2. 吉林大学动物医学学院, 长春 130062
2. College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China
产β-内酰胺酶是细菌针对β-内酰胺类药物主要的耐药机制之一，其中超广谱β-内酰胺酶(extened-spectrum β-lactamases, ESBLs)具有突出的水解活性并由革兰阴性菌编码产生，它的出现加剧了细菌对该类药物的耐药性[1]。在如今复杂的耐药背景下，有必要对阳性菌也进行ESBLs的检测，从而更全面地解释金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)日益凸显的耐药问题。据报道，仅TEM型β-内酰胺酶通过氨基酸突变，就已衍生出超过220余种；这些酶在蛋白序列上并无太大区别，但个别氨基酸突变引起的水解活性变化呈现出数千倍的差异[2]。由此观之，耐药性的研究已不能仅停留在传统耐药机制存在与否的检测上，应关注β-内酰胺酶与药物作用的具体机制；更加精细地分析耐药性的变化[3-4]。此外，药物的不合理使用能够加快耐药基因的产生和富集，但合理用药同样会造成选择压力，不可避免地引起细菌耐药[5]。所以，分析β-内酰胺酶在选择压力下发生的协同进化，能更好地了解耐药性的发生与发展[6-7]。本研究通过药敏试验测定分离获得的牛源SA对β-内酰胺类药物的耐药率；以PCR方法检测blaZ基因及ESBLs相关基因；借助生物信息学及分子模拟技术，分析所检出β-内酰胺酶BlaZ的进化规律及其作用方式，并对现有抑制剂进行抑制活性的理论评价；以期解释试验出现的现象并探究影响作用活性的因素，进而为宁夏地区SA的防控提供一定理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验菌株牛源SA菌株分离自2016—2018年，宁夏石嘴山市、银川市、吴忠市、中卫市等地区部分奶牛养殖场临床及亚临床型乳房炎乳样；SA标准株ATCC29213和ATCC25923购自中国药品与生物制品检定所。
1.1.2 培养基及试剂氨苄西林、青霉素G、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢噻呋5种β-内酰胺类药物购自中国兽医药品监察所；MHA琼脂和MHB肉汤购自北京陆桥技术有限公司；DNA Marker和高保真PrimeSTARⓇ Max DNA Polymerase购自TaKaRa(大连)公司；2×Taq PCR Master Mix购自南京诺唯赞公司；GelRedTM购自美国BIOTIUM公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)公司。
1.2 方法 1.2.1 药敏试验对分离获得的261株SA采用微量肉汤稀释法测定5种β-内酰胺类药物的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC)。稀释菌液至1×108 CFU·mL-1，在96微孔板中将所用药液倍比稀释，随后加入稀释菌液至100 μL；以不含药物的菌液作阳性对照，空白培养基作阴性对照，参照CLSI (2018)标准[8]判定结果。
1.2.2 基因组DNA提取参照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，对提取条件优化如下：离心收集OD600 nm=1.0的菌液，加入250 μL试剂盒中Solution Ⅰ重悬细菌沉淀，加入浓度为20 mg·mL-1的溶菌酶250 μL，置于37 ℃作用2 h，可有效提高抽提的浓度和质量。
1.2.3 β-内酰胺酶基因检测以基因组DNA为模板进行blaZ基因扩增，并以高保真酶扩增8个均以青霉素为优先底物且在SA中较少报道的ESBLs基因，blaTEM-1[9]、blaCTX-M[10]、blaSHV[11]、blaOXA-2[12]、blaOXA-10[13]、blaVEB[14]、blaPER[15]和blaGES[16]。将扩增产物送至生工生物(上海)股份有限公司测序，结果利用NCBI网站BLAST工具进行序列比对。
1.2.4 进化分析利用进化踪迹服务器(evolutionary trace sever, ETS) (http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~jiye/evoltrace/evoltrace.html)分析宁夏地区检出BlaZ的进化情况；进一步借助ET Viewer(http://evolution.lichtargelab.org/ETviewer)寻找关键氨基酸；利用软件MEGA 7.0及HyPhy(http://www.hyphy.org/)分析氨基酸密码子的进化压力，计算氨基酸位点的非同义替换(non-synonymous substitution, dN)与同义替换(synonymous substitution, dS)，以dN/dS比值评估每个位点所受的选择压力和变异度的大小及趋势[17-18]；利用软件ClustalX 1.83和MEGA 7.0构建系统进化树。
1.2.5 结构预测利用在线软件Predict Protein(http://www.predictprotein.org/)预测二级结构和氨基酸的溶剂可及性(solvent accessibility)；借助软件Discovery studio 2.5，SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)网站及Consurf Web Serve(http://consurf.tau.ac.il/)进行同源模建及保守性分析，将氨基酸的保守性和溶剂可及性映射到酶结构中；使用PyMOL ETV(http://mammoth.bcm.tmc.edu/traceview/HelpDocs/PyETVHelp/)预测与配体作用的区域及位点；同时，借助在线软件ExPASy中的程序ProtScale (http://us.expasy.org/tools/protparam.html)和Compute PI/MW (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)对其进行理化性质分析。
1.2.6 结构对比为比较BlaZ与TEM-1及头孢菌素水解活性突出的TEM-52的结构差异，从RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)数据库下载TEM-1(1BTL)和TEM-52(1HTZ, Chain A)的PDB文件，利用软件PyMOL和SWISS-PDB Viewer将三者的结构进行叠合，测量变构部位原子间的偏移距离；同时辅以构象阻挫服务器AWSEW-MD Frustratometer (http://bonarda.qb.fcen.uba.ar/)以能量分布反映结构的稳定性[19]。
1.2.7 分子对接从网站PubChem Compound(www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)和ZINC(http://zinc.docking.org/)获取β-内酰胺类药物和抑制剂的结构文件；对接前先进行BlaZ、TEM-1和TEM-52的动力学模拟，进行能量最小化；随后，借助分子对接软件CovalentDock(http://covalent.docking.org/)，Ledock，Autodock Vina进行半柔性及柔性分子对接；选取低结合能兼顾构象高度契合的作为最佳结果。
1.2.8 分子动力学模拟比较分析BlaZ、TEM-1及TEM-52的结构差异，进而研究结构改变对功能产生的影响；利用在线服务器CABSflex 2.0 Server(http://biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSflex2)及NIMsim Server(http://cpclab.uni-duesseldorf.de/nmsim/)对三者进行粗粒化分子动力模拟。为进一步研究BlaZ与药物分子形成复合物前后，以及与不同药物分子结合时构象的运动情况。使用软件GROMACS 2018进行100 ns的全原子动力学模拟，依次分析BlaZ，BlaZ-氨苄西林及BlaZ-头孢噻呋复合物的结构稳定性。以均方根偏差(RMSD)表示分子结构变化的程度，衡量体系的稳定性；以均方根波动(RMSF)反映分子中各原子运动的自由度；利用IBM SPSS 20.0进行统计分析，以P＜0.05作为具有统计学差异的判断标准。
2 结果 2.1 药敏试验从2016—2018年间分离的SA菌株中，每年各取87株进行药敏试验；5种β-内酰胺类药物的耐药率和MIC值如图 1所示，氨苄西林耐药率最突出，为79.74%，青霉素为78.54%。但对头孢菌素类药物表现较敏感，其中头孢唑啉和头孢氨苄耐药率分别为24.52%和15.33%；第Ⅲ代头孢菌素头孢噻呋的耐药率略高于第Ⅰ代的头孢唑啉。同时，将5种药物的MIC值绘制成热力图，以色块深浅表示MIC值大小；可观察到较多的菌株针对青霉素类药物具有较高水平的MIC值，头孢菌素类药物中头孢氨苄的MIC值普遍高于头孢唑啉和头孢噻呋。
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图 1 5种β-内酰胺类药物的耐药率和MIC值热力图 Fig. 1 Resistant rate and thermal map of MIC values of 5 β-lactams |
共检测261株牛源SA，如图 2所示，PCR扩增出片段大小为861 bp的blaZ基因(图 2A)和931 bp的blaZTEM-1基因(图 2B)；同时，blaZ基因检出率为82.37%，从SA中检测到blaZTEM-1基因，检出率为26.05%，其余7种ESBLs基因未检出。表明本地区SA普遍携带blaZ耐药基因，并在SA中发现较少报道的blaZTEM-1基因。
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A. blaZ基因；B. blaZTEM-1基因；Ⅰ~Ⅴ、1~6泳道.扩增的部分基因；+. ATCC29213(阳性对照)；-. ATCC25923(阴性对照) A. blaZ gene; B. blaZTEM-1 gene; Ⅰ-Ⅴ lanes, 1-6 lanes. Partially amplified gene; +. ATCC29213 (positive); -. ATCC25923 (negative) 图 2 β-内酰胺酶基因检测结果 Fig. 2 Detection results of β-lactamase genes |
经系统进化分析可知，本地区检出的β-内酰胺酶BlaZ按照Ambler分类[20]属A型，与同属菌株产生的酶Q2FC38亲缘关系最近，与ESBLs中TEM-1及TEM-52具有较近亲缘关系且进化程度高于两者；检验所构建进化树的自展值(bootstrap)，如图 3所示，说明BlaZ所在的分支可信度高。ETS及ET Viewer分析可知，BlaZ含有63个重要且承受进化压力的踪迹残基(importance score＜25%)；ET聚类分析并打分，该值越小，该位点在进化过程中的可变性就越小，其对蛋白质的重要性就越大(表 1)。为进一步探究所受进化压力大小，基于最大似然法的密码子替换计算氨基酸密码子的同义突变(dS)和非同义突变(dN)，其中dN/dS>1，表阳性选择；dN/dS=1，表中性选择或属自然进化；dN/dS < 1，表净化选择。dN/dS比值越大，则所受选择压力越大。发现存在净化选择的位点占70.78%，中性选择占6.27%，进化踪迹分析获得的重要踪迹残基均属阳性选择位点，表明这些氨基酸的编码基因受到较大的进化压力。
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标尺为序列差异的分支长度；树分支上的数字为自展值(bootstrap) Bar indicate nucleotide divergence; Numbers at the nodes indicate the bootstrap values 图 3 β-内酰胺酶BlaZ的进化分析 Fig. 3 Evolutionary analysis of β-lactamases BlaZ |
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表 1 BlaZ中重要性和进化压力大小分级位于前25%的氨基酸残基 Table 1 The first 25% of the residues in BlaZ are classified by importance and evolutionary pressure |
β-内酰胺酶BlaZ的二级结构如图 4A所示，包含α-螺旋(39.50%)、β-折叠(9.25%)及环(loop)区域(51.25%)；溶剂可及性分析知，54.36%氨基酸处于内部(buried)，37.98%氨基位于表面(expoesd)，值得注意的是保守性氨基酸大多位于表面，推测将参与BlaZ功能的发挥。图 4B所示，比对发现，BlaZ与1BLC (PDB ID)的Lys31-Phe287序列完全相同，相似性为89.55%。与多数A型β-内酰胺酶一样，BlaZ具有Ser70活性位点中心，在识别和催化底物的过程中，起到决定性作用。存在4个相对保守的序列，序列Ⅰ：Ser70-Thr71-Ser72-Lys73(STSK)，存在于催化腔的底部；序列Ⅱ：Ser130-Asp131-Asn132(SDN)，构成催化腔的一个侧面；序列Ⅲ：Lys231-Ser232-Gly233(KSG)，构成催化腔的另一个侧面；序列Ⅳ：Asn161-Pro180(Ω-loop)，构成的空腔即为BlaZ的“结合腔”(binding cavity)，其中氨基酸高度保守并参与药物分子的催化水解。腔体入口除存在Ω-loop，还有Tyr238-Ala239-Ser240-Arg241-Asn242-Asp243构成的238-loop，能够影响药物进入腔内。同时，Ser70的-OH和-NH基团参与形成氧负离子穴(oxyanion hole)，作用于水解反应的乙酰化与去乙酰化过程。BlaZ整体等电点(pI)为9.55，其结合腔pI值为5.90，且大多为亲水性氨基酸。
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图 4 β-内酰胺酶BlaZ的结构预测 Fig. 4 Structure prediction of β-lactamase BlaZ |
将BlaZ、TEM-1及TEM-52结构叠合(图 5A)，BlaZ中在药物结合过程中发挥重要作用的Ω-loop，238-loop区域与后两者出现构象差异，而TEM-1与TEM-52构象重合度较高。在BlaZ的Asn161、Glu168、Asn170、Ala238、Ile239、Ala242等位点出现2.0~4.7 Å的偏移。如图 5C、D所示，借助NMsim和CABSflex 2.0服务器对三者进行的粗粒化动力学模拟显示，BlaZ结构的RMSD值整体低于TEM-1和TEM-52，反映出整体结构柔性较小；其RMSF值与TEM-1和TEM-52相比，呈现出统计学差异(P＜0.05)，其中Ω-loop区域波动差异明显。值得注意的是，BlaZ的238-loop与TEM-52相似，趋于远离Ω-loop，使结合腔的开放性增加。构象阻挫分析显示(图 5B)，BlaZ的Ω-loop与238-loop区域之间的最小阻挫少于TEM-1和TEM-52，且Ω-loop内部阻挫度低于后两者，表明两个loop区域的相对位置可能出现变化。同时，TEM-52出现的突变引起Ω-loop区域内部阻挫度升高，提示该变化将影响酶的生物学行为和功能；构象阻挫度越高时，表明该区域的变构程度越高，也为产生水解优势构象提供更多可能。
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图 5 3种β-内酰胺酶结构对比及稳定性分析 Fig. 5 Structural comparison and stability analysis of three β-lactamases |
氨苄西林等5种药物依次与BlaZ、TEM-1和TEM-52进行柔性对接，结果显示：药物分子大多与β-内酰胺酶的Ser70、Ser130等氨基酸结合；其中氢键作为稳定配体与受体形成复合物的重要作用力，其数目与复合物的稳定性呈正相关；结合能反映β-内酰胺酶与药物分子结合的难易程度。如表 2所示，青霉素类药物形成的氢键数目多于头孢菌素类；同时，具有较低的结合能。青霉素类药物与BlaZ、TEM-1和TEM-52的结合能相近，但头孢菌素类只有与TEM-52结合时才表现出较低的能量。由此可知，青霉素类药物较头孢菌素类更易与3种β-内酰胺酶结合且结合活性相差不大，但头孢菌素类药物更易与TEM-52结合。
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表 2 5种β-内酰胺类药物与BlaZ, TEM-1和TEM-52的对接能量及作用力 Table 2 Docking energy and forces of five β-lactams with BlaZ, TEM-1 and TEM-52 |
为进一步分析BlaZ与药物分子结合前后构象的动态变化与耐药的关系，对BlaZ、BlaZ-氨苄西林及BlaZ-头孢噻呋复合物进行全原子动力学模拟(图 6A)，结果显示：未结合药物分子的BlaZ具有较大RMSD值(mean=2.14 ű0.28 Å，max=2.78 Å)，结构柔性也相对较大，区别于复合物体系中的BlaZ (P＜0.05)。显然，药物分子与BlaZ催化腔内的活性氨基酸结合，影响其结构的动力学变化。同时，BlaZ与氨苄西林(mean=1.61 ű0.14 Å，max=2.01 Å)结合前后的RMSD值具有显著性差异(P < 0.01)，与头孢噻呋结合前后的RMSD值无差异。同时，BlaZ-氨苄西林复合物中BlaZ的RMSD值与BlaZ-头孢噻呋复合物(mean=1.94 ű0.17 Å，max=2.44 Å)中的具有统计学差异(P＜0.05)。由于结合形成的复合物越稳定，其结构的变化程度越小；由此可知，BlaZ与氨苄西林结合的稳定性高于头孢噻呋。另外，分析动力学模拟第100 ns数值，发现BlaZ-氨苄西林复合物中BlaZ的RMSD值依然小于BlaZ-头孢噻呋复合物中的；这一发现与分子对接结果一致，即氨苄西林较头孢噻呋更易与BlaZ结合并能稳定其空间构象。图 6B所示，与BlaZ形成复合物时，氨苄西林在结合腔内构象稳定，变构程度小；而头孢噻呋变构程度大，同样可反映两者与BlaZ结合的难易程度及稳定性差异。
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图 6 BlaZ与氨苄西林和头孢噻呋结合的分子动力学分析 Fig. 6 Molecular dynamics analysis of the combination of BlaZ with Ampicillin and Ceftiofur |
将β-内酰胺酶抑制剂分别与BlaZ进行半柔性分子对接，以结合能及氢键数目比较分析各类抑制剂的理论抑制活性。结合所需能量越低，表明抑制剂越易与酶结合；形成的氢键越多，则复合物越稳定。如表 3所示，抑制剂大多与BlaZ的Ser70、Ser130、Glu166、Ser235、Gln237、Val244等氨基酸形成氢键，同时存在范德华力、疏水作用力、溶剂化作用力等。根据结合总能量可知，结合活性呈现出：阿维巴坦>他唑巴坦>溴巴坦>克拉维酸>舒巴坦。此外，Ser70、Ser130、Val244等作为重要的结合位点，对氢键形成的贡献最大。
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表 3 抑制剂与β-内酰胺酶的对接能量及作用力 Table 3 Docking energy and forces of inhibitors with β-lactamases |
产β-内酰胺酶是细菌针对β-内酰胺类药物主要的耐药机制，此次药敏试验表明，分离到的牛源SA对青霉素类药物表现出高度耐药，但对头孢菌素较敏感；该结果提示我们需要深入分析其中的原因。本研究从基因组DNA中检测到blaZ基因，并检出SA中较少报道的blaZTEM-1基因，表明编码β-内酰胺酶的基因除基因组携带外，还可通过质粒等可移动元件转移而外源性获得。同时，ESBLs的存在，一定程度上增强了本地区SA对β-内酰胺类药物的耐药性[21]；也说明ESBLs的检测已不再仅限于革兰阴性菌。此外，细菌可通过摄取并整合耐药基因而快速获得耐药能力[22]，因此，耐药基因的监测更应被重视。
药物造成的选择压力引起β-内酰胺酶协同进化，不断产生与之相适应的变化。通过进化踪迹和选择压力分析，将同源酶进行聚类并关联与本地区检出的β-内酰胺酶BlaZ相关的酶[6]，分析进化中氨基酸残基或某些区域所承受选择压力的大小及发生变化的可能性[23]，进而了解BlaZ的结构及功能特征。研究发现，与各类ESBLs相比，BlaZ与TEM-1和TEM-52的亲缘关系最近，所包含重要且承受一定进化压力的63个氨基酸，映射到三维结构上时，发现与活性中心及结合腔的构成密切相关且高度保守；其中39.68%分布于表面，53.97%位于内部。表明这些氨基酸在分子进化过程中用以维持结构稳态和利于水解的构象[24]。同时，强阳性选择位点主要包含结合活性位点和Ω-loop以及238-loop区域等，在进化过程中也承受着较大压力[25]，而重要性分级低的氨基酸承受的进化压力小，这对β-内酰胺酶的耐药性具有一定指示作用，有助于更清楚地了解伴随药物选择压力耐药性的发生与发展。
β-内酰胺酶在发挥功能时结构不断变化，结构柔性越大，则可产生更多利于水解的优势构象，其中关键区域的柔性也将影响酶与药物的结合[9, 26-27]。对BlaZ，TEM-1及TEM-52进行的粗粒化动力学模拟显示BlaZ整体柔性最小，TEM-52结构柔性最大，且BlaZ的Ω-loop区域柔性小于后两者。试验发现Ω-loop区域柔性增加，可增强对药物的结合活性，这与Hart等[28]的报道一致，即Ω-loop区柔性增强，可减小药物进入结合腔时的空间位阻，使原本具有较大取代基的头孢菌素更易进入结合腔而发生水解反应；由此可知，Ω-loop区域的柔性与水解活性呈正相关，同时，Ω-loop和238-loop能改变结合腔入口的大小，两区域之间的能量阻挫变化可反映相对位置的变构情况，发生的变化也将影响药物进入结合腔。
另外，氨苄西林和青霉素G能以较多的氢键和较低的结合能与BlaZ、TEM-1和TEM-52形成稳定的复合物，表现出较强的亲和力，也更易完成水解反应，这与药敏试验出现的高耐药率相契合。由于头孢菌素的六元氢化噻嗪环与β-内酰胺环骈合时，形成更小的环张力，故而比青霉素类药物更加稳定；同时，头孢菌素引入较大取代基的侧链，阻碍其进入β-内酰胺酶的结合腔发生水解而表现出较高敏感性[29]。结构叠合发现，BlaZ的238-loop与TEM-52相似，趋于远离Ω-loop，使结合腔的开放性增加，允许存在侧链位阻的头孢菌素进入结合腔[28]。尽管第Ⅲ代头孢菌素大多含有氨噻唑侧链，但与第Ⅰ代相比，并未形成更大的有效空间位阻。结合动力学分析，可知BlaZ与氨苄西林所形成复合物的稳定性高于头孢噻呋，也说明BlaZ能更好地与氨苄西林结合，但对于头孢噻呋并非这样。
克拉维酸作为经典的β-内酰胺酶抑制剂，可增强β-内酰胺类药物的抗菌作用。分子对接发现，克拉维酸与BlaZ以较高的能量结合，形成的氢键数目也较少，反映其不易与BlaZ的活性位点结合而发挥较弱抑制作用；尽管舒巴坦的结构稳定，但结合能高于克拉维酸，试验数据也显示舒巴坦的抑制作用明显弱于克拉维酸[30]。此外，阿维巴坦作为目前临床效果理想的β-内酰胺酶抑制剂[31]，在对接过程中呈现出最低的结合能且氢键数目较多，他唑巴坦与溴巴坦的能量相差不大；抑制剂若能更好地与BlaZ结合，也将有利于抑制作用的发挥。上述对接试验获得的理论计算结果，一定程度上反映了抑制剂与BlaZ结合的难易程度，也可为本地区的临床用药提供理论参考。
4 结论宁夏地区牛源SA产生的β-内酰胺酶BlaZ属A型，并从菌株中检出blaZTEM-1基因；BlaZ对青霉素类药物的结合活性高于头孢菌素且易于结合阿维巴坦等抑制剂，其中，Ω-loop区域的结构柔性是BlaZ与药物结合活性的重要影响因素。
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