2. 河南科技大学动物科技学院, 河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室, 洛阳 471003
2. Key-Disciplines Lab of Safety of Environment and Animal Product, College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China
猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)是丹毒丝菌科丹毒丝菌属(Erysipelothrix)的一种革兰阳性的纤细小杆菌，有荚膜、无鞭毛、不产生芽胞[1]。该菌在自然界分布广泛，可感染多种哺乳动物、禽和鱼类[2-5]。人可经外伤感染，发生皮肤病变，称为类丹毒[6]。在猪群中，猪丹毒丝菌引起的猪丹毒，是一种急性、热性传染病，临床表现为急性败血型、亚急性疹块型和慢性心内膜炎型，该病在世界范围内广泛存在和流行[2, 7]。在20世纪80~90年代，猪丹毒曾是危害我国养猪业的三大传染病(猪瘟、猪丹毒、猪肺疫)之一[8]。20世纪90年代后期至21世纪很少有关于猪丹毒病例的报道，曾一度被认为在我国已经消失，但2010年以来，猪丹毒又在我国多个省份发生[9-10]。
根据菌体细胞壁抗原的差异，通过琼扩试验可将猪丹毒丝菌分为26个血清型(1a、1b、2~24及N型)[2, 11]。不同血清型菌株之间毒力差异很大，其中1a和1b型的毒力较强[2, 12]。在我国主要流行的血清型为1a型[9]，急性猪丹毒发病急、死亡率高，而从急性败血性猪丹毒病例中分离的菌株约90%为1a型。目前，预防猪丹毒的有效方法主要是接种疫苗。在猪丹毒灭活疫苗的研制过程中，佐剂的选择是影响疫苗免疫效果的关键，良好的佐剂可以增强机体对于抗原的免疫应答，提高疫苗的免疫效果[13-14]。当前，国内在猪丹毒疫苗领域关于灭活疫苗佐剂的研发还比较滞后，基本停留在传统的铝胶、白油佐剂的使用上，我国使用的仍是20世纪60年代研制的猪丹毒灭活疫苗(C43-5株，铝胶佐剂)、猪丹毒活疫苗(GC42株或G4T10株)等[15]。本研究以新分离的猪丹毒丝菌1a型菌株HG-1为抗原，选用近年来使用比较广泛的ISA201、IMS1313水溶性纳米佐剂、GEL水溶性聚合物佐剂这3种新型佐剂，同时选用铝胶和矿物油两种传统佐剂作为参照来筛选更适于猪丹毒灭活疫苗的佐剂，为今后进一步开展猪丹毒灭活疫苗的研发提供依据。
1 材料与方法 1.1 菌株来源及实验动物猪丹毒丝菌1a型HG-1株由河南科技大学兽医生物制品工程实验室于2018年6月分离自广东猪丹毒患病猪群，该菌株针对10~12周龄BALB/c小鼠的LD50(50% lethal dose)为218 CFU，针对8~9周龄健康易感仔猪的LD100(100% lethal dose)为1.0×104 CFU。6~8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。4~5周龄健康易感仔猪购自河南省伊川县农村散养户；健康易感仔猪标准：猪群近两年未发生过猪丹毒，无猪丹毒临床症状，未免疫猪丹毒相关疫苗，采集血清经菌体ELISA方法[16]检测为猪丹毒丝菌1型和2型抗体阴性的健康猪。
1.2 主要材料与试剂TSA(Tryptic soy agar)和TSB(Tryptic soy broth)为美国BD公司产品。无支原体新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。氯化钠等常规化学试剂购自北京市益利精细化学品有限公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。矿物油佐剂Marcol-52(简称矿物油)为美国埃克森美孚公司产品，氢氧化铝胶佐剂(简称铝胶)为美国通用化学集团公司产品，MontanideTM ISA 201 VG双相油乳佐剂(简称ISA201)、MontanideTM GEL02 PR水溶性聚合物佐剂(简称GEL)、MontanideTM IMS 1313 VG N水溶性纳米佐剂(简称IMS1313)购自赛彼科特殊化学品(上海)有限公司。ELISA相关试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。猪丹毒丝菌1a型菌株CVCC43008及阳性血清购自中国兽医药品监察所。
1.3 猪丹毒丝菌HG-1株的分离与鉴定2018年6月广东省某规模化猪场发生疑似猪丹毒病例，无菌采集心血、肺等组织划线接种于含10%新生牛血清的TSA培养基中，37 ℃培养24~48 h后观察，挑取疑似菌落进行传代纯化培养和革兰染色镜检。使用细菌16S rRNA基因通用引物[17](JD01：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；JD02：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增、序列测定与BLAST对比分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。然后，根据参考文献合成猪丹毒丝菌的1a型特异性引物(P1：5′-CTCCTAACGCTTTAGCACGC-3′；P2：5′-TGATCCTTTGCCACTAATGC-3′)进行PCR分型[18]。最后，通过琼脂扩散试验使用猪丹毒丝菌1a型阳性血清对其进行血清型鉴定[19]。
1.4 疫苗的制备将猪丹毒丝菌HG-1株接种于含10%新生牛血清的TSA培养基中，37 ℃培养24~36 h，挑取单菌落传代纯化培养1次，然后挑取单菌落接种于含10%新生牛血清的TSB液体培养基中，37 ℃、200 r·min-1摇床培养16 h作为种子液，然后按1:100的比例将种子液转接到新的含10%新生牛血清的TSB液体培养基中37 ℃振荡培养16 h，向菌液中按0.3%(菌液总体积)的比例加入甲醛，在37 ℃灭活48 h。将检验合格(即灭活完全)的菌液离心去除上清，根据灭活前活菌计数结果，使用无菌PBS(0.01 mol·L-1、pH值7.2)将HG-1株灭活菌体稀释浓度至3.75×109 CFU·mL-1。根据文献方法分别制备HG-1株的矿物油佐剂疫苗和铝胶佐剂灭活疫苗[20]；根据佐剂说明书分别制备HG-1株的ISA201佐剂疫苗、IMS1313佐剂疫苗和GEL佐剂疫苗。五种佐剂疫苗的菌体抗原含量均为3.0×109CFU·mL-1。
1.5 小鼠免疫保护试验将42只小鼠随机均分为6组，7只·组-1。1~5组小鼠分别背部皮下免疫5种佐剂疫苗(0.2 mL·只-1)，第6组注射无菌PBS作为对照组(0.2 mL·只-1)，21 d后用同样的方法、剂量进行二免，首免前、一免后、二免后分别对每组小鼠进行尾根静脉采血并分离血清，通过菌体ELISA方法[16]测定各组小鼠血清中的抗体水平。在二免后14 d(即首免后35 d)，所有6组小鼠经腹腔注射接种约含4 LD50(LD50为218 CFU)的HG-1株菌液。观察并记录其临床症状、发病及死亡情况14 d，剖检死亡小鼠并进行细菌的分离鉴定。
1.6 仔猪安全性试验根据上述“1.5”的试验结果，选择铝胶佐剂疫苗、GEL佐剂疫苗进一步进行仔猪的安全性试验。将15头仔猪随机均分为3组(5头·组-1)，用制备的猪丹毒丝菌铝胶佐剂疫苗和GEL佐剂疫苗分别对1组和2组仔猪进行颈部肌肉2倍剂量接种(4 mL·头-1)。同时设立空白对照组接种无菌PBS(4 mL·头-1)。观察并记录其精神、食欲等临床症状及死亡情况。连续观察14 d，观察期结束后剖检各组仔猪检查注射部位的炎症、坏死以及疫苗残留情况。
1.7 仔猪免疫保护试验将15头仔猪随机均分为3组，5头·组-1。1组和2组仔猪分别颈部肌肉免疫铝胶佐剂疫苗、GEL佐剂疫苗各2 mL，对照组注射无菌PBS(2 mL·头-1)。21 d后使用相同剂量对仔猪进行二免，分别于首免前、一免后和二免后对每头仔猪进行颈静脉采血，并分离血清，通过ELISA方法检测血清中的抗体水平。在二免后14 d对所有仔猪耳缘静脉注射约含16 LD100的HG-1株菌液1.0 mL。观察、记录发病死亡情况14 d，剖检死亡仔猪并进行细菌的分离鉴定。
1.8 数据统计分析通过SPSS 20.0软件对试验数据进行统计学分析，通过t-检验(Student’s t test)及单因素方差分析(one-way ANOVA, 采用Duncan法进行多重比较)对血清中抗体水平进行分析，进行差异的显著性比较(P < 0.05表示统计学差异显著，P < 0.01表示统计学差异极显著)。
2 结果 2.1 细菌分离与鉴定从发病死亡猪的各组织病料中均能分离出单一的细菌，该菌在含10%新生牛血清的TSA培养基上，可长成光滑、边缘整齐、有微蓝色泽、无色透明、针尖大露珠样小菌落；通过革兰染色镜检，可见大小为(0.8~2.5)μm×(0.2~0.4)μm直的或稍弯曲的革兰阳性细长小杆菌；其菌落菌体特征与猪丹毒丝菌相符。16S rRNA基因的序列比对结果表明该菌株与GenBank已公布的48株猪丹毒丝菌(如NCTC8163、ML101等)的相似性均在99%以上。使用猪丹毒丝菌1a型特异性引物进行PCR分型，能扩增到356 bp的DNA片段(图 1)。琼脂扩散试验结果表明，猪丹毒丝菌分离株的菌体抗原与1a型阳性血清呈阳性反应。这些试验结果表明，该分离株为1a型猪丹毒丝菌，命名为HG-1。
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M. DL2000相对分子质量标准；1、2.菌株HG-1、标准菌株CVCC43008；3.阴性对照 M. DL2000 marker; 1, 2. PCR product of strain HG-1 and standard strain CVCC43008; 3. Negative control 图 1 HG-1株1a型特异性引物PCR结果 Fig. 1 The PCR result of HG-1 strain serovar 1a specific primer |
免疫小鼠的ELISA检测结果(图 2)显示，一免后21 d，ISA201疫苗组、铝胶疫苗组、GEL疫苗组、IMS1313疫苗组、矿物油疫苗组小鼠血清抗体水平均极显著高于免疫前和对照组(P < 0.01)。二免后14 d，矿物油疫苗组的抗体水平又显著升高(P < 0.05)，但其他4个免疫组没有显著升高(P>0.05)；各免疫组之间比较，矿物油疫苗组显著高于铝胶疫苗组和ISA201疫苗组(P < 0.05)；其他免疫组之间差异不显著(P>0.05)。这表明，5种佐剂疫苗均能诱导免疫小鼠产生较高的抗体水平；但二免后，除矿物油佐剂疫苗外的4种佐剂疫苗，其抗体水平均无显著升高。
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不同时间，相同组别相比较，*. P < 0.05，**. P < 0.01；相同时间，不同组别相比较，不同小写字母表示P < 0.05，不同大、小写字母表示P < 0.01。下同 Comparison of the same group at different time, *. P < 0.05, * *. P < 0.01; Comparison of different groups at the same time, different lowercase letters stand for P < 0.05, and different large and small letters stand for P < 0.01. The same as below 图 2 五种佐剂疫苗免疫小鼠的抗体水平检测结果 Fig. 2 Antibody titer of mice immunized with the five different adjuvanted vaccines |
使用5种佐剂制成的疫苗分别对小鼠进行两次免疫，二免后使用约4 LD50剂量的HG-1株进行攻毒。对照组小鼠于攻毒后全部死亡，且均发生于攻毒后第4日；铝胶疫苗组、IMS1313疫苗组、ISA201疫苗组也均在攻毒后第4日开始死亡，均死亡6只，最后死亡均发生在攻毒后第7日。GEL疫苗组共死亡2只，均发生于攻毒后7 d。对死亡小鼠进行剖检，均呈现以典型的败血症为特征的病理变化。在观察期内(14 d)，矿物油疫苗组小鼠全部存活，保护率为100%；其次是GEL疫苗组，保护率为71%；其他三种佐剂疫苗的保护率均较差，均为14%，结果如表 1所示。
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表 1 五种佐剂疫苗的小鼠免疫保护试验 Table 1 Protective efficacy of vaccines with five different adjuvants in mice |
用制备的猪丹毒丝菌铝胶佐剂疫苗和GEL佐剂疫苗分别对仔猪通过颈部肌内注射途径进行2倍剂量接种(4 mL·头-1)，铝胶疫苗和GEL疫苗接种仔猪后其精神及食欲状况均无明显异常，与PBS对照组相比没有明显差异，且均没有发生腹泻、呕吐甚至死亡等现象。疫苗接种组仔猪出现了暂时的体温升高，但在接种后24 h体温平均升高不超过1 ℃，且在48 h内恢复正常。观察期结束后，解剖观察各组试验仔猪注射部位，两种疫苗组仔猪的接种部位均无明显的局部炎症、组织病变和疫苗残留现象，也无肉芽肿的形成，与对照组相比没有肉眼可见的差异。试验结果表明，这两种疫苗对接种仔猪安全。
2.5 免疫仔猪血清抗体检测ELISA检测结果(图 3)显示，一免后21 d，铝胶疫苗组和GEL疫苗组仔猪的血清抗体水平均极显著高于免疫前和对照组(P < 0.01)；但二免后14 d，与一免后抗体水平相比，铝胶疫苗组和GEL疫苗组均没有再显著升高(P>0.05)；两个免疫组之间也没有显著差异(P>0.05)。这表明，2种佐剂疫苗均能诱导免疫仔猪产生较高的抗体水平；但二免后，其抗体水平均无显著升高。
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图 3 两种佐剂疫苗免疫仔猪的抗体水平检测 Fig. 3 Antibody titer of piglets immunized with the two adjuvanted vaccines |
用GEL疫苗和铝胶疫苗分别对仔猪进行两次免疫后，使用约为16 LD100的HG-1株进行耳缘静脉注射攻毒，结果见表 2。对照组仔猪于攻毒后36 h开始发病，表现为精神沉郁、食欲减退或完全废绝、关节肿胀、跛行或卧地不起、可视黏膜发绀等临床症状，攻毒后4 d内全部死亡。立即对死亡猪进行剖检，均呈现为典型的败血症性病理变化。从死亡猪的心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结、大肠、小肠、肌肉等各器官组织中均能分离到猪丹毒丝菌。铝胶疫苗组也有2头出现了发病和死亡(表 2)，保护率为60%。GEL疫苗组的猪全部存活，仅有2头出现暂时的精神沉郁和食欲减退，且在24 h内恢复正常，保护率为100%。
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表 2 两种佐剂疫苗的仔猪免疫保护试验 Table 2 Protective efficacy of vaccines with two different adjuvants in piglets |
猪丹毒是一种典型的“老病新发”性细菌传染病，疫苗免疫是预防猪丹毒的关键。疫苗的安全、高效是评价其质量的重要指标，而选择合适的佐剂对于疫苗的安全性和效力至关重要。
本研究中，矿物油佐剂能使免疫小鼠产生最高的抗体水平和完全的保护力(100%)，但矿物油疫苗会导致接种猪发生体温升高、食欲不振、生长缓慢，以及接种部位发生炎症坏死、肉芽肿等不良反应[20]；在猪用生物制品行业中，矿物油佐剂正逐渐被其他各种新型佐剂所取代。
ISA201佐剂是一种新型水包油包水型(W/O/W)的双相油乳佐剂，其主要成分是高度精炼的轻质矿物油，同时含有少量植物来源的甘露醇和油酸等[21-22]。由该佐剂制备的疫苗改变了原有矿物油疫苗形成的油包水剂型(O/W)，使其黏稠度下降，易于注射，副反应降低，同时保留了油佐剂的抗原递呈效力；近年来在多种动物疫苗中得到了比较广泛的应用[23-25]。但在本研究中，其免疫效力却明显偏低，这与我们前期在肠杆菌科细菌疫苗中得到的高保护效力的结果不一致[26]。IMS1313水溶性纳米佐剂在免疫效力方面同样表现不佳。
GEL是近年来开发的一种新型水溶性聚合物佐剂，其主要成分是聚丙烯酸钠，该佐剂具有抗原载量大、性状稳定、乳化工艺简单等优点[20, 27-28]。GEL佐剂的良好效果在几种病毒疫苗中得到了验证，如猪圆环病毒灭活疫苗[29]、猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗[28]、马流感病毒灭活疫苗[30]、猪流行性乙型脑炎减毒活疫苗[27]、牛疱疹病毒的DNA疫苗[31]等。但是，该佐剂在羊副结核病菌体灭活疫苗[21]、马红球菌病亚单位疫苗[32]、牛螨虫病亚单位疫苗中却表现不佳[33]。目前，关于GEL佐剂在细菌疫苗方面的研究报道较少。在副猪嗜血杆菌病灭活疫苗佐剂的比较研究中，我们发现GEL佐剂具有明显优于矿物油佐剂的安全性，同时又能提供完全的保护效力(100%)，明显优于铝胶、IMS1313和ISA760等佐剂[20, 34-35]。
本研究旨在验证GEL佐剂等新型佐剂在革兰阳性菌——猪丹毒丝菌灭活疫苗中的效果。在小鼠试验中，GEL佐剂能刺激机体产生较高的抗体水平，且能提供比传统铝胶佐剂和新型201佐剂、1313佐剂更高的保护力。另外，由于传统猪丹毒灭活疫苗使用的均是铝胶佐剂[15]，因此在猪体试验中，我们又对GEL佐剂和铝胶佐剂进行了比较研究，结果表明两者安全性均较好，但GEL疫苗具有更高的保护效力(100%)，铝胶疫苗的保护率为60%。铝胶疫苗组和GEL疫苗组二免后的抗体水平相近，但攻毒保护率相差较大，可能的因素有以下方面：在本研究中，我们只测定了总的IgG抗体水平，铝胶佐剂主要刺激机体产生Th2型反应，诱导体液免疫应答，产生的抗体以IgG1为主，不能很好地诱导细胞免疫[36-38]。GEL佐剂是近年来开始应用的一种新型聚合物佐剂，根据已报道的相关研究，GEL佐剂不但能诱导机体产生体液免疫，也能显著促进T淋巴细胞增殖分化，从而产生较高的细胞免疫水平[27, 29, 39]，两个疫苗组抗体水平可能在细胞免疫上存在差异。
这表明GEL佐剂不但在革兰阴性菌——副猪嗜血杆菌的灭活疫苗中表现较好[20]，而且在革兰阳性菌——猪丹毒丝菌的灭活疫苗中也具有较大的应用潜力。
4 结论本研究以猪丹毒丝菌1a型菌株HG-1为抗原配以五种不同佐剂制成猪丹毒灭活疫苗，首先通过小鼠免疫保护试验，对五种疫苗的免疫效果进行初步评价筛选出了免疫保护效力较好的GEL佐剂，然后将GEL佐剂疫苗和传统铝胶佐剂疫苗分别免疫仔猪进行安全性与免疫效力的评价，试验结果表明GEL佐剂疫苗不但副作用小，且在免疫保护力方面明显优于铝胶佐剂。本研究为猪丹毒新型灭活疫苗的研发提供了参考依据。
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