condensed tannins on in vitro rumen fermentation parameters[D].Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2009.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10733-2009253153.htm |
| [23] | LEE S Y, YANG S H, LEE W S, et al. Effect of 2-bromoethanesulfonic acid on in vitro fermentation characteristics and methanogen population[J]. Asian Australas J Anim Sci, 2009, 22(1): 42–48. |
| [24] | SAKTHIVEL P C, KAMRA D N, AGARWAL N, et al. Effect of sodium nitrate and nitrate reducing bacteria on in vitro methane production and fermentation with buffalo rumen liquor[J]. Asian Australas J Anim Sci, 2012, 25(6): 812–817. |
| [25] |
李朝云.壳聚糖与纤维素酶对瘤胃发酵、甲烷产生及微生物区系的影响[D].咸阳: 西北农林科技大学, 2014.
LI C Y.Effects of chitosan and exogenous fibrolytic enzymes on in vitro ruminal fermentation, methane production and microorganism populations[D].Xianyang: Northwest A & F University, 2014.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-1014421077.htm |
| [26] |
陈光吉, 宋善丹, 彭忠利, 等. 体外产气法研究不同NFC/NDF底物条件下外源纤维素酶的适宜添加水平[J]. 草业学报, 2017, 26(7): 116–127.
CHEN G J, SONG S D, PENG Z L, et al. Determination of appropriate levels of exogenous fibrolytic enzyme supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrate/neutral detergent fiber ratios based on in vitro gas production[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 116–127. (in Chinese) |
| [27] |
朱智, 朱伟云. 不同精粗比底物时添加大蒜油对体外瘤胃微生物发酵的影响[J]. 南京农业大学学报, 2012, 35(2): 125–130.
ZHU Z, ZHU W Y. Effects of garlic oil on in vitro fermentation by microorganisms from goat rumen under substrates with different ratios of forage to concentrate[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2012, 35(2): 125–130. (in Chinese) |
| [28] | KLYOSOV A A. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation[J]. Biochemistry, 1990, 29(47): 10577–10585. |
| [29] | KLEVENHUSEN F, MURO-REYES A, KHIAOSA-ARD R, et al. A meta-analysis of effects of chemical composition of incubated diet and bioactive compounds on in vitro ruminal fermentation[J]. Anim Feed Sci Technol, 2012, 176(1-4): 61–69. |
| [30] | JAYANEGARA A, GOEL G, MAKKAR H P S, et al. Divergence between purified hydrolysable and condensed tannin effects on methane emission, rumen fermentation and microbial population in vitro[J]. Anim Feed Sci Technol, 2015, 209: 60–68. |
| [31] |
刘汉锁, 龙沈飞, 尚庆辉, 等. 水解单宁酸的作用机制及其在畜禽生产中的应用进展[J]. 动物营养学报, 2019, 31(9): 3991–3999.
LIU H S, LONG S F, SHANG Q H, et al. Mechanism of action hydrolyzed tannic acid and its application in livestock and poultry production[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(9): 3991–3999. (in Chinese) |
| [32] |
徐晓锋.缩合单宁与水解单宁对奶牛日粮氮利用影响及作用机制的研究[D].北京: 中国农业大学, 2013.
XU X F.Study on mechanism of nitrogen utilization in diet of dairy cows with condensed and hydrolyzable tannins addition[D].Beijing: China Agricultural University, 2013.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10019-1014111749.htm |
| [33] | HIERHOLTZER A, CHATELLARD L, KIERANS M, et al. The impact and mode of action of phenolic compounds extracted from brown seaweed on mixed anaerobic microbial cultures[J]. J Appl Microbiol, 2013, 114(4): 964–973. DOI: 10.1111/jam.12114 |
| [34] |
吕忠蕾, 李成云. 不同分子量缩合单宁对延边黄牛营养物质的消化代谢和血液指标的影响[J]. 饲料工业, 2013, 34(21): 56–59.
LV Z L, LI C Y. Effects of condensed tannins of different molecular weights on nutrient digestion and metabolism and blood indexes of Yanbian yellow cattle[J]. Feed Industry, 2013, 34(21): 56–59. (in Chinese) |
| [35] |
李岚捷.不同NFC/NDF水平日粮对公犊牛生产性能、瘤胃发育及微生物区系的影响[D].兰州: 甘肃农业大学, 2017.
LI L J.Effects of diets with different NFC/NDF levels on the production performance, rumen development and microbial flora of male calves[D].Lanzhou: Gansu Agricultural Universitym, 2017.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10733-1017824980.htm |
| [36] | DE OLIVEIRA M N V, JEWELL K A, FREITAS F S, et al. Characterizing the microbiota across the gastrointestinal tract of a Brazilian Nelore steer[J]. Vet Microbiol, 2013, 164(3-4): 307–314. |
| [37] | WANG Y Y, CAO P H, WANG L, et al. Bacterial community diversity associated with different levels of dietary nutrition in the rumen of sheep[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2017, 101(9): 3717–3728. |
| [38] | EVANS N J, BROWN J M, MURRAY R D, et al. Characterization of novel bovine gastrointestinal tract Treponema isolates and comparison with bovine digital dermatitis treponemes[J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(1): 138–147. |
| [39] | PATRA A K, YU Z T. Essential oils affect populations of some rumen bacteria in vitro as revealed by microarray (RumenBactArray) analysis[J]. Front Microbiol, 2015, 6: 297. |
| [40] |
李彦红.牲畜粪便暗发酵产氢-产甲烷过程中参数优化及其微生物群落特性[D].郑州: 郑州大学, 2016.
LI Y H.Parameter optimization and characteristics of microbial community in two-stage process integrating hydrogen fermentation and anaerobic digestion from fresh livestock dung[D].Zhengzhou: Zhengzhou University, 2016.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10459-1016175556.htm |
| [41] | WALLACE R J, ROOKE J A, MCKAIN N. The rumen microbial metagenome associated with high methane production in cattle[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1): 839. DOI: 10.1186/s12864-015-2032-0 |
| [42] | MARTIN C, MORGAVI D P, DOREAU M. Methane mitigation in ruminants: from microbe to the farm scale[J]. Animal, 2010, 4(3): 351–365. DOI: 10.1017/S1751731109990620 |
| [43] | MURRAY R M, BRYANT A M, LENG R A. Rates of production of methane in the rumen and large intestine of sheep[J]. Br J Nutr, 1976, 36(1): 1–14. |
| [44] | PITTA D W, PINCHAK W E, INDUGU N, et al. Metagenomic analysis of the rumen microbiome of steers with wheat-induced frothy bloat[J]. Front Microbiol, 2016, 7: 689. DOI: 10.3389/fmicb.2016.00689 |
| [45] |
李巍伟.白藜芦醇抑菌作用及其机制研究[D].石家庄: 河北医科大学, 2008.
LI W W.Antimicrobial effect of resveratrol and the mechanism research[D].Shijiazhuang: Hebei Medical University, 2008.(in Chinese) http://med.wanfangdata.com.cn/Paper/Detail?id=DegreePaper_Y1354602 |
| [46] | DORMAN H J D, DEANS S G. Antimicrobial agents from plants:antibacterial activity of plant volatile oils[J]. J Appl Microbiol, 2000, 88(2): 308–316. |
| [47] | BURT S A. Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods-a review[J]. Int J Food Microbiol, 2004, 94(3): 223–253. |
| [48] | MATSUI H, OGATA K, TAJIMA K, et al. Phenotypic characterization of polysaccharidases produced by four Prevotella type strains[J]. Curr Microbiol, 2000, 41(1): 45–49. |
| [49] |
田雨佳.苜蓿干草与苜蓿青贮对奶牛瘤胃蛋白质利用的影响及作用机制的研究[D].北京: 中国农业大学, 2014.
TIAN Y J.Study on mechanism of nitrogen utilization in rumen of dairy cows with alfalfa as hay or silage[D].Beijing: China Agricultural University, 2014.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10019-1014225964.htm |