单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm，下文简称单增李斯特菌)，是一种兼性胞内厌氧菌，在自然界中广泛分布，可通过多种途径传播，引起人和动物的感染，出现胃肠炎、脑膜炎、流产和败血症等症状^[1]，尤其对新生儿、妊娠母畜和免疫功能低下者易感，致死率可达20%~30%^[2]。单增李斯特菌可分为四个谱系(Lineage Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，具有菌体抗原和鞭毛抗原，这两种抗原组合可形成13个血清型，其中谱系Ⅰ包括血清型1/2b、3b、4b、4d和4e；谱系Ⅱ包括1/2a、1/2c、3a和3c；谱系Ⅲ包括4a、4c和非典型4b。感染人和反刍动物的单增李斯特菌主要为谱系Ⅰ的1/2b和4b，谱系Ⅲ和Ⅳ很少引起人和动物的发病^[3]。

近年来，欧美等国家频繁暴发李斯特菌感染事件^[2]。我国虽然没有暴发过大范围李斯特菌感染事件，但也时有散发病例，在临床病例和食品中均会检测到李斯特菌^[4]。基于李斯特菌为重要的食源性病原菌，我国已开展了食品中单增李斯特菌的监测，但当前国内的食源性李斯特菌感染状况依然不清。

本研究对一株分离自发病山羊脑的单增李斯特菌分离株进行血清型及分子分型、主要毒力因子鉴定、生长特性及对实验动物致病性的鉴定，为单增李斯特菌分离株的菌株分型和致病性提供数据支持，为李斯特菌病散发病例的流行和传播特征分析提供分子生物学基础, 对建立健全李斯特菌监测体系和风险评估意义重大。

1 材料与方法 1.1 菌株、培养基和试剂

单增李斯特菌参考菌株EGDe、M7和分离株CMG47均由本实验室保存。EGDe为单增李斯特菌参考菌株，属于谱系Ⅱ，1/2a血清型，具有较强的致病性和低溶脂溶血特性；M7为本实验室从牛奶中分离获得的菌株，属于谱系Ⅲ，4a血清型，具有低致病性和强溶脂溶血特性^[5]。

脑心浸液培养基(BHI)购自北京陆桥技术股份有限公司；API Listeria生化试纸条购自法国生物梅里埃股份有限公司；绵羊血购自杭州四季青生物工程材料有限公司；高保真酶2×phanta Max Master Mix、细菌总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司；2×PCR Mix和DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；核酸电泳染料Goldview购自上海赛百盛基因技术有限公司，SYRB Green购自东洋纺(上海)生物科技有限公司(TOYOBO)。

1.2 实验动物

50只SPF级ICR小鼠(18~22 g，雌性)，购自浙江中医药大学动物实验研究中心。斑马鱼由浙江大学彭金荣教授实验室惠赠。

1.3 细菌鉴定

患病山羊出现食欲减退、体重下降、呼吸困难，并表现出歪头、转圈和运动能力失调等神经症状。参照Dill和Rissi^[6]及唐慕德等^[7]的研究报道，将出现严重神经症状的山羊脑组织，注入专用培养瓶，革兰染色鉴定，并转接种于血平板，在35 ℃条件下进行血培养18~24 h后，根据染色、镜检和菌落特征并结合病畜临床症状，初步怀疑为李斯特菌感染。随后从分离培养的平板上挑取单菌落，参照API Listeria鉴定系统进行种别鉴定。

1.4 分离株血清型鉴定和谱系分析

采用热裂解法提取单增李斯特菌EGDe和分离株CMG47细菌基因组DNA，用于后续多重PCR鉴定分离株的血清型和谱系。参照Doumith等^[8]的方法，合成ORF2819、ORF2110、lmo0737、lmo1118和lmo1134的引物(表 1)，引物由深圳华大基因股份有限公司合成。反应条件：95 ℃30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 ~ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。根据表 2，通过多重PCR结果，确定分离株的谱系和血清型。

1.5 分离株多位点序列分型(MLST)

参照Jordan等^[9]发表的手册设计PCR引物，对单增李斯特菌管家基因(abcZ-bglA-cat-dapE-dat-ldh-lhkA)分别进行PCR扩增，用于分离株CMG47的多位点序列分型。将PCR产物纯化后，送至深圳华大基因股份有限公司进行测序。将7个管家基因的测序结果上传至L. monocytogenes的MLST数据库(http://bigsdb.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_listeria_seqdef_public&page=sequenceQuery)，得到该菌株7个等位基因型，并根据等位基因序列号获得菌株的ST型。

1.6 分离株毒力基因检测

以参考菌株EGDe和分离株CMG47的基因组DNA为模板，引物参照本实验室已发表的论文^[10]，对单增李斯特菌的主要毒力基因进行PCR检测，其中包括第一毒力岛(Listeria pathogenicity island 1, LIPI-1)上的6个主要毒力基因(prfA-plcA-hly-mpl-plcB-actA)、主要内化素基因(inlA-inlB)和应激调控基因sigB^[11]。反应条件：95 ℃30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30~55 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.7 分离株生长特性

分别挑取参考菌株EGDe和分离株CMG47的单菌落至BHI液体培养基中振荡培养12 h至稳定期。1:50转接至新鲜的BHI液体培养基，每个样品3个平行，BHI培养基做空白对照，置37 ℃培养，每1 h测一次OD_{600 nm}，连续监测12 h，绘制参考菌株与分离株的生长曲线。

1.8 分离株溶血和溶脂特性试验

参照本实验室建立的方法^[12]，向BHI培养基中加入10%的商品化绵羊血，配制绵羊血平板；无菌分离新鲜鸡蛋蛋黄，与等体积的PBS混匀，配制成蛋黄悬液，向BHI培养基中加入5%的蛋黄悬液，配制卵黄平板。用接种环分别接种过夜培养菌液于绵羊血平板和卵黄平板，37 ℃培养箱中培养12 h，观察参考菌株与分离株的溶血和溶脂现象。

卵磷脂特异性溶脂酶基因plcB和李斯特菌溶血素基因hly的表达水平通过荧光定量PCR检测，以管家基因gyrB作为内参基因。细菌总RNA抽提和cDNA合成方法均参照试剂盒说明书进行。荧光定量PCR引物序列(5′→3′)为gyrB：F:AGACGCTATTGATGCCGATGAAACT，R: AC-GTATTGCGCGTTGTCTTCGA，hly：F: CACCACCAGCATCTCCGCCT，R: GCGGCACATT-T GTCACTGCAT，plcB：F: TATCAAGCAACGGA-AGACATGGTAGC，R: CATTGACTATTTTCGG- GTAGTCCGC。引物由深圳华大基因股份有限公司合成，荧光定量PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40个循环；65~95 ℃每隔6 s检测熔解曲线，共71个循环。参照本实验室已发表的论文^[13]，用2^-ΔΔCT法计算菌株中hly和plcB基因mRNA的相对表达量。

1.9 小鼠存活试验及LD₅₀测定

参照本实验室建立的方法进行^[14]。选用4周龄ICR小鼠(18~22 g，雌性)。将参考菌株和分离株培养至OD_{600 nm}为0.25左右(约10⁸ cfu·mL^-1)，10倍倍比稀释后平板计数以确定实际接种量。每个菌株均设10¹、10²、10³和10⁴cfu·mL^-1 4个剂量组，每组10只小鼠，腹腔注射接种，每只接种0.2 mL，即每个剂量组分别接种2、2×10¹、2×10²和2×10³ cfu菌液。对照组10只小鼠按照相同方法注射相同体积的无菌PBS，连续观察10 d，每12 h记录一次死亡情况，绘制死亡曲线，并采用改良寇氏法计算分离株对4周龄雌性ICR小鼠的LD₅₀。

1.10 斑马鱼幼鱼存活试验

自然产卵并使用无菌培养系统进行孵化培养，获取无菌斑马鱼胚胎60尾，随机分为3组。将参考菌株和分离株培养至OD_{600 nm}为0.25左右(约10⁸ cfu·mL^-1)。参照本实验室建立的方法^[15]，将细菌样品经静脉注射至26 hpf (hours post fertilization)斑马鱼体内，每尾鱼接种剂量浓度为1.3 × 10⁸ cfu·mL^-1，注射菌液体积为1 nL，每尾鱼实际接种菌数为130 cfu，观察斑马鱼存活情况。以静脉注射斑马鱼胚胎培养液组作为对照，连续观察7 d，每12 h记录一次死亡情况，绘制死亡曲线。

1.11 数据分析

数据均采用SPSS17.0软件进行统计分析，通过单因素方差分析不同组间差异，P < 0.05表示统计学差异显著，P < 0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果 2.1 分离株谱系血清型分析

以EGDe作为参考菌株，利用PCR方法确定分离株的谱系和血清型。结果显示，谱系Ⅱ，1/2a血清型的参考菌株EGDe经PCR扩增出了691和367 bp的目的条带，与预期一致(表 2，图 1)。分离株CMG47的PCR扩增产物在471和367 bp处有特异性条带，参照EGDe的PCR扩增产物电泳条带，确定分离株CMG47属于谱系Ⅰ，血清型为1/2b。

2.2 分离株多位点序列分型(MLST)

将MLST分型方法应用于分离株CMG47的基因分型，通过分析单增李斯特菌7个管家基因的测序结果，获得各个等位基因的基因型(表 3)，进而确定分离株CMG47的ST型为619，为国内新出现的ST型^[16-21]。

2.3 分离株毒力基因分析

为探明分离株CMG47毒力的分子基础，对参考菌株EGDe和分离株CMG47的主要毒力基因、内化素基因以及应激调控基因(prfA-plcA-hly-mpl-plcB-actA-inlA-inlB-sigB)进行PCR扩增。结果显示，分离株CMG47中含有LIPI-1的完整毒力基因，包含6个主要毒力基因actA、hly、mpl、plcA、plcB和prfA ，两个内化素基因inlA和inlB以及应激调控基因sigB(图 2)，表明分离株CMG47具有潜在致病性和侵袭性。

2.4 分离株生长特性分析

与参考菌株EGDe相比，分离株CMG47在12 h内的生长趋势和生长速度与参考株相当(图 3)，未见显著性差异(P>0.05)，提示分离株具有正常的生长能力。

2.5 分离株溶血和溶脂特性分析

以本实验室分离到的强溶血溶脂菌株M7作为阳性对照^[22]，以无溶血溶脂活性的参考菌株EGDe作为阴性对照，用接种血平板和卵黄平板方法检测分离株CMG47的溶血溶脂活性，并进一步通过荧光定量PCR检测菌株中编码李斯特菌溶血素基因hly和卵磷脂特异性溶脂酶基因plcB的转录水平。溶血溶脂平板结果显示，与强溶血溶脂菌株M7相比，分离株CMG47和阴性对照EGDe的情况相似，溶血活性较弱(图 4A)，且未见明显的溶脂活性(图 4B)。

荧光定量PCR结果显示，强溶血溶脂菌株M7中hly和plcB基因的mRNA表达量均比分离株CMG47和阴性对照EGDe高出约200倍，差异极显著(P < 0.01)；分离株CMG47和阴性对照EGDe的hly和plcB转录水平差异不显著(P>0.05，图 4C、D)。荧光定量结果和体外试验观察到的溶血溶脂表型一致，表明分离株CMG47中编码李斯特菌溶血素基因hly和卵磷脂特异性溶脂酶基因plcB的表达水平较低。

2.6 分离株毒力分析

小鼠毒力试验结果显示，分离株CMG47和强毒株EGDe对ICR雌性小鼠的半数致死量分别为10^3.0和10^3.2 cfu·mL^-1。分离株CMG47在与强毒株EGDe接种浓度相同的情况下(10^3.0 cfu·mL^-1)，小鼠的存活数量和死亡时间无显著差异(P>0.05，图 5A)，表明这两个菌株对小鼠的毒力相当，分离株CMG47为强毒株。

斑马鱼毒力试验结果显示，静脉注射单增李斯特菌强毒株EGDe的斑马鱼在感染后4 d内全部死亡，注射分离株CMG47的斑马鱼在感染后1~2 d内全部死亡。可见通过静脉注射途径感染斑马鱼，分离株CMG47对斑马鱼的毒力略强于EGDe，但二者无显著差异(P>0.05，图 5B)，表明这两个菌株对斑马鱼的毒力相当，分离株CMG47为强毒株。

3 讨论

单增李斯特菌拥有广泛的宿主种类和宿主细胞类型，是一种食源性人兽共患病原菌，且能在胞内寄生。人和动物一般通过摄入该菌污染的食物而感染，引发李斯特菌病(Listeriosis)。李斯特菌病的早期临床症状与感冒相似，严重者可引起脑膜炎、败血症以及流产等^[1]。自1981年加拿大发生第一次食源性李斯特菌病暴发之后，欧美国家相继出现多例报道^[23]。国内虽未出现大范围的暴发，但近几年也时有临床病例的报道^{[1, 4, 24]}。目前，我国对食源性李斯特菌的监测系统不够完善，对李斯特菌在食品中的流行情况及临床感染病例的调查不足，流行病学资料较为匮乏。

本研究对一株从上海崇明某羊场的发病山羊脑组织中分离到的单增李斯特菌分离株CMG47进行了分子分型和生物表型的相关性分析。Goulet等^[25]在研究中指出，感染李斯特菌病的临床病例中，约98%是由李斯特菌谱系Ⅰ引起，其中1/2b和4b型菌株为主要血清型。王丽丽和陈倩^[26]对2013—2015年期间北京市32株自发病病例中分离到的单增李斯特菌的血清型进行鉴定和分析，发现1/2b和1/2a为主要血清型。我们通过多重PCR鉴定，确定分离株CMG47属于谱系Ⅰ，血清型为1/2b，为引起机体发病的主要血清型之一，这与国内外其他学者的研究结果一致。对分离株的血清型和谱系进行鉴定，是对李斯特菌监测和溯源的重要方法。

MLST是在对细菌基因组中多个保守等位基因进行测序的基础上，通过序列分析不同来源菌株间的亲缘关系，或以此分析疑似传播链中分离株的流行病学相关性，为李斯特菌的溯源和预警提供基础。Chenal-Francisque等^[27]在2011年对全球5大洲300株单增李斯特菌的统计结果显示，ST2、ST1、ST3、ST9、ST121和ST155型分别在全球范围内广泛流行。国内研究报道指出^[28-29]，ST9、ST8、ST87和ST121为我国优势型别。但是，近几年国内新分离到的ST619型也逐渐引起了研究者们的注意。王国梁^[16]于2013年在杭州猪肉样本中首次分离获得ST619型单增李斯特菌。霍哲等^[17]于2015年在北京市西城区发现一株ST619型食源性分离株。Wang等^[18]于2018年在自贡市RTE食品中发现的ST619型分离株具有llsX和ptsA超毒力基因序列，对人和动物危害极大。Chen等^[19-21]于2018年在可食用蘑菇、水产品和肉制品中分离获得ST619型食源性分离株。以上研究提示ST619型单增李斯特菌分离株在国内虽然少见(仅有上述6篇报道)，国外尚未发现，但其主要污染食品，风险较大。本研究对分离株CMG47的7个管家基因进行测序和分析，确定该分离株为ST619型，为国内外首例该型的山羊源分离株，且经鉴定为强毒株。提示中国尤其是上海地区存在感染动物乃至人的ST619型单增李斯特菌，存在潜在风险，需重视和加强对单增李斯特菌的监测力度和控制方法。该数据可为临床上的李斯特菌病散发病例流行和传播特征分析提供一定的基础。

单增李斯特菌作为一种侵袭性胞内菌，在入侵宿主细胞过程中受到一系列毒力因子调控，致病性与毒力基因密切相关^[30]。我们发现分离株CMG47具有单增李斯特菌LIPI-1上的6个主要毒力基因 prfA、plcA、hly、mpl、plcB和actA，两个内化素基因inlA和inlB以及应激调控基因sigB，与强毒株EGDe携带的毒力基因无差异，这些毒力基因的存在可能决定了细菌的致病性。此外，分离株CMG47的生长速度与强毒株相似。提示该分离株拥有正常的生长能力，具备潜在的致病力和引发李斯特菌病的风险。结合分子特性及血清型分析结果，我们进一步采用斑马鱼幼鱼和小鼠两种动物模型来研究细菌毒力。发现分离株CMG47无论是在斑马鱼幼鱼或是小鼠体内，均表现出较强的致病能力，对实验动物的致死率与强毒株EGDe相当，注射高剂量分离株CMG47或强毒株EGDe的小鼠在感染后5 d内全部死亡，提示分离株CMG47具有较强的致病力。尽管分离株CMG47未见明显的溶脂活性，且溶血活性较弱，但并不影响其致病力，可能与其具有一套完整的毒力因子有关。

通过对分离株CMG47进行以毒力基因为基础的遗传谱系分析和MLST遗传进化分析，确定该分离株属谱系Ⅰ，1/2b血清型，为引起机体发病的主要血清型之一；ST型为619，是我国近几年新出现的ST型，且为国内首次发现的潜在致病性山羊源单增李斯特菌分离株，国外尚未见报道。李斯特菌病因其潜伏期长，初期临床症状与感冒相似，难以在患病早期进行诊断和治疗，且难以追溯致病食品，导致传染源无法被确定，造成李斯特菌病的病原菌流行病学资料不充分。因此，建立一套健全的李斯特菌监测体系、加强国内各地区流行病学调查、制定针对性预防措施迫在眉睫，对降低单增李斯特菌病的发病率意义重大。

4 结论

本研究从上海某羊场的发病山羊脑组织中获得了一株单增李斯特菌分离株CMG47，属于谱系Ⅰ，1/2b血清型，为引起机体发病的主要血清型之一。ST型为619，属于国内新出现的ST型，且为国内外首例该型的山羊源单增生李斯特菌分离株。该分离株拥有整套主要毒力因子，经鉴定为强毒株。本研究为李斯特菌病散发病例的流行和传播特征分析提供了分子生物学基础。