非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种以高热、淋巴及内脏器官严重出血为特征的急性、热性、高度传染性疾病^[1-2]。由于该病对养猪业造成很大危害，目前没有有效的疫苗用于预防，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须呈报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。该病2018年8月传入我国，给我国养猪业带来了巨大的损失^[3]。

ASFV是唯一一种虫媒传播的DNA病毒，主要感染家猪和野猪，可同时在脊椎动物和无脊椎动物中复制，是非洲猪瘟科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员^[4-6]。ASFV为二十面体对称，具有囊膜的双链DNA病毒，其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，大小170~190 kb，末端碱基相互连接，编码150~200种蛋白^[7-9]。

p62蛋白是由CP530R基因编码的一个相对分子质量为60.5 ku的蛋白，蛋白序列在ASFV不同毒株中具有较高的保守性，且具有免疫原性^[10]。该蛋白在S273R酶的作用下能够被裂解为成熟病毒蛋白p35、p15和p8^[11-12]，p35和p15参与病毒二十面体的形成，成为重要的结构蛋白。p62的成熟产物是组成核壳的基本组件，和p220的成熟产物共占病毒粒子蛋白总量约30%^[13-16]。因此，p62蛋白作为结构蛋白p35和p15的前体蛋白，可能是非洲猪瘟病毒免疫学诊断的重要靶标之一，并在非洲猪瘟病毒的致病及免疫机制等基础研究中具有重要的意义。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达非洲猪瘟病毒p62重组蛋白，通过杂交瘤技术制备了p62蛋白单克隆抗体，其中5株免疫组化检测为阳性，为非洲猪瘟诊断方法的建立及非洲猪瘟病毒生物学功能的研究奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 菌株、细胞系和实验动物

大肠杆菌(E. coli)Trans T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；pFastBac HTB杆状病毒转移载体、Sf9昆虫细胞均由国家兽用药品工程技术研究中心保存；pET28a质粒购自Novagen；猪瘟病毒C株病毒液、猪繁殖与呼吸综合征病毒JXAI-R株病毒液、猪伪狂犬病病毒Bartha株病毒液、猪圆环病毒2型病毒液均由国家兽用药品工程技术研究中心鉴定及保存；猪瘟病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清由国家兽用药品工程技术研究中心提供；猪伪狂犬病病毒单克隆抗体1F2、猪圆环病毒2型单克隆抗体3H11由洛阳普泰生物技术有限公司保存；4~6周龄和6~8周龄的SPF BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 试剂

限制性内切酶购自赛默飞世尔科技公司；脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagente购自上海Invitrogen公司；HisTrap 1 mL预装柱、HiLoad 16/600 Superdex 200 pg分子筛预装柱购自美国GE公司；ASFV阳性血清、ASFV 96孔抗原板购于欧盟参考实验室(EU Reference Laboratory for ASF, INIA-CISA)；猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型96孔抗原板由国家兽用药品工程技术研究中心提供；HRP标记的羊抗鼠IgG、HRP标记的羊抗猪IgG购于Sigma公司；FITC标记的兔抗鼠IgG购于Sigma公司；AEC显色试剂盒、水溶性封片剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定用ELISA试剂盒购自洛阳佰奥通实验材料中心。

1.3 重组p62蛋白的表达、纯化与鉴定

根据ASFV SY18基因组序列，由上海生工生物工程有限公司合成p62基因，设计引物p62-XbaⅠ-F: 5′-GCTCTAGAATGCCCTCTAATATGAAACAGTTT - TGC- 3′; p62-HindⅢ-R: 5′-CCCAAGCTTTTATTCTTGAAGTAACTTTAGTATTTC -3′，分别引入酶切位点XbaⅠ和HindⅢ，通过常规方法构建重组杆粒命名为rBacmid-p62^[17]。用CellfectinⅡ Reagent转染试剂将rBacmid-p62转染sf9昆虫细胞，同时设置感染野毒的sf9昆虫细胞作为阴性对照。72 h左右转染细胞出现病变，收集细胞培养液上清，即为P1代重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染sf9细胞，出现80%细胞病变时，收集病变细胞和感染野毒sf9细胞进行裂解，取裂解液上清制备样品，进行常规操作SDS-PAGE。电泳后的凝胶用半干式转膜法电转至NC膜。将转印的NC膜用5%脱脂奶粉封闭，4 ℃封闭过夜，以ASFV阳性血清为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG为二抗，加入DAB显色液进行显色。同时制备大量裂解上清，用镍柱进行亲和层析，目的产物以300 mmol·L^-1咪唑进行洗脱，获得的重组蛋白经分子筛进一步纯化，按峰收取蛋白分别经SDS-PAGE检测。

1.4 重组p35、p15蛋白的表达与纯化

以p62基因重组质粒为模板，分别设计p35和p15的引物，p35-NdeⅠ-F：5′-GCGCCGCATATGGACCCGCCGGTTCCGAAACA-3′，p35-XhoⅠ-R：5′-CCGCTCGAGTTAGTTACCACCAACTTTTT -3′；p15-NdeⅠ-F：5′- GGGAATTCCATATGCCGTCTAACATGAAACAGTT-3′，p15-XhoⅠ-R：5′-CCGCTCGAGTTAGTTACCACCACCTTCTT-3′。利用PCR扩增获得的目的基因，构建重组质粒pET28a-p35、pET28a-p15，并转化感受态大肠杆菌DH5α，进行鉴定和测序验证。测序正确的质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，即pET28a-p35-BL21、pET28a-p15-BL21表达菌株。经0.2 mmol·L^-1的IPTG于28 ℃培养12 h进行诱导表达，将菌体裂解上清和沉淀样品进行SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况和镍柱亲和层析纯化，方法同“1.4”。

1.5 重组p62蛋白单克隆抗体的制备 1.5.1 动物免疫及间接ELISA筛选方法的建立

将纯化的p62蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化后进行首免，背部皮下分四点免疫4~6周龄雌性BALB/c小鼠，100 μg·只^-1。二免和三免使用弗氏不完全佐剂，按照同样方法进行免疫，免疫间隔均为21 d。二免和三免后14 d采血。将纯化的p62蛋白稀释至0.5 μg·mL^-1包被酶标板，100 μL·孔^-1，4 ℃孵育16~24 h，洗板后加入封闭液，150 μL·孔^-1，4 ℃封闭16~24 h。洗板后加入样品，同时设置阴、阳性对照，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1:10 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min。洗板后分别加入显色剂A、B液，37 ℃显色15 min，用2 mol·L^-1 H₂SO₄终止反应，50 μL·孔^-1。阴性对照OD_{450 nm} < 0.2时，试验成立，S/N(待检样品OD_450nm/阴性对照OD_450nm)≥2.1时，判为阳性；S/N < 2.1时，判为阴性，待检样品的效价为阳性孔对应的样品最高稀释度。

1.5.2 细胞融合及筛选

用“1.5.1”建立的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清的抗体。取抗体效价最高的小鼠按常规方法进行融合及筛选亚克隆^[18]，于3~5次亚克隆后，获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

1.5.3 单克隆抗体腹水制备及效价测定

取6~8周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡，0.5 mL·只^-1，1周后腹腔注射阳性杂交瘤细胞，15万个·只^-1。7~10 d后采集腹水，10 000 r·min^-1离心5 min，上清即为单克隆抗体，并通过间接ELISA方法检测效价。

1.6 单克隆抗体的鉴定 1.6.1 单克隆抗体与病毒反应性的鉴定

用间接免疫荧光法(IFA)进行鉴定，取出ASFV 96孔抗原板回温，PBS洗涤1次，分别加入待检测的MAbs，并设置阴性对照孔，置于37 ℃培养箱作用1 h；PBS洗涤3次，加入FITC标记的兔抗鼠IgG二抗，37 ℃作用50 min；PBS洗涤3次后于荧光显微镜下观察结果。

1.6.2 单克隆抗体特异性鉴定

使用猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型制备的IFA抗原板，检测单克隆抗体的特异性。同时设置阳性对照，CSFV、PRRSV为相应的阳性血清，PRV、PCV2为相应的阳性单克隆抗体^[18-19]。并用PBS作为阴性对照。

1.6.3 单克隆抗体识别蛋白的鉴定

将大肠杆菌表达系统表达纯化的p15和p35蛋白通过SDS-PAGE电泳及Western blot试验，用单克隆抗体作为一抗孵育，进行识别蛋白的鉴定。

1.6.4 单克隆抗体亚类的鉴定

将筛选获得的单克隆抗体用小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒进行亚类鉴定，按试剂盒说明书操作。

1.7 单克隆抗体在免疫组化中的初步应用

参照周庚寅免疫组织化学染色SABC法^[20]对单克隆抗体进行检测，按照常规方法将ASFV阳性的猪脏器组织(来自广州市黄埔区的农业农村部公布病例)进行固定、石蜡切片。染色前将切片脱蜡至蒸馏水，抑制内源酶处理，并进行抗原修复，滴加1:20稀释的正常马血清，37 ℃湿盒中孵育20 min，封闭杂蛋白。吸取封闭液后加入1:800倍稀释的单克隆抗体，同时设置阴性对照片，4 ℃过夜，1×PBS洗4次，每次5 min。加1:600稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃湿盒中孵育1 h，1×PBS洗4次，每次5 min。AEC(现配现用)室温显色4~8 min，洗掉后，用1:3稀释的苏木素(新鲜配制)衬染10 s，然后洗去未结合的苏木素。封片后在光学显微镜下观察结果，拍照记录。

2 结果 2.1 重组杆粒rBacmid-p62的构建

用p62-F/R引物以合成的含p62基因的质粒为模板，PCR扩增出了1 592 bp大小的条带(图 1)。用Bac13F/R引物对重组杆粒rBacmid-p62进行PCR鉴定，结果出现大约4 000 bp的扩增产物(图 2)，表明p62基因已被转座到杆状病毒载体上。

2.2 重组p62蛋白的表达、纯化与鉴定

分别取感染野毒的sf9细胞和感染p62重组杆状病毒后第72小时的sf9细胞，用细胞裂解液裂解，经10 000×g离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色及Western blot分析。重组蛋白呈可溶性胞内表达(图 3A)，经ASFV阳性血清杂交，结果在62 ku处出现特异性条带，与预期相对分子质量大小一致(图 3B)，对照组无条带。用镍柱对获得的蛋白液进行纯化，用含300 mmol·L^-1咪唑的缓冲液能够将目的蛋白从镍柱上洗脱下来(图 4A)。用分子筛对从镍柱上洗脱下来的蛋白进行进一步纯化(图 4B)。

2.3 重组p35、p15蛋白的表达与纯化

取表达菌裂解液的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳, 检测到重组p35蛋白和p15蛋白均为可溶性表达，采用镍柱亲和层析纯化上清中的可溶性蛋白，重组p35蛋白的相对分子质量在35 ku左右(图 5A)，重组p15蛋白的相对分子质量在20 ku左右(图 5B)。

2.4 细胞筛选及腹水效价测定

经过筛选，获得了1A12、2G1、2E10、4F4、2H5等18株阳性杂交瘤细胞。收集上清和腹水，用间接ELISA法测定效价，上清效价为1:1.28万~1:10.24万，腹水效价为1:102.4万~1:204.8万。

2.5 单克隆抗体与病毒反应性的鉴定

利用ASFV 96孔抗原板，用获得的杂交瘤细胞制备的腹水作为一抗, 同时设置非ASFV源单抗作为阴性对照，FITC标记的兔抗鼠IgG作为二抗进行间接免疫荧光分析，结果显示18株单克隆抗体均能在荧光显微镜下观察到绿色荧光，阴性对照孔无绿色荧光(图 6)。

2.6 单克隆抗体特异性鉴定

取猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型抗原板分别检测18株单克隆抗体，结果阳性对照孔均可见明显的绿色荧光，阴性对照孔和单克隆抗体检测孔均无明显可见绿色荧光。

2.7 单克隆抗体识别蛋白的鉴定

取纯化蛋白p15和p35进行SDS-PAGE电泳及Western blot，经单克隆抗体杂交分析，结果有15株单抗在p15蛋白泳道内约20 ku处出现特异性条带(图 7A)，3株抗体在p35蛋白泳道内约35 ku处出现特异性条带(图 7B), 且每株单抗在另一个蛋白泳道内无条带。

2.8 单克隆抗体亚类鉴定

单抗亚类鉴定结果表明，14株的抗体重链亚类为IgG1型，4株的抗体重链亚类为IgG2a型，轻链均为κ链。

2.9 单克隆抗体在免疫组化中的初步应用

将筛选出的杂交瘤细胞株制备的腹水，与ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等脏器组织进行IHC检测，4F4、2H5等5株在ASFV阳性组织肺、扁桃体、淋巴结、脾、肝中均能检测到阳性反应，阳性细胞着色特点多为在单核、巨噬细胞中有深红色的形态一致的点状着色。其阳性强度以肺最强，其次为扁桃体和淋巴结，再其次为脾和肝，肾为阴性。同时，经阴性组织评价，均无非特异性着色(图 8)。

3 讨论

非洲猪瘟最早的疫情报道于1921年，起源于非洲肯尼亚，之后蔓延到了非洲其地区以及欧洲、美洲的多个国家，并且有继续向世界各国蔓延的趋势^[21]。非洲猪瘟在临床症状上与猪瘟极为相似，以高热、高死亡率、全身广泛性出血、呼吸障碍以及神经功能紊乱为主要特征。尽管是由两种不同的病原引起，但是在临床诊断方面仍然存在一定难度。目前已知有24个基因型^[22]，迄今为止，该病尚无商品化的疫苗可用，也没有有效的治疗药物，只能依靠隔离、扑杀、限制流通来防止疫情蔓延。因此，建立快速而有效的检测方法是防止非洲猪瘟发生大范围暴发的有效手段^[23-25]。

p62蛋白作为ASFV p15和p35的前体蛋白，是病毒感染的晚期蛋白。对于p62蛋白作为诊断抗原的研究，Gallardo等^[26]分别以ASFV p62、p32和p54为研究对象，将重组蛋白作为ELISA诊断抗原，研究结果显示，重组蛋白p62的特异性为99%，p32和p54为97%，三种蛋白的敏感性约为97%。研究检测37 ℃破坏1个月的血清，p62的敏感性和特异性为100%，优于另外两种重组蛋白，这一原因可能是针对该蛋白的抗体比其他蛋白对应的抗体更稳定或表现出更强的亲和力，使得抗体在热处理后仍能与抗原蛋白结合，因此p62更适合用于检测保存不当的血清样品^[26-28]，具有作为诊断抗原的潜质。

通过真核表达ASFV p62蛋白作为靶抗原，经杂交瘤细胞法筛选出了18株可稳定分泌针对p62蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，与ASFV具有良好的反应性，且均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒反应，特异性良好。Simón-Mateo等^[10]研究了多聚蛋白p62随着病毒感染周期分解为两个成熟的结构蛋白p35和p15的过程，p62水解后形成p15、p35和一个8 ku大小的小蛋白，8 ku小蛋白生成后很快降解掉，可能不具有免疫原性^{[10, 29]}。Cubillos等^[30]研究的数据确定p15是决定p62抗原性的成熟蛋白，即其抗原表位主要在p15蛋白，而p35蛋白较少。本研究中针对p62蛋白的抗体识别蛋白鉴定结果发现，其中15株与p15蛋白反应性良好，仅3株与p35蛋白的反应性较好，间接证明了Cubillos等^[30]的研究结果。IFA鉴定结果表明18株MAbs与真核表达的重组ASFV p62蛋白具有良好的反应性，其中5株MAbs应用于IHC试验，均能够与ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结中的病毒抗原反应，而不与阴性组织反应。由于免疫组化方法在组织固定过程中会对抗原造成封闭，染色过程中虽然通过抗原修复来暴露了抗原，但此过程可能会造成其抗原表位的展示情况与细胞水平的IFA不同，从而影响单克隆抗体在不同方法中的使用^[31]。

本研究成功表达了p62重组蛋白，制备了针对该蛋白的MAbs，并在免疫组化中进行了初步应用。本研究制备的MAbs为ASFV的临床诊断提供了检测工具，且为免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供了支撑。

4 结论

成功获得ASFV p62重组蛋白，以其制备的单克隆抗体与病毒具有反应性，且初步应用于免疫组化，为ASFV免疫学诊断方法的建立和p62蛋白结构功能等基础研究提供了重要的生物材料。