2. 云南省畜牧兽医科学院, 昆明 650224
, ZHANG Peipei1, HAO Haisheng1, DU Weihua1, PANG Yunwei1, QUAN Guobo2, ZHAO Shanjiang1, ZOU Huiying1, ZHU Huabin1, ZHAO Xueming1
2. Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China
体外受精(in vitro fertilization, IVF)技术及体外生产胚胎技术是第三次家畜繁殖领域革命，宣告哺乳动物体外胚胎生产技术的开始，胚胎体外生产技术距今已有一百多年的历史[1]。胚胎工程技术的迅速发展要求有大量可用于研究的动物胚胎，体外胚胎生产技术作为一种效率高、成本低、数量大的胚胎生产方式，可有效满足这种需求[2]。1982年首次牛体外受精试验获得成功，牛体外胚胎生产技术主要应用于动物育种、胚胎克隆、转基因等生物技术，对生物科学、农学、医学科学等有重要意义[3]。但是，牛体外胚胎的质量仍低于体内胚胎，出现了牛新鲜卵母细胞IVF胚胎移植妊娠率低(约40.1%)、流产率高(约72%)、产犊率低(约27.1%)[4]等问题，且冷冻卵母细胞IVF胚胎发育能力更低，这些都亟待解决。
为探讨体内、外胚胎差异如此之大的原因，研究人员开始在基因转录层面寻求答案。1996年，Wrenzycki等[5]使用RT-PCR技术在牛体内产生的囊胚中检测到连接蛋白43(Cx43) mRNA的存在，而在体外囊胚中却未检测到。2012年，Driver等[6]使用RNA-sequencing比较体内、外牛囊胚的转录组差异，17 634个基因中有793个基因在两种胚胎之间差异表达。随着转录组测序技术的快速发展，Tang等[7]首次开发出了单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)。因具有样品需求量少、灵敏度高等优点，此技术已广泛应用于研究哺乳动物生殖细胞转录组[8]。
然而，关于长链非编码(lncRNA)和环状RNA(circRNA)的研究仍较少。lncRNA是长度不超过200单位的核苷酸[9-10]，涉及转录、转录后、翻译和表观遗传调控以及干细胞的维持和诱导[11-12]。circRNA是近几年在真核细胞中发现的polyA-RNA[13]，可能参与染色体组织、细胞周期调控和DNA修复[14-15]。随着lncRNA、circRNA研究日趋深入，2014年Saliba等[16]首次开发出单细胞全转录组测序技术，该技术将细胞的全部RNA分子转化为cDNA，它可以单核苷酸分辨率覆盖整个转录组，有助于理解基因的结构和非编码区输出的复杂性[17]。然而，目前关于牛体内胚胎全转录组的研究报道较少。
因此，本试验采用单细胞全转录组测序技术对体内囊胚全转录组模式进行研究，旨在初步探明牛体内囊胚中mRNA、lncRNA、circRNA的表达规律，进而为全面揭示牛体内囊胚发育调控网络奠定生物信息学基础。
1 材料与方法 1.1 试剂和仪器本试验中除特殊说明外所有试剂均购于美国Sigma公司。精液购自山东奥克斯畜牧种业有限公司。
1.2 牛体内囊胚的采集1.2.1 选择母牛及饲养管理 选择15月龄以上，生殖道和卵巢机能正常，没有疾病，体况良好的1~3胎、产后60~120 d的泌乳奶牛。在日常管理中，保证日粮营养均衡，减少应激，饲养环境干净舒适[18]。母牛选择标准及其饲养管理见表 1。
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表 1 母牛选择标准及其饲养管理 Table 1 Selection criteria and feeding management |
1.2.2 母牛的同期发情及超数排卵 本试验中，同期发情采用了阴道埋植法，为了使孕酮缓慢持续地释放从而达到更好的效果，将孕酮置于某介质上放入母牛阴道，约7~9 d时将孕酮撤除，母牛发情多发生于孕酮撤除后的2~4 d。
在生产实践中，使用外源促性腺激素有助于母牛卵泡的发育和成熟，并促进排卵。因为促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)在牛体内的半衰期为5 h，为维持血液中FSH的浓度，本试验中，大约每间隔12 h注射1次4 mL的FSH，并连续注射4 d以达到母牛超数排卵的目的。母牛超数排卵注射FSH及前列腺素(prostaglandin, PG)剂量(每头)见表 2。
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表 2 母牛超数排卵注射FSH及PG剂量(每头) Table 2 FSH and PG doses (per cow) injected for superovulation in cows |
1.2.3 观察发情和人工授精 在试验过程中，母牛的发情情况采用人工观察法来判断，发情开始时间以母牛接受爬跨为准。发情后采用人工授精的方法进行配种，本试验于发情后的10~12 h以及20~24 h各人工授精1次来确保卵子受精成功。
1.2.4 采集胚胎 本试验在母牛发情后的第7天，使用冲胚来进行胚胎采集，并使用“非手术采胚法”采集胚胎。为了将胚胎从母牛子宫角冲出，本试验采用了直肠把握法，使用气囊固定冲卵管使其通过子宫颈到达子宫角，用冲卵液反复冲洗子宫。
1.2.5 收集样品 在显微镜下将体内生产的囊胚放入DPBS溶液中，并加入5 mg·mL-1的链霉蛋白酶，作用2~3 min，用DPBS清洗去透明带后完整的囊胚，清洗2遍，裂解缓冲液中放入质量最好的囊胚，在此过程中要尽量少携带液体，将样品置于－80 ℃环境中保存备用。
1.3 单细胞全转录组测序将收集到的3个体内囊胚样品(Invivo_1、Invivo_2、Invivo_3)放于干冰，送北京安诺优达基因科技有限公司进行单细胞全转录组测序检测。以每组样品为起始进行建库，使用最新的ANsuper-seq技术对单细胞转录本实现反转录和扩增。使用引物进行逆转录反应合成一链cDNA，同时扩增polyA+和polyA-模板RNA。在一链cDNA末端延伸合成polyA尾，以此结合引物合成二链cDNA。其后，进行PCR扩增得到最终产物cDNA。使用产物cDNA进行高通量测序文库构建，经过超声打断、末端修复、3′端加A、加测序接头、片段选择、PCR扩增等步骤，得到最终文库。基于最新的SUPeR-seq技术对单细胞转录本实现反转录和扩增。SUPeR-seq技术对于polyA+和polyA-模板RNA均能进行扩增，包括mRNA、lncRNA、circRNA，能够全面反映样本中各类型RNA状况[14]。
1.4 生物学信息学分析使用基因本体(gene ontology，GO)分析可挖掘出相关的生物学过程。GO分析分为3个Ontology：生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)是破译基因组方面及有关通路的主要公共数据库，通路显著性富集分析以KEGG通路为单位，找出与整个基因组背景相比，在体内胚胎基因中显著富集的通路。
2 结果 2.1 牛体内囊胚mRNAs测序结果分析2.1.1 mRNAs数据过滤和数据比对统计 表 3列举了本试验中体内囊胚3个样品mRNAs数据过滤和数据比对情况。经统计，mRNAs的数据过滤后Q30分别为94.25%、93.92%、94.37%；过滤后序列数目分别达到148 875 636、121 860 036、161 033 370个。过滤后序列数目占原始序列的平均比例分别为87.66%、80.18%、95.46%。同时，体内囊胚过滤后比对到基因组上的数目占过滤后序列数目的百分比分别为95.84%、95.90%、95.71%。
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表 3 mRNAs数据过滤和数据比对统计结果 Table 3 Statistical results of Clean Reads and Mapped Reads in mRNAs |
2.1.2 mRNA表达 如表 4所示，在3个样品中均表达的基因表达量最高的10个基因包括：环氧合酶COX (COX1、COX3)、NADH脱氢酶(ND4、ND5、ND6、ND2)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP6)、Podoplanin(PDPN)、小核仁RNA (small nucleolar RNA C/D box 47，SNORD47)和细胞色素b(cytb)。
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表 4 样品中表达的mRNAs Table 4 mRNAs expressed in sample |
2.1.3 mRNAs可变剪切类型 如表 5所示，3个样品mRNAs包含了12种类型的可变剪切方法，即XAE、XIR、TTS、XMIR、XMSKIP、IR、XSKIP、SKIP、AE、TSS、MIR和MSKIP。XAE是边界模糊型5′或3′端可变剪切；XIR是边界模糊型单内含子保留；TTS(transcription terminal site)是转录结束区域可变剪切；XMIR是边界模糊型多内含子保留；XMSKIP是边界模糊型多外显子跳跃；IR是单内含子保留；XSKIP是边界模糊型单外显子跳跃；SKIP是单外显子跳跃；AE是可变5′或3′端剪切；TSS是转录起始区域可变剪切；MIR是多内含子保留；MSKIP是多外显子跳跃。这些事件在可变剪切事件平均数量分别为667、353、25 517、41、255、1 321、1 337、1 930、903、26 508、155、260个。
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表 5 mRNA可变剪切方式统计 Table 5 Statistics of the mRNA alternative splicing types |
2.1.4 GO分析 如图 1所示，对mRNA进行GO分析发现，生物过程主要富集于新陈代谢、生物调节、细胞刺激反应、细胞通讯、细胞组织成分、生长发育；细胞组分主要富集于细胞膜、细胞核、细胞连接复合物、细胞质、细胞骨架、囊泡、高尔基体等；分子功能主要富集于蛋白结合、离子结合、核酸结合调节因子、水解酶活性、转移酶活性、酶调节激活等。
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图 1 GO富集条形图 Fig. 1 GO enrichment bar chart |
2.1.5 PATHWAY分析 KEGG富集条形图是KEGG富集分析结果的图形化展示方式，选取富集最显著的20个KEGG通路条目进行展示(图 2)。纵轴表示通路名称，横轴表示通路对应的Rich Ratio，每个通路下包含的基因的多少由柱形图的长短表示。如图 2所示，富集通路主要有细胞周期(细胞周期变化、细胞分化、细胞周期、有丝分裂核分裂、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸)、膜运输(膜运输、运输)、染色体组织调控等过程。
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图 2 KEGG富集条形图 Fig. 2 KEGG enrichment bar chart |
2.2.1 lncRNAs数据过滤和数据比对统计 表 6列举了本试验中3个样品lncRNAs的数据过滤和比对情况。经统计，lncRNA的数据过滤后读数分别为148 875 636、121 860 036、161 033 370个，过滤后Q30的比例分别94.25%、93.92%、94.37%。其中获得的未知的lncRNAs在3个样品中平均数量为10 576个。
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表 6 lncRNAs数据过滤和数据比对统计结果 Table 6 Statistical results of Clean Reads and Mapped Reads in lncRNAs |
2.2.2 Novel lncRNAs的数目 如图 3所示，对CNCI(coding-non-coding index)、CPC(coding potential calculator)、PFAM蛋白结构域分析、CPAT(coding potential assessment tool)4种预测方法识别出的non-coding转录本进行统计，以维恩图方式展示各个方法的特有和共有数目，可以预测牛体内囊胚的novel lncRNAs数量为20 265个。
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图 3 4种方法预测结果维恩图展示 Fig. 3 Venn diagram showing prediction results by 4 methods |
2.3.1 circRNAs数据过滤和数据比对统计 表 7列举了本试验中牛体内囊胚3个样品circRNAs数据过滤和数据比对情况。经统计，circRNAs的数据过滤后Q30分别为94.25%、93.92%、94.37%；过滤后序列数目分别达到148 875 636、121 860 036、161 033 370个。过滤后序列数目占原始序列的平均比例分别为87.66%、80.18%、95.46%。试验中，体内囊胚circRNA过滤后比对到参考基因组上的比率均为99.99%。
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表 7 circRNAs数据过滤和数据比对统计结果 Table 7 Statistical results of Clean Reads and Mapped Reads in circRNAs |
2.3.2 circRNAs的类型 表 8显示了circRNAs的6种类型，即CLASSIC、ALTER_EXON、INTRON、OVERLAP_EXON、ANTISENSE、INTERGENIC，CLASSIC表示环状RNA的形成位点正好都在外显子的边界上；ALTER_EXON表示环状RNA的形成位点一端在外显子边界上，另一端在外显子内部；INTRON表示环状RNA的形成位点都在内含子区域；OVERLAP_EXON表示环状RNA的形成位点跨越了外显子区域；ANTISENSE表示环状RNA由基因的反义链形成；INTERGENIC表示环状RNA的形成位点都在基因间区。RNA的形成位点都在内含子区域它们的平均数目分别是173、30、11、62、15、37个。
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表 8 circRNA类型统计 Table 8 The statistics of circRNA types |
近年来，有许多方法发展和应用于全转录组测序分析，本试验采用的全转录组单细胞测序技术对于polyA+和polyA-模板RNA均能进行扩增，包括mRNA、lncRNA、circRNA，能够全面反映样本中各类型RNA状况。目前，该技术已成功应用于单细胞全转录组检测[14]。
如表 3所示，体内囊胚样品获得测序数据的Q30平均值为94.18%，mRNA和lncRNA使用bcl2fastq软件计算比对率为95.82%，circRNA使用CASAVA软件计算比对率为99.99%。上述这些数据表明，本试验样品测序质量良好，可以利用过滤后序列数据进行后续分析。
使用单细胞全转录组测序技术在一个牛体内囊胚和3个囊胚中可鉴定的mRNAs分别为20 424、19 975个，高于Chitwood等[19]采用RNA-seq技术检测到的11 501和8 630个，这主要是因为单细胞全转录组测序技术在单细胞中检测到的基因表达准确性高于其他RNA-seq方法[14]。如表 4、5所示，牛体内囊胚中基因表达量较高的mRNA主要集中在环氧合酶COX家族(COX1、COX3)、NADH脱氢酶家族(ND4、ND5、ND6、ND2)、ATP家族(ATP6)。COX的时期特异性表达可能与囊胚孵化及胚胎着床等过程相关[20]，ATP6的表达水平可用于评估卵母细胞的质量[21]，而NADH脱氢酶对胎盘细胞的存活和成功妊娠都很重要[22]。
可变剪切(alternative splicing)是一个基因的mRNA前体经过不同的剪接方式或者不同的剪接位点产生多种mRNA剪切异构体的过程[22]，它将基因组指令转变为功能蛋白，在基因表达调节中起着关键作用[23]。Driver等[6]检测到牛体内外胚胎大量基因的差异可变剪切，表明RNA的差异加工与胚胎发育的调控有关。采用常规测序表明，人类基因组中最普遍的可变剪切是外显子跳跃[24]。然而，本试验(表 5)和Jin等[25]采用单细胞测序结果均表明，转录起始区域可变剪切(TSS)是主要可变剪切。造成上述差异的原因主要是单细胞全转录组技术可以生成更多的序列数据，从而可以对选择性剪接进行全转录组分析[26]。TSS会对翻译效率产生巨大影响[27], 同时和其周围的SNPs可能对起始位点识别效率以及翻译机制产生很大影响[28]。
lncRNA在非编码RNA中占比最大，它们中约有17%保持在细胞核内，而约4%在细胞质中富集[29]。现已鉴定出多种不同类型的lncRNA，其中最显著的是基因间lncRNA(lincRNA)、内含子lncRNA、天然反义转录物(NAT)[30-31]。lncRNA参与了许多细胞生物学过程，包括细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡、X染色体失活、基因印迹和干细胞转化[32-33]。本试验使用CNCI(coding-non-coding index)、CPC(coding potential calculator)、PFAM蛋白结构域分析、CPAT(coding potential assessment tool)4种预测方法预测到牛体内囊胚中novel lncRNAs为20 265个。在所有样品中共获得12 715个novel lncRNAs，其中包括7 955个linc-RNAs，2 944个intronic RNAs，1 816个antisense RNAs。
circRNA有多种类型，不同类型的circRNA有不同的作用。ecircRNA是成环的外显子circRNA[34]，ciRNA是内含子cirRNA[35]，elciRNA是外显子-内含子circRNA。ecircRNA主要在细胞核内加工形成，作为竞争性内源RNA吸附miRNA分子(miRNA sponge)[36-37]，也可以与RNA结合蛋白(RBP)相结合[38]。ciRNA因其结构特异性而有高度保守性[39]。eiciRNA促进其亲本基因的转录，这可能主要是通过特定RNA-RNA相互作用来起作用的[39]。本试验检测了6种类型的circRNAs，其中CLASSIC类型占52.78%，ALTER_EXON占9.24%，INTRON占3.36%，OVERLAP_EXON占19.00%，ANTISENSE占4.45%，INTERGENIC占11.17%。CLASSIC类型是指circRNA的形成位点正好都在外显子的边界上，这种剪切方式会形成的ecircRNA，这种类型circRNA必须迁移到细胞质中才能发挥其调节作用[33]。INTRON类型是指circRNA的形成位点都在内含子区域，这种剪切方式会形成ciRNA，ciRNA在2013年人类细胞中被发现主要存在于细胞核中，并参与其亲本基因的转录调控[40]。研究结果表明，牛体内囊胚中circRNA以CLASSIC类型为主，这有助于揭示circRNA在牛囊胚中的作用区域和机理。
4 结论本研究采用单细胞全转录组测序技术发现，牛囊胚中存在19 975个mRNAs、887个circRNAs，预测novel lncRNAs为20 625个。本研究阐明了体内囊胚的转录组模式，为全面了解牛体内囊胚提供了新思路。
| [1] |
侯银仙. 牛体外胚胎生产技术研究进展[J]. 畜牧兽医科技信息, 2013(9): 8–10.
HOU Y X. Research progress of bovine in vitro embryo production technology[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2013(9): 8–10. DOI: 10.3969/J.ISSN.1671-6027.2013.09.004 (in Chinese) |
| [2] | MANDAWALA A A, HARVEY S C, ROY T K, et al. Cryopreservation of animal oocytes and embryos:current progress and future prospects[J]. Theriogenology, 2016, 86(7): 1637–1644. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2016.07.018 |
| [3] | BEACKETT B G, BOUSQUET D, BOICE M L, et al. Normal development following in vitro fertilization in the cow[J]. Biol Reprod, 1982, 27: 147–258. DOI: 10.1095/biolreprod27.1.147 |
| [4] | EALY A D, WOOLDRIDGE L K, MCCOSKI S R. BOARD INVITED REVIEW:Post-transfer consequences of in vitro-produced embryos in cattle[J]. J Anim Sci, 2019, 97(6): 2555–2568. DOI: 10.1093/jas/skz116 |
| [5] | WRENZYCKI C, HERRMANN D, CARNWATH J W, et al. Expression of the gap junction gene connexin43(Cx43) in preimplantation bovine embryos derived in vitro or in vivo[J]. Reproduction, 1996, 108(1): 17–24. DOI: 10.1530/jrf.0.1080017 |
| [6] | DRIVER A M, PEÑAGARICANO F, HUANG W, et al. RNA-Seq analysis uncovers transcriptomic variations between morphologically similar in vivo- and in vitro-derived bovine blastocysts[J]. BMC Genomics, 2012, 13: 118. DOI: 10.1186/1471-2164-13-118 |
| [7] | TANG F C, BARBACIORU C, WANG Y Z, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell[J]. Nat Methods, 2009, 6(5): 377–382. DOI: 10.1038/nmeth.1315 |
| [8] | SOOD T J, LAGAH S V, MUKESH M, et al. RNA sequencing and transcriptome analysis of buffalo (Bubalus bubalis) blastocysts produced by somatic cell nuclear transfer and in vitro fertilization[J]. Mol Reprod Dev, 2019, 86(9): 1149–1167. DOI: 10.1002/mrd.23233 |
| [9] | MARQUES A C, PONTING C P. Intergenic lncRNAs and the evolution of gene expression[J]. Curr Opin Genet Dev, 2014, 27: 48–53. DOI: 10.1016/j.gde.2014.03.009 |
| [10] | XU Y Y, QI X L, HU M Y, et al. Transcriptome analysis of adipose tissue indicates that the cAMP signaling pathway affects the feed efficiency of pigs[J]. Genes, 2018, 9(7): 336. DOI: 10.3390/genes9070336 |
| [11] |
宋尚桥, 马围围, 张超龙, 等. 基于转录组测序生物信息学分析的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(2): 392–398.
SONG S Q, MA W W, ZHANG C L, et al. Advances in bioinformatics analysis based on transcriptome sequencing[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2020, 47(2): 392–398. (in Chinese) |
| [12] | NG S Y, STANTON L W. Long non-coding RNAs in stem cell pluripotency[J]. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2013, 4(1): 121–128. DOI: 10.1002/wrna.1146 |
| [13] | JECK W R, SHARPLESS N E. Detecting and characterizing circular RNAs[J]. Nat Biotechnol, 2014, 32(5): 453–461. DOI: 10.1038/nbt.2890 |
| [14] | FAN X Y, ZHANG X N, WU X L, et al. Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos[J]. Genome Biol, 2015, 16(1): 148. |
| [15] | SONG Y X, ZHANG L, LIU X R, et al. Analyses of circRNA profiling during the development from pre-receptive to receptive phases in the goat endometrium[J]. J Anim Sci Biotechnol, 2019, 10: 34. DOI: 10.1186/s40104-019-0339-4 |
| [16] | SALIBA A E, WESTERMANN A J, GORSKI S A, et al. Single-cell RNA-seq:advances and future challenges[J]. Nucl Acids Res, 2014, 42(14): 8845–8860. DOI: 10.1093/nar/gku555 |
| [17] | DJEBALI S, DAVIS C A, MERKEL A, et al. Landscape of transcription in human cells[J]. Nature, 2012, 489(7414): 101–108. DOI: 10.1038/nature11233 |
| [18] |
郝海生, 程小强, 穆秋玲.
图说奶牛繁殖技术与繁殖管理[M]. 北京: 化学工业出版社, 2016.
HAO H S, CHENG X Q, MU Q L. Cow breeding technology and breeding management[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2016. (in Chinese) |
| [19] | CHITWOOD J L, RINCON G, KAISER G G, et al. RNA-seq analysis of single bovine blastocysts[J]. BMC Genomics, 2013, 14: 350. DOI: 10.1186/1471-2164-14-350 |
| [20] |
滕春波, 徐立滨, 李世杰, 等. 环氧合酶-1和环氧合酶-2在兔早期妊娠子宫内膜及早期胚胎中的表达[J]. 中国兽医学报, 2003, 23(5): 499–502.
TENG C B, XU L B, LI S J, et al. Expression of cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 in rabbit endometrium during early pregnancy and in early stage embryos[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2003, 23(5): 499–502. DOI: 10.3969/j.issn.1005-4545.2003.05.030 (in Chinese) |
| [21] | ZHAO X M, MIN J T, DU W H, et al. Melatonin enhances the in vitro maturation and developmental potential of bovine oocytes denuded of the cumulus oophorus[J]. Zygote, 2015, 23(4): 525–536. DOI: 10.1017/S0967199414000161 |
| [22] | BROADY A J, LOICHINGER M H, AHN H J, et al. Protective proteins and telomere length in placentas from patients with pre-eclampsia in the last trimester of gestation[J]. Placenta, 2017, 50: 44–52. DOI: 10.1016/j.placenta.2016.12.018 |
| [23] | TIAN G G, LI J, WU J. Alternative splicing signatures in preimplantation embryo development[J]. Cell Biol, 2020, 10: 33. DOI: 10.1186/s13578-020-00399-y |
| [24] | SULTAN M, SCHULZ M H, RICHARD H, et al. A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome[J]. Science, 2008, 321(5891): 956–960. DOI: 10.1126/science.1160342 |
| [25] | JIN S L, SU H R, TRAN N T, et al. Splicing factor SF3B1K700E mutant dysregulates erythroid differentiation via aberrant alternative splicing of transcription factor TAL1[J]. PLoS One, 2017, 12(5): e0175523. DOI: 10.1371/journal.pone.0175523 |
| [26] | CHACKO E, RANGANATHAN S. Genome-wide analysis of alternative splicing in cow:implications in bovine as a model for human diseases[J]. BMC Genomics, 2009, 10(S3): S11. |
| [27] | NODERER W L, FLOCKHART R J, BHADUR A, et al. Quantitative analysis of mammalian translation initiation sites by FACS-seq[J]. Mol Syst Biol, 2014, 10(8): 748. DOI: 10.15252/msb.20145136 |
| [28] | NEININGER K, MARSCHALL T, HELMS V. SNP and indel frequencies at transcription start sites and at canonical and alternative translation initiation sites in the human genome[J]. PLoS One, 2019, 14(4): e0214816. DOI: 10.1371/journal.pone.0214816 |
| [29] | DERRIEN T, JOHNSON R, BUSSOTTI G, et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs:analysis of their gene structure, evolution, and expression[J]. Genome Res, 2012, 22(9): 1775–1789. DOI: 10.1101/gr.132159.111 |
| [30] | LAPIDOT M, PILPEL Y. Genome-wide natural antisense transcription:coupling its regulation to its different regulatory mechanisms[J]. EMBO Rep, 2006, 7(12): 1216–1222. DOI: 10.1038/sj.embor.7400857 |
| [31] | HUANG W, KHATIB H. Comparison of transcriptomic landscapes of bovine embryos using RNA-Seq[J]. BMC Genomics, 2010, 11: 711. DOI: 10.1186/1471-2164-11-711 |
| [32] | EIßMANN M, GUTSCHNER T, HÄMMERLE M, et al. Loss of the abundant nuclear non-coding RNA MALAT1 is compatible with life and development[J]. RNA Biol, 2012, 9(8): 1076–1087. DOI: 10.4161/rna.21089 |
| [33] | SARANGDHAR M A, CHAUBEY D, SRIKAKULAM N, et al. Parentally inherited long non-coding RNA Cyrano is involved in zebrafish neurodevelopment[J]. Nucleic Acids Res, 2018, 46(18): 9726–9735. DOI: 10.1093/nar/gky628 |
| [34] | SANGER H L, KLOTZ G, RIESNER D, et al. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1976, 73(11): 3852–3856. DOI: 10.1073/pnas.73.11.3852 |
| [35] | ZHANG Y, ZHANG X O, CHEN T, et al. Circular intronic long noncoding RNAs[J]. Mol Cell, 2013, 51(6): 792–806. DOI: 10.1016/j.molcel.2013.08.017 |
| [36] | MEMCZAK S, JENS M, ELEFSINIOTI A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency[J]. Nature, 2013, 495(7441): 333–338. DOI: 10.1038/nature11928 |
| [37] | MA Z, ZHAO H S, ZHANG Y, et al. Novel circular RNA expression in the cumulus cells of patients with polycystic ovary syndrome[J]. Arch Gynecol Obstet, 2019, 299(6): 1715–1725. DOI: 10.1007/s00404-019-05122-y |
| [38] | LI Y, ZHENG Q P, BAO C Y, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes:a promising biomarker for cancer diagnosis[J]. Cell Res, 2015, 25(8): 981–984. DOI: 10.1038/cr.2015.82 |
| [39] | QUAN G B, LI J L. Circular RNAs:biogenesis, expression and their potential roles in reproduction[J]. J Ovarian Res, 2018, 11(1): 9. DOI: 10.1186/s13048-018-0381-4 |
| [40] | LI Z Y, HUANG C, BAO C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus[J]. Nat Struct Mol Biol, 2015, 22(3): 256–264. DOI: 10.1038/nsmb.2959 |