2. 贵州大学动物科学学院, 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 550025;
3. 贵州省六盘水市市农委, 六盘水 553000;
4. 毕节市畜牧遗传资源管理站, 毕节 551700
, ZHANG Yong1,2
, LUO Keyin3, HUANG Mingjie1,2, WANG Tiansong1,2, GUO Yong1,2, YANG Hong4
2. Guizhou Province Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Agricultural Committee of Liupanshui City, Liupanshui 553000, China;
4. Bijie Animal Husbandry Genetic Resources Management Station, Bijie 551700, China
醌型二氢生物喋呤还原酶(quinoid dihydropteridine reductase, QDPR)也称为DHPR或PKU2，是短链脱氢酶/还原酶家族的成员[1]，在生物体内以二聚体形式广泛分布[2]。QDPR是四氢生物喋呤的代谢酶，可以修复四氢叶酸(THF)的氧化损伤[3]，催化(促进)四氢生物喋呤(tetrahydrobiopterin, BH4)的循环[4-7]，对维持四氢生物喋呤(BH4)含量稳定有重要作用[8]。范雪娇[9]研究发现，BH4能够增加葡萄糖利用率和乳酸产量，上调LDHA、PDK1、MCT4和CAⅨ表达，BH4的合成能激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路。Xu等[10]通过转基因小鼠模型阐明了DHFR和QDPR在BH4再生中的作用，并揭示了叶酸相关代谢随着氧化应激的生化标记物增加而受到干扰，该试验是首次通过体内试验表明生物喋呤代谢的改变影响叶酸代谢。大量研究表明，叶酸是作为快速生长的现代肉禽体内合成嘌呤、嘧啶的必需物质和有效的甲基载体，可促进机体生长发育，提高饲料转化效率和日增重[11-14]。张涛等[15]利用简化基因组测序技术对京海黄鸡上市体重和相关的SNPs进行全基因组关联分析，找到了QDPR在内的6个可能影响京海黄鸡上市体重的重要候选基因。许多研究发现，鸡4号染色体74.3~75.9 Mb是影响鸡体组成性状的重要区域，此区域上的LDB2、LCORL和QDPR等基因为影响鸡体组成性状的重要候选基因[16-19]。上述研究表明，QDPR基因可能对鸡的生长发育起着重要调控作用，但目前为止，还未发现关于QDPR基因对鸡生长发育具体调控作用方面的研究报道。乌蒙凤鸡为贵州省六盘水市新近发现的优良地方资源，具有典型凤冠特征，且肉质鲜美、耐粗饲[20-22]，前期研究发现, 乌蒙凤鸡具有多个母系起源，遗传多样性丰富[23]，目前，该群体处于品系选育初期。
本研究对乌蒙凤鸡QDPR基因的分子结构序列及各时期的组织表达情况进行分析，以探究QDPR基因在乌蒙凤鸡生长发育中的调控作用，并为进一步开展乌蒙凤鸡专门化品系的分子选育奠定相关工作基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集试验动物来自六盘水金凤栖自然牧业有限公司乌蒙凤鸡保种扩繁场，选择相同饲养条件下同批次的乌蒙凤鸡24只(公母各12只)，分别于4、12、20和28周龄进行屠宰取样，每个阶段采集公、母鸡各3只，包括心、肝、脾、肺、肾、胸肌和腿肌7个组织，置于液氮中带回实验室-80 ℃保存，用于提取总RNA。
1.2 试剂与仪器Trizol购自宝生物工程(大连)有限公司；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自上海英骏生物技术有限公司；SYBR Green qPCR Master Mix(No ROX)购自于上海皓元生物医药科技有限公司(MedChemExpress LLC，美国)；pMD19-T购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自康宁生命科学有限公司(美国)；氨苄青霉素购自北京索莱宝生物公司；DH5α感受态细胞由本实验室保存。
超微量紫外分光光度计(型号Thermo ManoDrop 2000, 美国)、梯度PCR仪(型号ABI Veriti TM, 德国)；DYCZ-24F电泳仪购自北京六一仪器厂；BioSens SC 710凝胶成像系统购自上海山富科技仪器有限公司。
1.3 试验方法1.3.1 总RNA提取 采用Trizol法提取各组织总RNA。取出组织，用已灭菌剪刀镊子剪取50~ 150 mg组织置于预冷研钵中，加入液氮迅速研磨为粉末状，转移至加有1 mL Trizol的1.5 mL无酶离心管中，震荡混匀静置5 min，加入200 μL氯仿震荡混匀静置10 min后12 000 r·min-1, 4 ℃离心15 min，吸取上清液转移至新离心管中，加入500 μL异丙醇混匀静置10 min后12 000 r·min-1, 4 ℃离心10 min，倒掉上清液，加入1 mL 75%预冷乙醇，震荡洗涤沉淀，9 800 r·min-1, 4 ℃离心5 min，倒掉上清液，再加入1 mL 75%预冷乙醇，重复震荡洗涤沉淀，9 800 r·min-1, 4 ℃离心5 min，吸弃上清液，将离心管倒置于干净滤纸上晾干(10~20 min)，管内无残留乙醇后加入30 μL DEPC水溶解沉淀，震荡离心后使用超微量紫外分光光度计检测总RNA浓度与纯度，总RNA置于－80 ℃保存待用。
1.3.2 cDNA合成 参照赛默飞逆转录试剂盒说明书进行逆转录。加样体系(20 μL)：RNA 0.1~5 μL(根据各组织总浓度调节所加的量)加RNase-Free Water补足11.0 μL，Oligo(dT)18Primer 1 μL，5×Reaction Buffer 4.0 μL，Ribolock RNase Inhibitor(20 U·μL-1)1.0 μL，10 mmol·L-1 dNTP Mix 2.0 μL，RevertAid M-MuLV RT (200 U·μL-1) 1.0 μL。逆转录PCR：42 ℃孵育60 min，75 ℃孵育5 min，后置于－20 ℃保存备用。
1.3.3 引物设计及合成 根据NCBI数据库中原鸡QDPR基因的mRNA序列(NM_001006566.1)查询CDS区(717 bp)，利用Primer Premier 5.0软件设计CDS序列克隆引物和实时荧光定量引物，以GAPDH为内参基因，并利用PrimerBLAST在线软件进行分析，选取评分最高的引物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如表 1所示。
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表 1 QDPR基因CDS序列扩增及荧光定量引物信息 Table 1 CDS sequence amplification of QDPR gene and fluorescence quantitative primer information |
1.3.4 QDPR基因扩增 PCR扩增反应体系(25 μL)：2×Es Taq Mas-ter Mix 15.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，RNase-Free Water 5.0 μL，cDNA模板2.0 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，69 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃补偿延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.5 QDPR基因克隆 用胶回收试剂盒进行PCR产物切胶回收纯化，将目的片段与pMD19-T载体16 ℃连接反应16 h。将连接液转化至DH5α感受态细胞中，涂板37 ℃培养14 h。随机挑取12个单克隆菌落振荡培养12 h，进行菌液PCR与双酶切鉴定。将鉴定为阳性的菌液送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。
1.3.6 乌蒙凤鸡QDPR基因序列生物信息学分析 使用生物信息学在线软件ExPASy、Npsa-prabi和Phyre2对乌蒙凤鸡QDPR基因克隆序列进行蛋白理化性质、二级结构和三级结构分析；运用在线软件SMATR、PredictProtein和STRING对QDPR蛋白质功能结构域、亚细胞定位、互作蛋白进行预测分析。从GenBank下载不同物种的QDPR基因序列，与乌蒙凤鸡QDPR基因序列进行同源性分析，利用MEGA6软件进行遗传进化树绘制。
1.3.7 QDPR基因在不同阶段各组织中的表达分析 以GAPDH为内参基因，qRT-PCR检测不同阶段乌蒙凤鸡心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌7种组织中QDPR基因的表达情况，目的基因和GAPDH定量引物如表 1所示。每个样品重复3次。
1.3.8 数据统计分析 以4周龄公鸡心组织为不同组织间差异定量分析的参照，采用2-ΔΔCt法计算分析，采用SPSS Statistics26软件对数据进行差异显著性分析，结果以“平均值±标准误”表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 乌蒙凤鸡QDPR基因扩增乌蒙凤鸡QDPR基因CDS区扩增PCR结果如图 1A所示，片段长度大小与预期片段大小(766 bp：QDPR基因CDS区717 bp加上CDS区上游23 bp mRNA序列与EcoR I酶切位点保护碱基GAATTC和CDS区下游14 bp mRNA序列与BamH I酶切位点保护碱基GGATCC)一致，初步判断扩增片段为乌蒙凤鸡QDPR基因的CDS区，可进行后续克隆试验。以逆转录后的cDNA为模板进行荧光引物扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图 1B)，显示为单一特异性条带, 结果与预期相符。
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A. QDPR基因CDS扩增产物凝胶电泳图谱; B. QDPR实时荧光定量扩增凝胶电泳图谱。M. DNA相对分子质量标准; Q. QDPR基因CDS扩增产物; 1. QDPR基因实时荧光定量扩增产物; 2. GAPDH基因扩增产物 A. The gel electrophoresis of CDS amplified fragments of QDPR gene; B. Real-time fluorescent quantitative amplification gel electrophoresis of QDPR. M. DL2000 marker; Q. The amplified fragments of QDPR gene CDS; 1. Real-time fluorescent quantitative amplified fragments of QDPR gene; 2. The amplified fragments of GAPDH gene 图 1 扩增产物凝胶电泳图 Fig. 1 The gel electrophoresis of amplification products |
将经菌液PCR验证后的阳性菌测序。测序结果比对显示，乌蒙凤鸡QDPR基因与原鸡Gallus gallus (chicken) QDPR基因序列同源性高达99.86 %，并发现，乌蒙凤鸡QDPR基因存在一个同义突变位点C117T。
2.3 乌蒙凤鸡QDPR基因序列及编码蛋白性质分析利用DNAStar的Editseq软件预测显示，QDPR基因的开放阅读框(open reading frame，ORF)长度为417 bp，编码139个氨基酸。在线软件Expasy预测结果显示，QDPR蛋白分子式为C2095H3475N717O880S156，原子总数为7 323，相对分子量为57.789 27 ku，理论等电点为5.14，呈酸性。失稳指数(Ⅱ)为44.93，为不稳定蛋白质。氨基酸组成为甘氨酸30.4%、丙氨酸25.2%、苏氨酸22.6%、半胱氨酸21.8%。半衰期在哺乳动物体外红细胞中为4.4 h，在酵母体内为20 h以上，在大肠杆菌体内为10 h以上。
2.4 乌蒙凤鸡QDPR蛋白二级、三级结构和功能结构域分析运用在线软件分析乌蒙凤鸡QDPR蛋白二级结构，结果显示，α螺旋占比37.39%、无规则卷曲占比33.19%，延伸链占比19.75%，β转角仅为9.66%。结构图谱见图 2A。经SMART预测，QDPR编码蛋白含有adh_short_C2和adh_short结构域(图 2B)，PHYRE2预测QDPR蛋白的三级结构含有与NAD/NADP结合的Rossmann折叠结构域(图 2C)。
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A. QDPR蛋白二级结构预测分析：h. α-螺旋；c.无规则卷曲；e.延伸链；t. β-转角。B. QDPR蛋白二级结构域预测分析。C. QDPR蛋白三级结构预测分析 A. Secondary structure prediction analysis of QDPR protein: h. α-helix; c. Random coil; e. Extended strand; t. β-turn. B. Secondary structural domain prediction analysis of QDPR protein; C. The tertiary structure prediction analysis of QDPR protein 图 2 QDPR蛋白结构预测 Fig. 2 QDPR protein structure prediction |
运用在线软件PSORT Ⅱ对乌蒙凤鸡QDPR蛋白的亚细胞定位进行预测，结果显示，乌蒙凤鸡QDPR蛋白定位在细胞质内(图 3A)。互作蛋白预测结果如图 3B所示，表明乌蒙凤鸡QDPR蛋白可能存在互作的蛋白有PAH、PCBD2、SPR、DHFR、PCBD1、TPH2、TPH1、LOC771761、TH、AKR1B10。
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A.亚细胞定位预测；B.蛋白互作网络预测 A. Subcellular localization prediction; B. Protein interaction network prediction 图 3 QDPR蛋白亚细胞定位及互作网络预测 Fig. 3 QDPR protein subcellular localization and interaction network prediction |
运用TMpred程序分析乌蒙凤鸡QDPR蛋白跨膜区，结果显示，存在2个跨膜结构(图 4A)，分别位于123~142和160~182位氨基酸处。运用在线程序SignalP进行乌蒙凤鸡QDPR蛋白信号肽预测，结果如图 4B显示，乌蒙凤鸡QDPR蛋白不存在信号肽。
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A.蛋白跨膜区预测；B.蛋白信号肽预测 A.Protein transmembrane region prediction; B. Protein signal peptide prediction 图 4 蛋白跨膜区及信号肽预测 Fig. 4 QDPR protein transmembrane region and signal peptide prediction |
利用GenBank查找21个不同物种的QDPR基因序列，进行同源性分析并绘制遗传进化树。核苷酸序列同源性分析结果显示，乌蒙凤鸡QDPR基因与原鸡(99.9%)、日本鹌鹑(97.5%)和珠鸡(97.1%)同源性最高，与其他禽类同源性较高，在82.4%~90.4%之间，与非禽类同源性较低，在70.9%~75.9%之间。将不同物种与乌蒙凤鸡QDPR基因序列进行遗传进化树绘制(图 5)，结果显示，乌蒙凤鸡与原鸡遗传距离最近，与火鸡、日本鹌鹑等禽类聚为同一分支，与人、牛等哺乳动物遗传距离较远属于不同分支，与热带爪蟾等两栖动物遗传距离最远，该结果与同源性分析结果一致。
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图 5 不同物种QDPR的系统进化树和遗传距离 Fig. 5 Phylogenetic tree and genetic distance of QDPR among different species |
2.8.1 乌蒙凤鸡公鸡QDPR基因组织表达差异分析 采用qRT-PCR方法检测QDPR基因在乌蒙凤鸡公鸡各组织中的表达情况，并以4周龄公鸡的心为参照组织，探究QDPR基因在乌蒙凤鸡公鸡不同时间、不同组织的表达差异，结果如表 2所示，发现QDPR基因在乌蒙凤鸡公鸡各时期各组织中均有表达，4、12和20周龄，公鸡肺组织中表达量最高，极显著高于同一周龄其他组织(P＜0.01)，在28周龄，肝组织QDPR基因表达量最高，肺次之，均极显著高于同一周龄其他组织(P＜0.01)。还发现在4个时期公鸡内脏组织中QDPR基因相对表达量均高于肌肉组织。
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表 2 不同时期乌蒙凤鸡公鸡QDPR基因组织表达情况 Table 2 The expressions of QDPR gene in various tissues of Wumeng Crested cocks in different stages |
比较在不同时期公鸡同一组织中QDPR基因的相对表达量可知，肺、肝和腿肌在20周龄表达量最高(P＜0.01)；脾、心和胸肌在12周龄QDPR基因相对表达量最高，极显著高于其他周龄(P＜0.01)；心、肝、脾和胸肌在4个时期呈现先升高后下降的趋势，肺和腿肌呈现出先下降再升高后下降的趋势，肾呈现出先下降后升高的趋势。
2.8.2 乌蒙凤鸡母鸡QDPR基因组织表达差异分析 比较分析QDPR基因在母鸡不同时期、不同组织的表达差异，结果见表 3，QDPR基因相对表达量在4周龄肝、脾和肺极显著高于心、肾、胸肌和腿肌(P＜0.01)，呈现出肝＞脾＞肺＞肾＞心＞腿肌＞胸肌的规律；QDPR基因在12和20周龄肺、肝、脾和肾中的相对表达量极显著高于心、腿肌和胸肌(P＜0.01)，都呈现出肺＞肝＞脾＞肾＞心＞腿肌＞胸肌的规律；QDPR基因在28周龄肺和肝中的相对表达量极显著高于脾、心、肾、腿肌和胸肌(P＜0.01)，呈现出肺＞肝＞脾＞心＞肾＞腿肌＞胸肌的规律。
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表 3 不同时期乌蒙凤鸡母鸡QDPR基因组织表达情况 Table 3 The expressions of QDPR gene in various tissues of Wumeng Crested hens in different stages |
比较同一组织不同时间母鸡QDPR基因相对表达量可知，4周龄肝、脾、肺的QDPR基因相对表达量为所有时期最高，极显著高于12、20周龄(P＜0.01)，28周龄心和肺极显著高于12、20周龄(P＜0.01)。
2.9 QDPR基因在乌蒙凤鸡公、母鸡间表达差异以不同性别乌蒙凤鸡为研究对象，比较各组织中QDPR基因表达差异。由图 6可知，QDPR基因在4个时期公、母鸡部分组织相对表达量均出现差异，其中，4周龄与20周龄公、母鸡间内脏组织差异较为明显。以4个时间段公、母乌蒙凤鸡QDPR基因相对表达量较高的肝和肺为例，4、12和28周龄乌蒙凤鸡母鸡的肝和肺中QDPR基因相对表达量不同程度高于公鸡，而20周龄为公鸡高于母鸡。
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图 6 QDPR基因在不同性别乌蒙凤鸡组织中的相对表达量 Fig. 6 Relative expressions of QDPR gene in various tissues of Wumeng Crested chickens of different genders |
短链脱氢酶/还原酶(SDR)是最大的蛋白质超家族之一[24]，是NAD/NADP依赖的氧化还原酶，其蛋白超家族三维结构都具有典型的Rossmann-fold结构域[25]。SDR酶家族的几个成员在肾上腺和性腺的类固醇激素生成以及在周围组织内的类固醇、氧甾醇、胆汁酸和类视黄醛的代谢中发挥着重要作用，从而控制它们的同源受体的局部激活[26]，在脂质、氨基酸、糖、辅因子、激素和异生物质代谢以及氧化还原传感机制中具有重要作用[27-28]。Persson等[29]将人SDR蛋白超家族划分为48个蛋白家族，其中DHPR_HUMAN属于SDR33C蛋白家族中的SDR33C1蛋白。本试验成功克隆了乌蒙凤鸡QDPR基因CDS区，与NCBI登录的原鸡序列同源性达99.86%，经预测，乌蒙凤鸡QDPR编码蛋白含有adh_short_C2和adh_short结构域，三级结构含有与NAD (P)结合的Rossmann折叠结构域。经比对发现，乌蒙凤鸡QDPR蛋白与DHPR_HUMAN[29]同属于SDR33C蛋白家族。互作蛋白预测结果表明，与QDPR蛋白可能存在互作的蛋白有10种，其中PAH、SPR、DHFR、PCBD1、TPH2、TPH1和TH与QDPR一样同为BH4的代谢酶和辅酶[27-28]，LOC771761参与多巴胺合成的调控[30]，AKR1B10可以限制氧化应激毒副作用并维持脂肪酸氧化[31]，对BH4的代谢合成与多巴胺合成调控具有重要影响。
QDPR对维持细胞内四氢生物喋呤(BH4)活性和一氧化氮合酶(NOS)代谢发挥着重要作用[32]。QDPR可以增加一氧化氮(NO)的合成，清除超氧化物和过氧亚硝酸盐[33]。QDPR是大脑中BH2转化为BH4所必需的一种广泛表达蛋白[34]，研究表明，BH4可抑制缺氧时细胞凋亡[35-36]，改善心脏舒张功能，提高心肌NO生成[37]。肾293T细胞中过表达QDPR导致TGF-1水平下调，提示，QDPR与调节免疫应答的关键细胞因子有关[6-7]，BH4能够增加葡萄糖利用率，影响叶酸代谢[9-11]。这些研究都提示，QDPR可通过影响BH4活性从而对动物免疫和生长产生影响。
本试验检测了QDPR基因在乌蒙凤鸡公、母鸡不同生长阶段各组织中的表达情况，结果表明，该基因在公母鸡心、肝、脾、肺、肾、胸肌和腿肌中均不同程度表达，其中，内脏组织QDPR基因相对表达量均高于肌肉组织，说明QDPR基因属于广谱表达基因。在时空表达差异上，乌蒙凤鸡公鸡QDPR基因在20周龄的肺、肝和腿肌中表达量最高，极显著高于其他周龄(P＜0.01)，12周龄心、脾、胸肌的相对表达量极显著高于4、20和28周龄(P＜0.01)。公鸡各组织中的QDPR基因表达随时间的增长总体呈现出先升后降的趋势；母鸡4周龄肝、脾和肺的QDPR基因相对表达量为所有时间段最高，极显著高于12、20周龄(P＜0.01)，28周龄心和肺中QDPR 基因的表达极显著高于12、20周龄(P＜0.01)，母鸡各组织中的表达随时间的增长总体呈现出先降后升的趋势。QDPR基因在乌蒙凤鸡不同性别、不同生长阶段的组织表达情况存在差异，反映出QDPR基因对公母鸡生长发育过程中不同阶段有着不同的调控作用。研究表明，QDPR基因在人各组织中均有表达，其中脑、肾、肝脂肪和肾上腺中表达较高[38]。在大鼠中，各时间段的肝和肾与21和104周龄脑中QDPR基因表达较高[39]。在小鼠生长的不同时期，QDPR基因在成年阶段的肝、肾、脑和皮肤中高表达[40]。上述结果表明，QDPR基因在不同物种各组织中均有表达，在肝、脑和肾中普遍高表达，并且不同时期表达存在差异，在肌肉组织中低表达，提示，QDPR基因在调控动物生长发育过程中对肝、肾和脑的影响大于肌肉组织。
4 结论本试验成功克隆获得了乌蒙凤鸡QDPR基因的CDS区序列，生物信息学分析表明，QDPR蛋白为细胞质内、无信号肽、存在两个跨膜区的酸性不稳定蛋白质。qRT-PCR检测QDPR基因在不同性别乌蒙凤鸡组织中的表达，其内脏组织中的表达量均高于肌肉组织，随时间增长，公鸡各组织中QDPR基因表达总体呈现出先升后降的趋势，母鸡为先降后升。本试验为揭示QDPR在不同性别鸡生长发育过程中的调控提供一定基础数据。
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