我国鸡蛋产量稳居世界第一，每年以2%的复合增长率增长(FAO)，其中鸡胚蛋作为药膳餐补佳品广泛用于改善机体免疫功能[1]。《本草纲目》记载：“鸡胚蛋有治头痛、偏头痛、头疯病及四肢疯瘴之功能，童叟弱者常食之，有健脾胃作用，遂而起到强身健体之功效” [2]。传统中医疗法就有利用鸡胚配伍治疗疾病的做法，在我国南方以及日本、韩国等东南亚国家视鸡胚蛋为天然营养品[3]。前人研究表明，与鲜鸡蛋相比，鸡胚蛋中对人体有利的物质含量增加，如蛋白质、氨基酸、维生素、无机盐、不饱和脂肪酸、牛磺酸和免疫球蛋白等，而总糖、总脂肪、胆固醇等对人体不利的物质含量则明显下降[2, 4-7]。鸡胚具有促进动物生长发育、增强免疫、抗疲劳、抗应激、抗衰老等作用[8-12]，除“喜蛋”、“活珠子”产品外，鸡胚肽口服液、鸡胚营养粉等制品也应运而生。可见蛋制品的精深加工前景广阔，但鸡胚蛋中发挥生理功效的活性物质基础及其作用机制尚不清楚，对其免疫调节作用进行科学研究与验证具有重要意义。
外泌体(exosomes)是一种直径约为30~150 nm的细胞外囊泡，源于胞吞作用而产生的细胞内源性有膜微囊，可由多种不同类型的细胞释放进入胞外空间。外泌体内部包含有蛋白质、脂质、miRNA等生物活性物质，通过转运其内含物，外泌体作为细胞间信息传递的载体，参与包括机体免疫在内的多种过程[13-16]。外泌体所含脂质、蛋白质在外泌体的形成、释放及与受体细胞的融合过程中发挥重要作用[17-18]，所含的核糖核酸多为小RNA[18-20]，miRNA在各种极端理化条件下稳定存在并以外泌体结构为基础通过膜囊泡运输进入细胞，参与机体免疫应答、抗原递呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等[21-22]。
研究发现，仅饲喂初乳的仔猪血清中免疫相关miRNAs显著高于饲喂常乳的仔猪[23]，乳汁外泌体物理结构未被破坏时，其所含的miRNAs可在不同细胞间传递[24-25]，推测, miRNAs被包裹在外泌体中安全通过胃肠道而发挥作用[23, 25-26]。近年来，研究者在miRNAs的跨界传输与调控研究中积累了可靠证据[27-28]，发现大熊猫母乳外泌体中可检测到竹子来源的miRNAs[29]；生姜外泌体miRNAs可以调节肠道菌群，改善肠道健康[30]；人食用牛乳4~6 h后血浆中检测到较高含量的牛乳富含的miR-29b和miR-200c，并且在牛奶消耗后，血液单核细胞中的矮小相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, RUNX2，miR-29b的已知靶标)的表达增加了31%[31]；持续饲喂金银花汤的小鼠外周血和肺中检测到金银花来源MIR2911，并通过靶向聚合酶碱性蛋白2(polymerase basic protein 2, PB2)和非结构蛋白1(nonstructural protein 1, NS1)基因抑制甲型流感病毒的复制[32]。尽管外泌体中食源性miRNAs的生物学功能及作用机制尚需深入挖掘，但大量研究说明了食源性miRNAs的重要性。
作为传统食补佳品，鸡胚中生物活性物质的传递及其可能的作用机制尚不清楚。因此，本研究以鸡胚为素材，通过分离、鉴定鸡胚组织来源的外泌体，并对其miRNAs的功能进行分析，建立鸡胚组织外泌体的分离方法，并解析其所含miRNAs的生理功能，为深入理解鸡胚中活性物质的功能，分析可能的作用机制及功能性产品的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料收集处于产蛋高峰期的惠阳胡须鸡受精蛋30枚(来源于广东省农业科学院动物科学研究所家禽试验场)，置于数字孵化器中，孵化条件为37 ℃，相对湿度65%~75%，每小时自动翻蛋1次。孵化至第13天时，取出鸡胚蛋，选取重量相近的18枚，分为3组，每组6枚，用于后续处理。
1.2 主要仪器数字孵化器(Digital incubator Rcom PRO 50 PX-50)购自韩国Autoelex有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅购自上海一恒科技有限公司；超速离心机(XPN-100)购自美国Beckman coulter有限公司；透射电镜(JEM-1200EX)购自日本电子株式会社(JEOL)；纳米流式检测仪(Flow NanoAnalyzer，NanoFCM)购自厦门福流生物科技有限公司；流式细胞仪(BD accuri C6 flow cytomenter)购自美国BD生物科学公司；荧光定量PCR仪(ABI 7500 Detection System)购自美国Applied Biosystems公司。
1.3 主要试剂Ⅲ型胶原酶购自美国Worthington Biochemical公司；无菌PBS、DMEM培养基、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自Sigma公司；exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit、miScript Ⅱ RT Kit和miScript SYBR Green PCR Kit均购自Qiagen公司；流式检测CD63-Antibody-FITC和CD81-Antibody-FITC购自美国BD生物科学公司。
1.4 试验方法1.4.1 鸡胚组织的消化 用75%酒精擦拭胚蛋表面后置于超净工作台，用无菌镊子从鸡蛋钝端开孔并取出鸡胚，综合参照Perez-Gonzalez等[33]和Vella等[34]的研究，将分离到的鸡胚经无菌PBS漂洗2~ 3次，去除喙、翅、脚等，用灭菌的剪刀轻柔剪碎，并经0.5% Ⅲ型胶原酶于37 ℃消化30 min，期间消化至5、10和25 min时轻柔混匀1次，收集消化样品，加入DMEM基础培养基、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，并定容至50 mL后置于冰上，用于后续离心。
1.4.2 鸡胚组织中外泌体的分离 将收集到鸡胚消化样品于300、2 000、20 000 g，4 ℃分别离心15、30、45 min，除去细胞、细胞碎片及杂质；小心转移上清至超速离心管中(70Ti转子)于110 000 g，4 ℃超速离心2 h；之后可看到沉淀，用2.5 mL PBS重新悬浮，转移至新管；将2.5 mL预先配置好且预冷的30%(浮力密度为1.13 g·mL-1)、47%(浮力密度为1.21 g·mL-1)和65%(浮力密度为1.32 g·mL-1)的蔗糖缓冲垫置于SW41Ti(13.2 mL)超速离心管，并将上一步重悬的外泌体溶液慢慢加到缓冲垫最上层，经PBS定容后于110 000 g 4 ℃离心2 h；采用穿刺法分别收集3层蔗糖缓冲垫处(Section1、Section2和Section3)的乳白色样品约2 mL；用预冷的PBS分别将3个样品稀释，小心转移至超速离心管中(70Ti转子)，经PBS定容后于110 000 g，4 ℃超速离心1 h，所获沉淀经PBS重悬，获得3个浮力密度范围的囊泡样品(即S1、S2和S3)，经0.22 μm滤膜过滤、分装，－80 ℃保存备用。
1.4.3 鸡胚组织中外泌体蛋白浓度测定及鉴定 按照BCA试剂盒操作说明制作标注曲线，并测定S1、S2和S3样品蛋白浓度。分别采用透射电镜(TEM)、纳米流式(NanoFCM)和外泌体标记物检测等方法进行鉴定。透射电镜观察：将制备好的外泌体样品10 μL滴于2 mm载样铜网上，沉淀3 min，用滤纸沿铜网边缘吸去浮液；经PBS漂洗后用3%磷钨酸负染；室温干燥5 min，将载样铜网置于电镜样品室，80 kV下观察样品形态，拍照。NanoFCM检测：利用二氧化硅标准球建立散射光强度与颗粒粒径的标准工作曲线，可将相同条件下待测样品的散射强度转化为粒径，获得待测样品的粒径分布；通过检测已标定浓度的荧光微球的个数快读得到特定进样压力的样品流体积流量，在相同的进样压力条件下检测待测样品，获得样品的颗粒浓度。根据仪器操作说明，参照粒径标准品和已标定浓度的荧光微球的适宜检测条件对外泌体样品进行测定。流式细胞仪表面标记物检测：用100 μL无菌PBS复匀外泌体，密封，冰上保存，样品分别与含CD63和CD81的抗体磁珠孵育、染色。并留取阴性对照，按照仪器操作进行检测。
1.4.4 鸡胚组织中外泌体的小RNA测序 按照exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit说明书操作提取各样品RNA，经安捷伦2100生物分析仪检测合格后，委托广州表观生物科技有限公司根据QIASeq miRNA library kit构建3个外泌体小RNA测序文库，并开展miRNA-seq。测序结果去除adapter和低质量的reads后进行评估和后续分析。
1.4.5 鸡胚组织中外泌体的miRNA比对与定量验证 测序所获reads经过质控、过滤后，与miRBase V21 (http://www.mirbase.org/)中家鸡已知的miRNAs进行比对，筛选出已知的miRNAs。随机选择8个miRNAs，以miRNAs成熟序列为参考设计荧光定量引物，采用加尾法，在ABI 7500定量仪上对miRNAs表达情况进行检测、验证。采用miScript Ⅱ RT Kit进行反转录，miScript SYBR Green PCR Kit测定目的miRNAs丰度，以5S rRNA为内参基因进行数据的标准化处理，采用2-ΔΔCt方法计算相对miRNAs表达水平，所有样品测定均设置3个独立的重复，数据以“平均值±标准差”表示[35]。
1.4.6 鸡胚组织中外泌体的miRNAs靶基因预测及功能分析 选取3个样品中top 10(样品总miRNAs的前10%)且共同表达的已知miRNAs进行靶基因预测，采用TargetScan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miRDB(http://mirdb.org/)进行预测后取交集作为靶基因预测结果。所得靶基因用DAVID6.8 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行功能注释与通路富集分析。基于KEGG数据库，利用Fisher精确检验和卡方检验对所得到的靶基因参与的信号通路进行显著性分析，按照P < 0.05进行筛选，得到显著的信号通路。
2 结果 2.1 鸡胚组织中外泌体的分离本研究采用酶消化、蔗糖密度梯度、差速超速离心等方法分离、纯化鸡胚组织中的胞外囊泡，以蔗糖梯度为分界线，获得了3个层级的囊泡物质。操作流程如图 1所示。鸡胚组织经酶消化后经300 g离心去除组织块和细胞团，接下来的离心用于逐步除去较大的细胞碎片和微泡等。早期研究认为，外泌体的浮力密度范围是1.13~1.19 g·mL-1，因此本试验结合30%(1.13 g·mL-1)、47%(1.21 g·mL-1)和65%(1.32 g·mL-1)蔗糖垫进行超速离心，理论上分离得到的样品S1即为该范围的囊泡。
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图 1 鸡胚组织中胞外囊泡分离流程 Fig. 1 Schematic of the extracellular vesicles isolation protocol from chicken embryo tissue |
采用BCA法测得S1、S2和S3样品的蛋白浓度分别为6 804.1、4 709.8和3 916.2 μg·mL-1。透射电镜(TEM)观察显示，通过上述流程获得了呈圆形或椭圆形的囊泡状结构，具有典型的杯状，在囊泡外周可见膜性结构。其特征与其它来源的外泌体基本一致，从形态学上可判定本次纯化的物质即为外泌体(图 2)。S1组分中一些相对较大的囊泡占比多于S2和S3，S3样品所含的囊泡直径大小多为62~ 87 nm。因为鸡胚是一个高速发育的生命组织，增长迅速，组织类型多样，所以外泌体来源更加广泛，因此类型也较为丰富。
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A、D. 30%蔗糖垫处收集的囊泡S1；B、E. 47%蔗糖垫处收集的囊泡S2；C、F. 65%蔗糖垫处收集的囊泡S3。A~C标尺为500 nm；D~F标尺为200 nm A, D. Vesicles S1 collected at 30% sucrose cushion; B, E. Vesicles S2 collected at 47% sucrose cushion; C, F. Vesicles S3 collected at 65% sucrose cushion. The bars of A-C and D-F are 500 and 200 nm, respectively 图 2 鸡胚组织中胞外囊泡的透射电镜检测 Fig. 2 Embryo tissue-derived exosome-like vesicles under TEM |
根据NanoFCM测得的囊泡直径分布及浓度可知(图 3，表 1)，S1样品为高度富集的部分，无论是囊泡大小还是浓度均为最多。与总蛋白测定、TEM鉴定结果一致，S1样品蛋白浓度最高，且包含相对较大的囊泡，囊泡浓度也最高。同样地，S3样品NanoFCM测得粒径较小的囊泡占比最多，囊泡浓度最低，这与经BCA法测得的总蛋白最低结果一致，与TEM观察结果吻合。
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A.30%蔗糖垫处收集的囊泡S1；B. 47%蔗糖垫处收集的囊泡S2；C. 65%蔗糖垫处收集的囊泡S3 A.Vesicles S1 collected at 30% sucrose cushion; B. Vesicles S2 collected at 47% sucrose cushion; C. Vesicles S3 collected at 65% sucrose cushion 图 3 鸡胚组织中胞外囊泡的纳米流式检测 Fig. 3 Embryo tissue-derived exosome-like vesicles under NanoFCM |
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表 1 鸡胚组织中胞外囊泡的纳米流式检测数据统计 Table 1 Data statistics of embryo tissue-derived exosome-like vesicles under NanoFCM |
为了进一步确认所获样品为外泌体，采用流式细胞仪荧光分析外泌体蛋白标志物CD63和CD81，由图 4可知，在3个样品中均检测到一定比例的阳性囊泡颗粒，说明分离到的囊泡均具有胞外囊泡标志蛋白，但阳性比例存在差异，其中CD63的阳性率低于CD81。
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A.30%蔗糖垫处收集的囊泡S1；B. 47%蔗糖垫处收集的囊泡S2；C. 65%蔗糖垫处收集的囊泡S3 A. Vesicles S1 collected at 30% sucrose cushion; B. Vesicles S2 collected at 47% sucrose cushion; C. Vesicles S3 collected at 65% sucrose cushion 图 4 流式检测鸡胚组织中胞外囊泡标志蛋白 Fig. 4 Detection of embryo tissue-derived exosome-like vesicles marker proteins under flow cytometry |
综合上述研究结果可知，鸡胚组织所含的细胞类型多样，所以分泌的囊泡非常丰富，在1.13 ~1.32 g·mL-1浮力密度范围内均存在符合外泌体典型特征的胞外囊泡。
2.3 鸡胚组织中外泌体已知miRNA比对与验证经质控、过滤合格的reads与miRBase V21中家鸡(Gallus gallus)已知的miRNAs进行比对。由图 5可知，在S1、S2和S3样品中分别发现了675、661和845个已知的miRNAs，这些miRNAs中有488个(52.6%)是三者共有的，包括了gga-miR-1a-3p、gga-miR-148a-3p、gga-miR-122-5p、gga-let-7b和gga-miR-205a等广泛参与细胞增殖、分化和免疫应答等过程的功能性miRNAs分子。除去三者共有的miRNAs外，S1、S2共有和各自特有的miRNAs数量相对较少约25~32个(2.7%~3.4%)，S3和S1、S2共有的miRNAs数量相当，分别为130个(14%)和115个(12.4%)，S3样品特有的miRNAs为112个(12.1%)。为检验高通量测序结果的可靠度，随机选择8个miRNAs(表 2)进行荧光定量验证。两种方法检测到的miRNAs变化趋势相似，说明高通量测序数据可用于后续挖掘、分析(图 6)。
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图 5 3个样本中所有已知miRNAs的维恩图 Fig. 5 Venn diagram of total known miRNAs in the 3 samples |
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表 2 miRNA荧光定量验证特异性引物 Table 2 miRNA-specific primers for qPCR |
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图 6 高通量测序结果的qPCR验证 Fig. 6 qPCR verified for high-throughput sequencing results |
miRNA通过调节其靶向作用的基因发挥功能，因此对3个样品中top 10且共同表达的miRNAs进行靶基因预测，由图 7可知，3个样品中top 10且共同表达的miRNAs有56个(64.4%)。采用TargetScan 7.2和miRDB两个平台预测这56个miRNAs的靶基因并取交集，获得了3 650个靶基因，用于通路富集分析。由图 8可知，显著富集了24个生物学通路(P < 0.05)，包括MAPK信号通路、Notch信号通路和Wnt信号通路等与信号转导有关的10个通路；胞吞作用、自噬调节等与细胞运动、生长、死亡等细胞过程有关的8个通路；GnRH信号通路、胰岛素信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性等与内分泌系统、循环系统、免疫系统等生物系统有关的通路6个。
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图 7 3个样品top 10共表达miRNAs的维恩图 Fig. 7 Venn diagram of top 10 co-expressed miRNAs in the 3 samples |
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图 8 靶基因通路富集分析 Fig. 8 Pathway enrichment analysis of all target genes |
近年来，关于外泌体的研究主要集中在血液、唾液、尿液、乳汁、细胞培养液等液体样本，而从组织样本中分离鉴定外泌体的研究报道较少。目前，已从脑组织和脂肪组织中分离到了外泌体，但所采用的分离方法存在不足之处，如采用机械均质化和过滤进行组织样品前处理，可能会破坏细胞外环境或者造成细胞损伤，因而同时获得大量胞内囊泡和外泌体类似物；脂肪组织采用离体培养(3 d)后通过收集培养液分离外泌体，该方法也不能全面反映组织在机体中的状态，且组织细胞离体培养过程中可能会因环境的改变影响外泌体的释放及其所携带的物质成分[36-37]。本研究采用酶消化和超速密度梯度离心的方法从鸡胚组织中分离外泌体，与Vella等[34]采用的方法相似，为酶消化和超速密度梯度离心法，但所用酶的剂量与密度梯度设置不同，根据前期试验优选了适宜的酶浓度、消化时间等，这些参数的设置与试验素材以及目的有关[38-39]。本研究成功分离到了3个浮力密度范围的胞外囊泡，通过TEM、NanoFCM、标志蛋白鉴定等方法对鸡胚组织来源的胞外囊泡进行微观形态、大小、标志蛋白的分析，均符合外泌体定义特征，结果证明，鸡胚组织中外泌体含量丰富，尺寸和形态符合液体样本(血浆、尿液和乳汁)中外泌体的典型特征[14, 40-41]。本研究中，外泌体标志蛋白CD63的阳性率低于CD81，可能是受到种属限制，试验中没有适宜的家鸡种属抗体可用，故而检测时采用了小鼠的CD63和CD81抗体进行检测分析，而小鼠CD63与鸡的氨基酸相似度偏低。尽管超速离心是当前外泌体分离的金标准，获得的外泌体纯度优于商业化试剂盒[42]，但需要结合试验素材和研究目的设置相应的分离条件，本研究结果进一步说明特定的浮力密度范围可有效富集样品中的囊泡，但并不能根据囊泡直径大小进行绝对区分，同时，样品所含细胞类型多则其所分泌的外泌体类型也非常丰富。本研究提供了一套从鸡胚组织中有效分离外泌体的方法流程，并且通过多种手段表征了所获外泌体的特性，为组织外泌体分离提供参考。
miRNA在先天免疫和获得性免疫方面发挥着极为重要的调控作用，因此，本研究对鸡胚组织来源的外泌体小RNA进行了高通量测序，3个样品中均获得了大量已知的miRNAs，占鸡物种已知miRNAs的57.0%~59.7%，其中miR-148a、miR-206、miR-199-1、miR-199-2、miR-1a-1和miR-1a-2在3个样本中高表达，且均为前6个miRNAs，分别占S1、S2和S3样品中已知miRNAs总reads的49.68%、42.55%和42.40%。综合来看，miR-148a为3个样品共有且含量最高，占各自文库已知miRNA总reads的6.58%、12.68%和12.86%，这一表达特性与在人、牛和猪乳汁中的检测结果相同[23, 43]。这些关键的miRNAs通过外泌体的包裹传输到人体后发挥怎样的功能呢？本研究对3个样品中top 10且共表达的已知miRNAs进行了功能分析，其靶基因富集到了与机体生长、发育、免疫等有关的24个关键生物学通路，包括MAPK信号通路、mTOR信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路和GnRH信号通路等，均为机体生命活动中至关重要的生物学通路。MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，在许多细胞活动中发挥重要作用，如脂肪细胞、骨骼肌细胞等的增殖、分化、迁移或凋亡，并且MAPK信号通路与许多参与生长、分化的受体及通路密切关联[44-46]。MAPK信号通路参与家鸡胚胎期早期分化、肌肉发育和免疫细胞发育等[47-49]。研究者在mTOR信号通路如何参与先天免疫及其作用方式等方面开展了大量研究，发现mTOR调控细胞代谢、参与调节翻译、细胞因子反应、抗原呈递、巨噬细胞极化、自噬和细胞迁移等过程，可将细胞活化与环境和细胞内营养状况相结合以决定和优化炎症反应，并且mTOR以细胞特异性方式调节关键转录途径，例如NF-κB、STAT3、HIF1α和PPARγ途径等[50]。基于上述研究结果，后续通过开展细胞试验和动物活体试验，深入解析外泌体及其所含的关键miRNAs的生理功能，为全面理解鸡胚蛋作为药膳餐补佳品的营养免疫功效以及鸡胚生物活性物质开发与应用提供科学依据。同时，为中医用药以及“亚健康”状态人群(≥75%)保健食品的开发提供理论参考。
4 结论本研究提供了从鸡胚组织中有效分离外泌体的方法流程，为组织外泌体的分离提供了参考。同时发现，鸡胚组织来源的外泌体富含miRNAs，这些miRNAs会影响24个与机体生长发育和免疫调节有关的生物学通路，为进一步可将鸡胚蛋作为功能性食疗佳品提供证据。
| [1] |
李曦.鸡胚蛋对免疫力低下小鼠的免疫调节功能研究[D].无锡: 江南大学, 2012.
LI X.Study on the immunomodulatroy effect of chick embryo egg on hypoimmunity mice[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2012.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10295-1013129661.htm |
| [2] |
刘娟娟.不同品种鸡胚蛋孵化期间营养物质的变化[D].泰安: 山东农业大学, 2007.
LIU J J.Changes of the nutrients in different types of embryonated eggs during incubation peroid[D]. Tai'an: Shandong Agricultural University, 2007.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10434-2007135364.htm |
| [3] |
段翔.孵化对鸡蛋营养成分及生物活性组分的影响[D].无锡: 江南大学, 2015.
DUAN X.Effect of fertilization on nutritional compositions and bioactive components of hen egg[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2015.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10295-1015523882.htm |
| [4] |
李利东, 袁建兴, 宓晓黎, 等. 不同孵化期的鸡胚蛋营养和功效成分研究[J]. 食品科学, 2004, 25(11): 287–290.
LI L D, YUAN J X, MI X L, et al. Study on nutrients improvement and efficacy factors of embrynated eggs duing different incubation periods[J]. Food Science, 2004, 25(11): 287–290. DOI: 10.3321/j.issn:1002-6630.2004.11.076 (in Chinese) |
| [5] |
任军甫.鸡胚孵化过程中营养成分变化规律的研究与胶囊研制[D].洛阳: 河南科技大学, 2011.
REN J F.Study on the changes of nutrition during incubation of chick embryo eggs and development of capsule[D]. Luoyang: Henan University of Science and Technology, 2011.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10464-1011284777.htm |
| [6] | DUAN X, LI M, WU F F, et al. Postfertilization changes in nutritional composition and protein conformation of hen egg[J]. J Agric Food Chem, 2013, 61(49): 12092–12100. DOI: 10.1021/jf403099q |
| [7] |
张丽静, 付劢, 陈继兰, 等. 北京油鸡胚蛋孵化过程中营养成分变化[J]. 食品工业科技, 2019, 40(19): 291–295, 300.
ZHANG L J, FU M, CHEN J L, et al. Changes of nutritional ingredients in embryonated Beijing fatty chicken eggs during its incubating[J]. Science and Technology of Food Industry, 2019, 40(19): 291–295, 300. (in Chinese) |
| [8] |
王倩, 王化洲, 齐志敏, 等. 鸡胚口服液免疫调节作用的实验研究[J]. 中国生化药物杂志, 2000, 21(4): 195–197.
WANG Q, WANG H Z, QI Z M, et al. An experimental study on the effect of the per oral solution extracted from chicken embryo on immunologic function[J]. Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 2000, 21(4): 195–197. DOI: 10.3969/j.issn.1005-1678.2000.04.013 (in Chinese) |
| [9] |
吕玉琴, 郝志明, 李引乾, 等. 鸡胚对小鼠生长和免疫力的影响[J]. 西安联合大学学报, 2002, 5(2): 26–29.
LV Y Q, HAO Z M, LI Y Q, et al. Chick embryo impact on mouse growth and immunity[J]. Journal of Xi'an United University, 2002, 5(2): 26–29. DOI: 10.3969/j.issn.1008-777X.2002.02.006 (in Chinese) |
| [10] |
郝志明, 谢斐, 吕玉琴. 鸡胚复方制剂对小白鼠生长、脾脏指数及血浆SOD和MDA的影响[J]. 西安联合大学学报, 2004, 7(2): 8–11.
HAO Z M, XIE F, LV Y Q, et al. Chicken embryo compound preparation on mouse's growth, spleen index, SOD & MDA plasma[J]. Journal of Xi'an United University, 2004, 7(2): 8–11. DOI: 10.3969/j.issn.1008-777X.2004.02.002 (in Chinese) |
| [11] |
陈正跃, 黄丽君, 许建文, 等. 鸡胚胎素的美容抗衰老及免疫调节作用(英文)[J]. 中国临床康复, 2006, 10(27): 190–192.
CHEN Z Y, HUANG L J, XU J W, et al. Effect of eggembryosin on cosmetology, anti-senility and immunoloregulation[J]. Chinese Journal of Clinical Rehabilitation, 2006, 10(27): 190–192. DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2006.27.045 (in Chinese) |
| [12] |
李丹.鸡胚及其人参配伍免疫调节与抗疲劳作用的研究[D].泰安: 山东农业大学, 2008.
LI D.Study on immune regulatory and anti-fatigue effect of chicken embryo and combined with Ginseng[D]. Tai'an: Shandong Agricultural University, 2008.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10434-2008206963.htm |
| [13] | VLASSOV A V, MAGDALENO S, SETTERQUIST R, et al. Exosomes:current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1820(7): 940–948. DOI: 10.1016/j.bbagen.2012.03.017 |
| [14] | LOBB R J, BECKER M, WEN S W, et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma[J]. J Extracell Vesicles, 2015, 4: 27031. DOI: 10.3402/jev.v4.27031 |
| [15] |
倪爱心, 麻慧, 陈继兰. 寄生虫来源的外泌体研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(5): 909–917.
NI A X, MA H, CHEN J L. Research progress of parasite-derived exosomes[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(5): 909–917. (in Chinese) |
| [16] | GALLEY J D, BESNER G E. The therapeutic potential of breast milk-derived extracellular vesicles[J]. Nutrients, 2020, 12(3): E745. DOI: 10.3390/nu12030745 |
| [17] | THÉRY C, ZITVOGEL L, AMIGORENA S. Exosomes:composition, biogenesis and function[J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2(8): 569–579. DOI: 10.1038/nri855 |
| [18] | CESSELLI D, PARISSE P, ALEKSOVA A, et al. Extracellular vesicles:how drug and pathology interfere with their biogenesis and function[J]. Front Physiol, 2018, 9: 1394. DOI: 10.3389/fphys.2018.01394 |
| [19] | LÄSSER C, ELDH M, LÖTVALL J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes[J]. J Vis Exp, 2012(59): e3037. |
| [20] | LÖNNERDAL B. Human milk MicroRNAs/exosomes:composition and biological effects[J]. Nestle Nutr Inst Workshop Ser, 2019, 90: 83–92. |
| [21] | CORRADO C, RAIMONDO S, CHIESI A, et al. Exosomes as intercellular signaling organelles involved in health and disease:basic science and clinical applications[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(3): 5338–5366. DOI: 10.3390/ijms14035338 |
| [22] | JURJ A, ZANOAGA O, BRAICU C, et al. A comprehensive picture of extracellular vesicles and their contents.Molecular transfer to cancer cells[J]. Cancers (Basel), 2020, 12(2): E298. DOI: 10.3390/cancers12020298 |
| [23] | GU Y R, LI M Z, WANG T, et al. Lactation-related microRNA expression profiles of porcine breast milk exosomes[J]. PLoS One, 2012, 7(8): e43691. DOI: 10.1371/journal.pone.0043691 |
| [24] | WOLF T, BAIER S R, ZEMPLENI J. The intestinal transport of bovine milk exosomes is mediated by endocytosis in human colon carcinoma Caco-2 cells and rat small intestinal IEC-6 cells[J]. J Nutr, 2015, 145(10): 2201–2206. DOI: 10.3945/jn.115.218586 |
| [25] | IZUMI H, TSUDA M, SATO Y, et al. Bovine milk exosomes contain microRNA and mRNA and are taken up by human macrophages[J]. J Dairy Sci, 2015, 98(5): 2920–2933. DOI: 10.3168/jds.2014-9076 |
| [26] |
张顺华.猪不同泌乳期乳汁Exosome中microRNA转录组的鉴定和表达谱分析[D].雅安: 四川农业大学, 2013.
ZHANG S H.Lactation-related microRNA expression profiles of porcine breast milk exosomes[D]. Ya'an: Sichuan Agricultural University, 2013.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10626-1014102120.htm |
| [27] | ZHANG L, CHEN T, YIN Y L, et al. Dietary microRNA-A novel functional component of food[J]. Adv Nutr, 2019, 10(4): 711–721. DOI: 10.1093/advances/nmy127 |
| [28] | ZENG J, GUPTA V K, JIANG Y M, et al. Cross-kingdom small RNAs among animals, plants and microbes[J]. Cells, 2019, 8(4): 371. DOI: 10.3390/cells8040371 |
| [29] | MA J D, WANG C D, LONG K R, et al. Exosomal microRNAs in giant panda (Ailuropoda melanoleuca) breast milk:potential maternal regulators for the development of newborn cubs[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 3507. |
| [30] | TENG Y, REN Y, SAYED M, et al. Plant-derived exosomal MicroRNAs shape the gut microbiota[J]. Cell Host Microbe, 2018, 24(5): 637–652. DOI: 10.1016/j.chom.2018.10.001 |
| [31] | BAIER S R, NGUYEN C, XIE F, et al. MicroRNAs are absorbed in biologically meaningful amounts from nutritionally relevant doses of cow milk and affect gene expression in peripheral blood mononuclear cells, HEK-293 kidney cell cultures, and mouse livers[J]. J Nutr, 2014, 144(10): 1495–1500. DOI: 10.3945/jn.114.196436 |
| [32] | ZHOU Z, LI X H, LIU J X, et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses[J]. Cell Res, 2015, 25(1): 39–49. |
| [33] | PEREZ-GONZALEZ R, GAUTHIER S A, KUMAR A, et al. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space[J]. J Biol Chem, 2012, 287(51): 43108–43115. DOI: 10.1074/jbc.M112.404467 |
| [34] | VELLA L J, SCICLUNA B J, CHENG L, et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue[J]. J Extracell Vesicles, 2017, 6(1): 1348885. DOI: 10.1080/20013078.2017.1348885 |
| [35] | LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402–408. DOI: 10.1006/meth.2001.1262 |
| [36] | GALLART-PALAU X, SERRA A, SZE S K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR[J]. Mol Neurodegener, 2016, 11(1): 41. DOI: 10.1186/s13024-016-0108-1 |
| [37] | ZHANG Y, YU M, DAI M, et al. miR-450a-5p within rat adipose tissue exosome-like vesicles promotes adipogenic differentiation by targeting WISP2[J]. J Cell Sci, 2017, 130(6): 1158–1168. |
| [38] | PÉREZ-GONZÁLEZ R, GAUTHIER S A, KUMAR A, et al.A method for isolation of extracellular vesicles and characterization of exosomes from brain extracellular space[M]//HILL A.Exosomes and Microvesicles.Methods in Molecular Biology, vol 1545.New York: Humana Press, 2017: 139-151. |
| [39] | GAO F, JIAO F, ZHANG Y, et al. Advances in separation techniques for exosomes and their clinical applications[J]. Se Pu, 2019, 37(10): 1071–1083. |
| [40] | LIU Z G, CAUVI D M, BERNARDINO E M A, et al. Isolation and characterization of human urine extracellular vesicles[J]. Cell Stress Chaperones, 2018, 23(5): 943–953. DOI: 10.1007/s12192-018-0902-5 |
| [41] | DONG P, ZHANG Y, YAN D Y, et al. Protective effects of human milk-derived exosomes on intestinal stem cells damaged by oxidative stress[J]. Cell Transplant, 2020, 29: 1–8. |
| [42] | DOYLE L M, WANG M Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis[J]. Cells, 2019, 8(7): 727. DOI: 10.3390/cells8070727 |
| [43] |
林德麟, 陈婷, 黎梦, 等. 乳中miRNA的研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(9): 1739–1748.
LIN D L, CHEN T, LI M, et al. Research progress of miRNA in milk[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(9): 1739–1748. (in Chinese) |
| [44] | SUN Y, LIU W Z, LIU T, et al. Signaling pathway of MAPK/ERK in cell proliferation, differentiation, migration, senescence and apoptosis[J]. J Recept Signal Transduct Res, 2015, 35(6): 600–604. DOI: 10.3109/10799893.2015.1030412 |
| [45] |
张秀秀, 郭云涛, 黄万龙, 等. 靶向MAPK信号通路调控脂肪细胞分化的microRNAs[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(11): 2159–2166.
ZHANG X X, GUO Y T, HUANG W L, et al. Regulation of adipocyte differentiation via microRNAs targeting MAPK signaling pathway[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(11): 2159–2166. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.002 (in Chinese) |
| [46] |
郑琪, 睢梦华, 凌英会. 骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化过程中关键信号通路的作用[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(11): 2005–2014.
ZHENG Q, SUI M H, LING Y H. The role of key signaling pathways in the proliferation and differentiation of skeletal muscle satellite cells[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(11): 2005–2014. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.11.001 (in Chinese) |
| [47] | HWANG Y S, SEO M, LEE B R, et al. The transcriptome of early chicken embryos reveals signaling pathways governing rapid asymmetric cellularization and lineage segregation[J]. Development, 2018, 145(6): dev157453. DOI: 10.1242/dev.157453 |
| [48] | LUO W, LIN S M, LI G H, et al. Integrative Analyses of miRNA-mRNA interactions reveal let-7b, miR-128 and MAPK pathway involvement in muscle mass loss in sex-linked dwarf chickens[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(3): 276. DOI: 10.3390/ijms17030276 |
| [49] | NUTHALAPATI N K, EVANS J D, TAYLOR R L, et al. Transcriptomic analysis of early B-cell development in the chicken embryo[J]. Poult Sci, 2019, 98(11): 5342–5354. DOI: 10.3382/ps/pez354 |
| [50] | WEICHHART T, HENGSTSCHLÄGER M, LINKE M. Regulation of innate immune cell function by mTOR[J]. Nat Rev Immunol, 2015, 15(10): 599–614. DOI: 10.1038/nri3901 |