畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (5): 1163-1166. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.05.028    PDF    
引用本文
李娟, 王利, 罗晓林, 官久强, 安添午, 张翔飞. 牦牛AIF-1蛋白表达及对巨噬细胞炎性因子mRNA的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(5): 1163-1166.  
LI Juan, WANG Li, LUO Xiaolin, GUAN Jiuqiang, AN Tianwu, ZHANG Xiangfei. Expression of Yak AIF-1 Protein and Its Effect on mRNA of Inflammatory Factors in Macrophagocyte[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(5): 1163-1166.  
牦牛AIF-1蛋白表达及对巨噬细胞炎性因子mRNA的影响
李娟1, 王利1, 罗晓林2, 官久强2, 安添午2, 张翔飞2     
1. 西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部和四川省重点实验室, 成都 610041;
2. 四川省草原科学研究院, 成都 611731
收稿日期：2019-10-25
基金项目：国家十三五重点研发计划项目（2018YFD0502304）；国家肉牛牦牛产业技术体系（CARS-37）；四川省科技支撑计划（16ZC2530）；第二次青藏高原综合科学考察研究项目（2019QZKK0302）；四川省留学人员科技活动择优资助项目（2019）；西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（2020NYB30）
作者简介：李娟(1995-), 女, 四川西昌人, 硕士生, 主要从事动物遗传学研究, E-mail:1134323458@qq.com.
通信作者：王利, 主要从事动物免疫学研究, E-mail:qinxin916@aliyun.com; 罗晓林, 主要从事动物遗传育种与繁殖研究, E-mail:Luoxl2004@sina.com.
摘要：旨在对牦牛同种移植炎症因子-1（allograft inflammatory factor-1，AIF-1）蛋白进行原核表达、纯化，并探讨其对巨噬细胞炎性因子的影响。采用q-PCR检测AIF-1基因在牦牛5种组织中的表达量，构建原核表达载体表达纯化AIF-1蛋白，q-PCR检测小鼠巨噬细胞4种炎性因子的表达量。结果表明，AIF-1基因在麦洼牦牛脾中表达水平最高，极显著高于其它组织（P < 0.01）。表达并纯化出约29.47 ku的AIF-1重组蛋白，1.0、10.0、100.0 μg·mL-1 AIF-1蛋白均能促进小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的表达。这表明AIF-1在巨噬细胞免疫应答中发挥着一定作用，为深入研究牦牛AIF-1功能提供参考。
关键词：同种移植炎症因子-1    原核表达    巨噬细胞    炎性因子    
Expression of Yak AIF-1 Protein and Its Effect on mRNA of Inflammatory Factors in Macrophagocyte
LI Juan1, WANG Li1, LUO Xiaolin2, GUAN Jiuqiang2, AN Tianwu2, ZHANG Xiangfei2     
1. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Ministry of Education and Sichuan Province Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China;
2. Sichuan Academy of Grassland Sciences, Chengdu 611731, China
Corresponding author: WANG Li, E-mail:qinxin916@aliyun.com; LUO Xiaolin, E-mail:Luoxl2004@sina.com.
Abstract: The objective of this study was to express the allograft inflammatory factor-1 (AIF-1) of yak in E.coli BL21(DE3) and investigate its effect on mouse macrophages. The expression levels of AIF-1 gene in 5 tissues of yak were detected by q-PCR. A prokaryotic expression vector was constructed to express and purify AIF-1 protein. The expression levels of 4 inflammatory factors in mouse macrophages were detected by q-PCR. The results showed that the expression level of AIF-1 gene was the highest in the spleen of Maiwa yak, which was extremely significantly higher than those in other tissues (P < 0.01). Recombinant protein of approximately 29.47 ku was expressed and purified. The expression levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and iNOS in mouse macrophages were promoted by 1.0, 10.0 and 100.0 μg·mL-1 of AIF-1 protein. The results indicated that AIF-1 played a role in the immune response of macrophages. This article will be benefit for further study on the function of yak AIF-1.
Key words: allograft inflammatory factor-1    prokaryotic expression    macrophage    inflammatory factor    

同种移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1，AIF-1)是一种受干扰素γ诱导的钙离子结合蛋白[1-2]，主要介导炎症反应、移植排斥及细胞凋亡等过程[3-5]。体内巨噬细胞在炎性因子刺激下被激活，分泌细胞因子参与炎症反应[6]。此外，AIF-1还参与了动脉粥样硬化、糖尿病以及恶性肿瘤等疾病的发生[7]。目前，AIF-1在高原哺乳动物中研究尚少，王利和唐懿挺[8]仅对牦牛AIF-1基因进行了克隆分析。牦牛是我国高原特有珍稀牛种，对极端环境有极强适应性[9]。本研究旨在对牦牛AIF-1进行蛋白表达和功能初步探究，为深入研究AIF-1功能提供参考资料，也为探讨牦牛抗病育种分子机制积累科学数据。

1 材料与方法 1.1 试验动物与主要试剂

四川红原县健康2.5~3.0岁麦洼牦牛，昆明小鼠购自四川省成都市中医药研究所。BL21(DE3)购自宝生物工程(大连)有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；内毒素去除试剂购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司。β-actin引物F：CTTCGAGCAGGAGATGGC，R：CCGTGTTGGCGTAGAGGT；AIF-1引物F：CAAAGCAGGGATTTACAGG，R：CTCCGTTT-CCATTCAGGTC；炎性因子引物参考文献[10]设计。

1.2 RNA提取及AIF-1基因组织表达谱检测

对牦牛心、肝、脾、肺、肾进行RNA提取，检测RNA提取质量及完整性，进行反转录后于-20 ℃保存。以β-actin为内参，q-PCR检测AIF-1在麦洼牦牛心、肝、脾、肺和肾中的表达量。10 μL体系：上下游引物均为0.8 μL，cDNA模板1 μL，TB Green 5.2 μL，ddH2O 2.2 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，温度梯度50~55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，39个循环。每个样本重复检测3次，2-△△Ct法分析q-PCR结果，SPSS24.0分析显著性。

1.3 原核表达载体的构建与表达

用Kpn I和EcoR I对pET-32a(+)质粒和目的片段进行双酶切，连接转化到DH5α中，重组质粒转化至BL21(DE3)，鉴定并保存菌种。菌种活化后加入终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG，37 ℃诱导6 h，SDS-PAGE检测。

1.4 蛋白纯化与Western blot

菌种诱导后，按说明书对AIF-1蛋白进行纯化，BCA蛋白定量试剂盒进行浓度测定。用内毒素去除试剂去除蛋白中的内毒素，测定浓度低于1 EU·mL-1可用于后续试验。抗His标签鼠单克隆抗体作为一抗(1:4 000)，山羊抗小鼠IgG作为二抗(1:10 000)对纯化蛋白进行鉴定。

1.5 q-PCR检测炎性因子表达

小鼠巨噬细胞进行分离培养后，用AIF-1蛋白处理。对照组不加AIF-1蛋白，试验组分别加入1.0、10.0、100.0 μg·mL-1 AIF-1蛋白，相同条件处理24 h。收集细胞进行RNA提取，制备cDNA，q-PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的mRNA表达量。

2 结果 2.1 AIF-1基因组织表达谱

提取的RNA无降解，A260 nm/A280 nm比值均为1.8~2.2范围内。q-PCR结果显示(图 1)，牦牛AIF-1基因在5种组织中均有表达，脾和肝中的表达量极显著高于心、肺和肾(P＜0.01)，且脾中表达量极显著高于肝(P＜0.01)。

不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01) Different capital letters mean extremely significant difference (P < 0.01) 图 1 AIF-1基因在牦牛不同组织中的表达 Fig. 1 Expression levels of AIF-1 gene in different tissues of yak
2.2 AIF-1蛋白原核表达、纯化及鉴定

重组质粒pET-32a-AIF-1构建成功(图 2A)。成功诱导出约29.47 ku的AIF-1重组蛋白(图 2B)，AIF-1蛋白纯化结果详见图 2C。重组AIF-1蛋白能被抗His标签鼠单克隆抗体识别并结合，说明成功表达出目的蛋白。对蛋白进行内毒素去除，内毒素含量为0.85 EU·mL-1，符合下一步试验要求。

A.重组质粒双酶切鉴定:M.DNA相对分子质量标准DL2000；1.酶切验证；2.pET-32a-AIF-1质粒。B.蛋白表达：M.蛋白相对分子量标准；1.未诱导；2.1 mmol·L-1 IPTG诱导。C.蛋白纯化：M.蛋白相对分子量标准；1~3.1~3管蛋白 A. Double-enzyme identification of recombinant plasmid; M. DL 2000 DNA marker; 1. Enzyme digestion verification; 2. pET-32a-AIF-1 plasmid. B. Protein expression: M. Protein marker; 1. Not induced; 2.1 mmol·L-1 IPTG induced. C. Protein purification: M. Protein marker; 1-3.1 to 3 tube proteins 图 2 重组质粒鉴定及蛋白表达纯化 Fig. 2 Identification of recombinant plasmid, expression and purification of protein
2.3 炎性因子mRNA表达

小鼠巨噬细胞IL-1β表达量在1.0 μg·mL-1的AIF-1蛋白处理下极显著增(P＜0.01)。IL-6表达量在1.0和10.0 μg·mL-1的AIF-1蛋白处理下均极显著增加(P＜0.01)。TNF-α表达量在1.0、10.0 μg·mL-1的AIF-1蛋白处理下极显著增加(P＜0.01)，在100.0 μg·mL-1的AIF-1蛋白处理下显著增加(P＜0.05)。iNOS表达量在1.0、10.0、100.0 μg·mL-1的AIF-1蛋白处理下均极显著增加(P＜0.01)，详见图 3。

对照组.未添加AIF-1蛋白；试验组1.1.0 μg·mL-1 AIF-1蛋白；试验组2.10.0 μg·mL-1 AIF-1；试验组3.100.0 μg·mL-1 AIF-1蛋白；*.P＜0.05，**.P＜0.01 Control group. No AIF-1 protein was added; Test group 1.1.0 μg·mL-1 AIF-1 protein; Test group 2.10.0 μg·mL-1 AIF-1; Test group 3.100.0 μg·mL-1 AIF-1 protein; *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 3 AIF-1对巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS表达的影响 Fig. 3 Effect of AIF-1 on the expression levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and iNOS in macrophages
3 讨论

本试验发现, AIF-1基因在牦牛脾中表达量最高，这与王利和唐懿挺[8]对牦牛组织进行半定量结果一致。由于脾含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，AIF-1基因主要由巨噬细胞和激活的T淋巴细胞表达[11]，并且AIF-1是在巨噬细胞激活作用过程中调整免疫反应的基因[12]。巨噬细胞在组织中执行促炎或抗炎功能[13]，在AIF-1蛋白刺激下巨噬细胞IL-β分泌可能协调了AIF-1蛋白参与的炎性反应。本试验中，AIF-1蛋白对IL-1β和TNF-α基因表达都有促进作用，IL-1β表达量增加可能是由于TNF-α的表达量增加所引起。牦牛AIF-1蛋白刺激小鼠巨噬细胞分泌大量炎性因子引起炎症反应，说明该蛋白通过与IL-1、IL-6和TNF-α等炎性因子之间的相互调节，发挥其在炎症通路中的重要作用。iNOS基因表达受到IL-1β、IL-6和TNF-α等刺激物的控制[14]，所以其表达量增加。本试验表明，牦牛AIF-1在巨噬细胞中具有促进免疫的作用，说明AIF-1蛋白可能在牦牛抗病机制中发挥一定的作用，为牦牛抗病育种分子机制研究提供参考。

4 结论

AIF-1基因在麦洼牦牛脾中表达量最高。AIF-1蛋白被成功表达和纯化，并能促进小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的mRNA表达。

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