猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是造成猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of swine, Mps)的主要病原。Mps是猪的一种慢性呼吸道疾病，在世界范围内流行^[1-2]，该病可以感染所有阶段的猪，包括乳猪和种猪^[3]，病猪主要表现为干咳，日增重和饲料转化率降低^[4-6]。猪群感染Mhp后呼吸道黏膜受损，使得病猪容易受到其他病原体[如猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, PM)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)]的继发感染，从而造成较高的死亡率^{[4, 7]}。该病原的流行给养猪业造成了严重的经济损失^[1]。

目前Mhp的防控手段主要是疫苗免疫，但是市场上的疫苗免疫效果均不理想^[8-11]，因此该病原在我国的养殖场中流行很广。为了有效控制该病原的流行，通过早发现来进行净化是最有效的方法。有报道称Mps的发病水平取决于Mhp黏附于呼吸道内纤毛上皮的能力^[12-13]。P97蛋白是Mhp发现较早且研究非常多的黏附蛋白^[14]，是一种重要的毒力因子，它含有R1和R2两个重复区域，在Mhp黏附宿主上皮细胞过程中起到了非常重要的作用^[15-17]，同时P97蛋白也是Mhp感染猪后最早产生抗体的抗原之一，其中R1区(P97R1)具有很强的免疫原性，在体内能刺激机体产生很强的抗体免疫应答反应^[12]，是目前发现的具有开发潜力的抗原区^{[15, 18]}。由于抗体检测方法简单方便且灵敏性好，广泛应用于猪场中Mps的检测与监控。目前已经建立起针对P97R1的SIgA-ELISA检测方法^[19]，SIgA在体内产生较早，但是持续时间短，不能对猪群的感染情况提供可靠的数据信息。有报道称猪感染Mhp后机体中针对P97R1的IgG抗体血清阳转率要比P46和P36早两周^[20]，由此建立了针对P97R1间接ELISA检测方法，但是间接ELISA检测方法发生交叉反应的机会较高，容易出现假阳性。对于Mhp的感染，最常用的血清学检测主要依赖于进口的ELISA检测试剂盒，因其价格昂贵，难以满足国内常规检测的需要^[21]，因此需要开发经济适用、便于推广的血清学检测试剂盒。阻断ELISA是一种高度特异性和敏感性的抗体检测方法，但是目前还没有可用的检测Mhp的阻断ELISA检测试剂盒。建立阻断ELISA方法的前提是制备一个很好的单克隆抗体(MAb)，该抗体在结合特异性抗原时能与感染或免疫Mhp猪血清中的抗体产生竞争关系。但是目前国内外还没有见到关于这样抗体的报道。在本实验室前期研究中，利用酵母展示技术筛选出P97蛋白中免疫原性最强的氨基酸序列，由于此段免疫原性最强的氨基酸序列包含了R1区，因此将其命名为P97CR1，利用原核表达的此段氨基酸序列成功制备了一株针对Mhp中P97蛋白的MAb，并且阻断ELISA试验初步研究结果显示该抗体与包被抗原结合时能被猪的Mhp阳性血清竞争性抑制，因此，该特异性单抗的制备为建立阻断ELISA检测方法奠定了坚实基础。

1 材料与方法 1.1 载体、菌株及主要试剂

原核表达载体pGEX-6P-1和pET-28a、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis, Mhr)、两份猪Mhp高免阳性血清、自然感染Mhp阳性血清、猪阴性血清、Mhp J株和SP2/0细胞均由本实验室保存；一份Mhp高免阳性血清由江苏农业科学院邵国青老师惠赠；PCV、PRRSV HuN4-F112株、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)及猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)活疫苗购自哈尔滨维科生物技术开发公司；E. coli DH5α和E. coli BL21(DE3)感受态细胞购自Yeastern Biotech公司；聚乙二醇(PEG)4000、HT培养基添加剂、HAT培养基添加剂、四甲基联苯胺(TMB)购自Sigma公司；DMEM培养基购自Hycolone公司；胎牛血清购自Gibco公司；FITC和HRP标记山羊抗小鼠IgG (FITC-IgG)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SBA Clonotyping System-HRP抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司；Anti-GST抗体购自Abcam公司；IRDye 700RD山羊抗小鼠IgG抗体购自LI-COR Bioscinece公司。

1.2 引物的设计合成和重组质粒的构建及重组蛋白的表达纯化分析

根据NCBI上Mhp J株P97基因序列(MHJ_RS01055)设计P97蛋白C端包含R1区(P97CR1)的特异性引物(如表 1所示)。将引物对P97CR1-F/R扩增出的PCR产物克隆到原核表达载体pET-28a上获得pET28a-P97CR1重组原核表达载体。pET28a-P97CR1转化到BL21(DE3)菌株中，在37 ℃下培养至OD_{600 nm}值为0.6~0.8时，加入终浓度为1 mmol ·L^-1的IPTG诱导表达6 h，然后收集菌体并进行超声破碎，10 000 r·min^-1离心后留上清，用Ni-NTA交联琼脂糖对目的蛋白进行纯化。使用UV法对目的蛋白进行浓度测定后-80 ℃保存备用。为逐渐截短P97CR1蛋白，根据P97CR1的基因序列设计特异性引物(见表 1)，用引物对P97CR1-F/R、P1-F/R、P2-F/R和P3-F/R进行PCR扩增，同时将其余引物对直接进行退火延伸得到目的片段，之后将这些目的片段克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上获得重组原核表达载体，这些重组原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中，参照上述方法进行诱导表达。

1.3 动物免疫

将纯化的目的蛋白P97CR1与等体积的完全弗氏佐剂混合，充分乳化后背部皮下多点注射6周龄雌性BALB/c小鼠5只(由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供)，每只小鼠免疫100 μg蛋白，然后每隔2周用等量不完全弗氏佐剂乳化的蛋白抗原加强免疫2次，剂量同首免。融合前5 d用等量的蛋白抗原加强免疫一次。

1.4 细胞融合及杂交瘤细胞的筛选

分离P97CR1蛋白免疫的小鼠脾细胞，然后与SP2/0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，离心去上清后加入PEG 4000介导脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。细胞融合后用含有HAT的DMEM选择培养基重悬，并加入到96孔细胞培养板中，然后于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养。当细胞集落长至细胞孔1/2~1/3时，采用间接ELISA方法对细胞上清进行检测及筛选，过程如下：将表达纯化的蛋白P97CR1作为ELISA包被抗原，用包被液(25 mmol ·L^-1碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至2.5 μg ·mL^-1，100 μL ·孔^-1加入酶标板中，37 ℃静置2 h，PBST洗涤3次，向抗原包被孔中加入250 μL ·孔^-15%脱脂乳，37 ℃封闭2 h，封闭后用PBST洗涤3次，吸水纸拍干，将100 μL细胞上清加入到包被孔中作为待检抗原，小鼠阳性血清(1:8 000稀释)作为阳性对照，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗(1:8 000稀释)，100 μL ·孔^-1，37 ℃作用30 min后弃去板中液体，PBST洗涤3次后加入100 μL ·孔^-1的TMB显色液，室温显色10 min后每孔加入50 μL 2 mol ·L^-1 H₂SO₄终止反应，然后在酶标仪上测定OD_{450 nm}值。将OD_{450 nm}值接近阳性对照孔中的细胞继续亚克隆3~4次，作为杂交瘤细胞，将筛选到的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，并放置液氮中保存。

1.5 腹水的制备、MAbs的纯化和标记

向13周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL不完全弗氏佐剂，一周后，将培养的阳性杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中，每只注射1×10⁵个细胞，当小鼠腹腔明显胀大时，通过注射器收集腹水。收集的腹水在10 000 r·min^-1条件下离心10 min，将上清转移到一个干净的离心管中，然后利用Protein G亲和层析法纯化上清中的抗体^[22]，通过UV法测定纯化的抗体浓度后，使用HRP标记试剂盒对抗体进行HRP标记^[23]。

1.6 MAbs的腹水效价测定及亚类鉴定

将“1.5”中制备好的腹水进行1 000倍稀释，然后2倍倍比稀释，按照“1.4”中间接ELISA检测方法进行腹水效价测定。同时采用SBA Clonotyping System-HRP抗体亚类鉴定试剂盒对腹水单抗进行亚类鉴定。

1.7 MAbs的特异性鉴定

按照常规方法将Mhr、PCV、PRRSV HuN4-F112株、PRV及CSFV活疫苗制备成全菌或全病毒抗原，与纯化的pET28a-P97CR1蛋白同时进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳，然后转印至硝酸纤维素膜(NC膜)进行Western blot分析，根据反应结果进行单抗特异性分析。

1.8 Western blot分析

将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜(NC)，然后用5%脱脂乳对转印好的NC膜室温封闭2 h，PBST洗涤三次。加入制备的A3 MAbs腹水(1:10 000稀释)作为一抗，室温孵育1 h，孵育完成后用PBST洗涤3次。然后加入IRDye 700RD标记的山羊抗小鼠IgG二抗，在室温下孵育40 min，孵育完成后用PBST洗涤3次。标记完的NC膜用Infrared Imaging Systems (Odyssey CLX)进行扫膜分析。

1.9 Mhp的流式分析

将Mhp J株培养至对数生长期，取2 mL，在15 000 r·min^-1条件下离心10 min收集菌体，用PBS洗涤3次，加入制备好的MAbs腹水，室温孵育60 min后离心，弃上清，然后用PBS洗涤3次。加入FITC标记的羊抗鼠IgG，在室温下避光孵育60 min后离心，弃上清，并用PBS洗涤3次。标记好的Mhp用500 μL的PBS重悬，并转移到流式管中，最后加入等体积的4%多聚甲醛进行固定，同时将只加二抗孵育的Mhp作为阴性对照。抗体标记后的Mhp在Cytomics FC 500中进行检测，然后用FlowJo软件进行分析。

1.10 阻断ELISA分析

将表达纯化的蛋白P97CR1作为ELISA包被抗原，用包被液(25 mmol ·L^-1碳酸盐缓冲液pH9.6)稀释至10 ng·mL^-1，100 μL·孔^-1加入酶标板中，37 ℃静置2 h，PBST洗涤3次，向抗原包被孔中加入250 μL·孔^-15%脱脂乳，37 ℃封闭2 h，封闭后用PBST洗涤3次。加入从1:2开始2倍倍比稀释的50 μL·孔^-1的Mhp阴性或阳性血清，37 ℃孵育30 min后再向每孔中加入上述制备的HRP标记的MAbs(1:8 000稀释)50 μL，37 ℃作用30 min后弃去板中液体，PBST洗涤3次后加入100 μL·孔^-1的TMB显色液，室温显色10 min后每孔加入50 μL 2 mol ·L^-1 H₂SO₄终止反应，然后在酶标仪上测定OD_{450 nm}值。

2 结果 2.1 P97CR1蛋白的原核表达及纯化

将Mhp P97CR1区编码基因插入到pET28a载体的BamHⅠ和NotⅠ酶切位点之间，获得的pET28a-P97CR1重组质粒通过BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，结果如图 1A所示，双酶切得到两个大小分别为5 337和453 bp的片段，与预期结果相符。进一步通过测序比对分析显示，插入的片段与NCBI公布序列100%一致。诱导表达的P97CR1如图 1B所示，P97CR1大小为25 ku左右，在37 ℃下部分可溶性表达。可溶性表达的蛋白通过Ni-NTA交联琼脂糖纯化后，纯度达到90%以上。

2.2 MAbs的制备、纯化及鉴定

P97CR1蛋白免疫的小鼠脾细胞与SP2/0融合后，筛选获得了一株能够稳定分泌抗P97CR1蛋白单抗的A3杂交瘤细胞株。经鉴定该Mab的重链为IgG1亚类，轻链为κ链。利用小鼠制备了该杂交瘤制备的腹水，经测定其效价为1.2×10⁷，之后对腹水中的MAbs进行了纯化，如图 2A所示，经纯化后的MAbs高度纯化。利用该单抗标记Mhp膜上表达的P97，通过流式细胞仪分析，如图 2B所示，该抗体明显识别Mhp膜表面的P97蛋白。在对A3 MAbs进行特异性检测的Western blot反应结果显示，A3 MAbs只和纯化的重组蛋白pET28a-P97CR1发生反应，而不与Mhr、PCV、PRRSV HuN4-F112、PRV及CSFV全菌或全病毒抗原发生反应(如图 2C)，表明A3 MAbs只和Mhp进行反应，具有较高的特异性。

2.3 A3 MAb的抗原表位鉴定

为了进一步确定A3 MAb在P97上的识别位点，首先将Mhp P97CR1蛋白分成P1(aa1-aa50)、P2(aa47-aa108)和P3(aa105-aa159)三段进行原核表达，然后利用纯化的A3 MAb对表达的蛋白进行Western blot分析，如图 3所示，A3 MAb仅与片段P1发生特异性结合。进一步将P1片段分成P11(aa1-aa12)、P12(aa9-aa24)、P13(aa21-aa36)和P14(aa33-aa50)4段并进行Western blot分析，结果显示A3 MAb识别位点位于P11段(图 3)。从N端逐个截短P11多肽片段，对截短的P11N1(aa1-aa11)、P11N2(aa1-aa10)、P11N3(aa1-aa9)、P11N4(aa1-aa8)、P11N5(aa1-aa7)、P11N6(aa1-aa6)和P11N7(aa1-aa5)7个片段进行原核诱导表达分析，结果显示当P11片段截短7个氨基酸时，抗体不再识别表达的多肽序列(图 3)，由此可见，A3 MAb识别的位点位于P11N6(aa1-aa6)片段中。从C端逐个截短P11N6序列，分别获得P11N6C1(aa2-aa6)和P11N6C2(aa3-aa6)片段，对这两个多肽进行表达分析显示A3 MAb不能与这两个多肽进行反应(图 3)，这些结果表明A3 MAb在P97上识别的精确氨基酸序列为LDDNLQ。将抗体识别序列与GenBank上公布的Mhp序列进行比对分析显示，该序列存在于所有已公布的猪肺炎支原P97中，因此该识别位点高度保守。

2.4 A3 MAb在阻断ELISA中的初步应用分析

为了初步验证该抗体是否能应用于Mhp的阻断ELISA检测，各取3份猪的Mhp高免血清(high immune sample 1-3)、3份自然感染Mhp的猪阳性血清(natural infected sample 1-3)和3份猪的阴性血清(negative sample 1-3)进行阻断ELISA检测，结果如图 4所示，随着稀释倍数的升高，阴性血清的OD_{450 nm}没有明显变化；而当阳性血清稀释倍数超过16时，OD_{450 nm}逐渐升高，说明随着稀释倍数的升高，阳性血清中能够与包被抗原结合的抗体减少，而越来越多剩余的抗原蛋白与HRP标记的MAbs结合，OD_{450 nm}逐渐增高。这些结果说明Mhp高免阳性血清和自然感染Mhp的猪阳性血清能够有效阻断抗P97CR1 MAbs与抗原蛋白的结合。

3 讨论

Mhp在养殖场中流行很广泛，是我国养猪业的一大威胁。及时准确地监测猪群体内Mhp的抗体动态对于了解猪群的免疫水平及感染状况具有重要意义。酶联免疫吸附试验(ELISA)是检测Mhp抗体水平最常用的方法，在多种ELISA方法中阻断ELISA检测方法不会受到包被抗原中杂蛋白的干扰，是特异性最好的方法之一^[24]。建立阻断ELISA的难点在于很难获得特异性的MAb。因为这个抗体不仅需要识别病原蛋白，而且它的识别位点在体内必须具有很强的免疫原性，病原感染猪后刺激机体产生免疫应答反应，当检测抗体时，血清中的抗体和单抗能竞争性的与抗原结合。因此制备合格的单抗是建立阻断ELISA方法的关键。

本研究中，作者选择P97CR1片段作为免疫原，是因为本实验室通过酵母展示文库筛选方法的研究表明该片段具有很强的免疫原性。同时，P97CR1片段中含有R1区，文献报道该区在感染猪体内具有很强的免疫原性^[8]。如表达P97中含有R1和R2区域C末端蛋白的腺病毒在猪体内可诱导产生特异性针对P97的体液免疫和细胞免疫应答^[25]。另有试验表明将大肠杆菌系统表达的包含胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)ApxⅢ N末端区域的缺失衍生物毒素(ApxN)和Mhp P97黏附素(P97C)的R1和R2重复区域的嵌合蛋白Ap97作为疫苗可有效减少Mhp和Ap对猪群的感染^[26]。通过口腔或者鼻内使猪群接种表达P97中含有R1和R2区域C末端蛋白的红斑丹毒丝菌能够降低由Mhp造成的肺损伤程度^[27-28]。而且在Mhp早期感染的血清和黏膜中，能够检测到针对P97R1区的特异性抗体^[20]。

在本研究中，作者成功筛选到了一株特异性识别P97CR1的MAb，通过Western blot检测显示该抗体对P97CR1的识别具有高度特异性，而且该抗体的识别序列是LDDNLQ，序列比对显示，虽然这段序列不在文献报道的R1区内，但是它具有高度的保守性，我们的结果显示该单抗与猪的主要病原Mhr、PCV、PRRSV HuN4-F112株、PRV和CSFV均不发生反应。但是，由于作者实验室缺乏猪滑液支原体(M. hyosynoviae)及猪絮状支原体(M. flocculus)，因此在本研究中没有通过直接试验验证该抗体与猪的这两种病原进行反应，作者通过生物信息法将该抗体识别的表位在NCBI上进行比对发现，其与这两种病原上的抗原均无同源性。由于该抗体能够用于流式分析，这一结果表明该抗体识别的位点位于P97蛋白分子的表面，可以用于基于流式分析技术的病原检测方法的开发应用。本文筛选出的单克隆抗体针对的抗原表位不在P97蛋白中免疫原性较强的R1区内，是因为作者免疫和筛选所用的抗原均为P97R1蛋白，因此该抗体筛选过程具有随机性。

由于A3 MAb识别的抗原表位在Mhp中高度保守，在自然感染中，如果该位点能在猪体内诱导产生抗体反应，则该抗体是用于建立阻断ELISA的理想抗体。从作者使用的Mhp高免血清和自然感染Mhp的猪阳性血清阻断ELISA结果来看，A3 MAb能够较好地阻断大部分Mhp阳性血清与包被抗原的结合，由此可见，该抗体具有建立Mhp阻断ELSIA血清学检测方法的潜力。临床经验显示，同一表位在不同猪的体内产生的抗体强度存在差异，由于此次检测的猪Mhp高免阳性血清和临床感染的血清样本较少，A3 MAb识别的表位在Mhp感染猪中展现出的免疫原性是否具有广谱性，还需要进一步的研究确定。

4 结论

本研究成功制备了一株特异性识别Mhp中P97的MAb，并确定了该抗体的精确识别位点。阻断ELISA初步试验结果证明Mhp阳性血清中的抗体能够阻断该MAb与抗原P97CR1蛋白的结合。这些研究结果为将来进一步在诊断领域的应用开发奠定了坚实基础。