哺乳动物肠道中寄居着数以百亿计的微生物[1]，以细菌为主，包括真菌[2]、病毒和噬菌体[3]。细菌又以厌氧菌为主，约占总数的90%~99%，其次为需氧菌及兼性厌氧菌，它们共同维持着肠道内环境的稳态。肠道菌群的总基因数是宿主自身基因的100~150倍，其产生的代谢产物可能对宿主健康产生影响[4]。肠道中的微生物对营养物质的吸收和代谢、肠黏膜屏障、免疫系统、中枢神经系统等的调节具有重要的作用，肠道微生态系统的紊乱会严重影响宿主机体的健康。越来越多在人的研究中发现，包括代谢综合征[5]、肠易激综合征[6]、炎症性肠病[7]以及胃肠外疾病(神经精神类疾病)[8]等与肠道微生物有关。近年来，粪菌移植被逐渐应用于重建宿主肠道菌群微生态系统。粪菌移植(faecal microbiota transplantation，FMT)是指将健康供体的粪便微生物移植到患病受体的胃肠道内，重塑受体肠道菌群结构来治疗特定疾病的方法[9]。目前在临床上多用此方法治疗复发性艰难梭菌感染，且取得良好的疗效[10-11]，此外，粪菌移植也逐渐应用于炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征和以自闭症为代表的神经性疾病[12]的治疗中。另外，粪菌移植也在癌症及相关并发症治疗中表现出潜力[13-14]。在动物模型研究中，无菌小鼠是研究肠道菌群功能的重要实验动物，通过将患者的粪便菌群移植到无菌小鼠体内，观察相关表型改变，可直接确定菌群与疾病的因果关系。目前, 这种实验动物的粪菌移植技术已经广泛运用在肥胖[4]、二型糖尿病[15]、抑郁症[16]、精神分裂症[17]、自闭症[8]等复杂疾病的研究中。在农业动物中，以猪为代表，通过粪菌移植可以改善猪肠道菌群微生态结构，对促进猪健康和改善生产性能具有重要意义。目前已有研究发现，新生仔猪从一出生就接受来自健康成年猪的粪菌移植, 可调节受体仔猪的结肠菌群多样性和组成，改善肠道屏障[18]；且粪菌移植也能缓解感染引起的仔猪肠道损伤，改善肠道形态[19]；同时，Hu等[20]发现，在断奶前通过移植CM仔猪(抗腹泻)的粪菌，可显著减少LY仔猪早期断奶应激诱导的腹泻。但迄今为止，无论是猪粪菌移植的生产应用，或是将猪的粪便移植到无菌小鼠的研究性试验，粪菌移植往往受到时间和地点的限制，如果能利用超低温冷冻保存的粪便来进行粪菌移植，在很大程度上能提升粪菌移植的可行性及实用性。人类临床医学上发现，用新鲜粪菌移植和冷冻粪菌移植治疗艰难梭菌感染的疗效没有显著差异[21]，但利用粪菌移植治疗克罗恩病时，新鲜粪菌的疗效优于冷冻粪菌[22]。现已建立的粪菌库都是采用超低温冷冻保存的形式[23]，但目前尚未得知超低温冷冻保存是否会影响粪便菌群组成和活性。
本研究主要采用新鲜猪粪便和超低温冷冻保存的猪粪便样品制备粪菌移植的菌悬液，在37 ℃厌氧条件下进行活菌平板培养，48 h后对其菌落计数，比较超低温冷冻保存粪便样品与新鲜粪便样品的粪菌液的菌落形成数量，评价超低温冷冻保存对猪粪便菌群活性的影响。且挑出两种处理菌悬液培养获得的单菌落进行纯化培养，经16S rRNA基因全长测序鉴定菌落组成，评价超低温冷冻保存对猪粪便菌群组成的影响，为后期进行的粪菌移植试验及应用提供参考，本研究还比较了离心和静置两种粪菌悬液制作方法对粪菌悬液菌组成影响。
1 材料与方法 1.1 粪便样品采集本研究共采集了3次粪便样品，其中2头120日龄杜×长×大三元杂交猪的新鲜粪便各1份，置于放有厌氧袋的冰盒上带回实验室；2头60日龄巴马香猪的新鲜粪便各3份，1份置于放有厌氧袋的冰盒上保存，1份置于装有10%甘油保护液的样品保存管中并混匀后立即放于液氮中冷冻24 h，1份直接放于液氮中冷冻保存24 h；采集了2头90日龄巴马香猪的新鲜粪便各2份，1份置于放有厌氧袋的冰盒上保存，1份直接放于液氮中冷冻保存24 h。所有样品采集后，均立即运回实验室。
1.2 粪便菌悬液的制备在厌氧培养箱(Electrotek, Scientific Limited)中取0.5 g粪便悬浮于7.5 mL的无菌生理盐水中，涡旋混匀仪上将其搅拌5 min混匀。其中一管静置5 min取上悬液，作为静置组[16-17]，另一管805 g离心2 min后取上悬液，作为离心组[24]。将两种方法获得的上层菌液用于后续平板涂布，剩余的上层菌液中加入分析纯甘油(西陇科学，CAS:56-81-5)，使甘油终浓度达到10%(V/V)[21]，分装小管后置于-80 ℃备用[25]。
1.3 粪便菌悬液的稀释及平板涂布取“1.2”中所获得的上层菌悬液于无菌生理盐水中，依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，如图 1所示，取10-4、10-5、10-6这3个稀释梯度，进行涂布，每个梯度2~3个重复。提前制备哥伦比亚血琼脂培养基(ELITE-MEDIA，艾礼生物科技有限公司)，放入厌氧培养箱中耗氧待用。
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图 1 粪菌液稀释梯度的制备及涂布 Fig. 1 Preparation and plate coating of faecal microbial suspensions with different dilution gradients |
平板涂布后，在厌氧培养箱中37 ℃培养48 h，观察平板上的菌落并计数。以菌落形成单位(colony forming unit, CFU)表示，平板计数时，需选择平板在30~300 CFU的无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，高于300 CFU的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜的计数范围，计算两个平板菌落的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每个样品中菌落总数。若有两个连续稀释度的平板菌落在适宜计数范围内时，按式计算：样品中菌落数=平板菌落数之和/[(第一稀释度平板个数+0.1×第二稀释度平板个数)×稀释因子(第一稀释度)]。若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时, 则以最接近30或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
1.5 平板涂布的试验设计将新鲜粪便分别在静置和离心的方法下制备粪菌悬液，分为静置制备新鲜粪菌液组(FS)，离心制备新鲜粪菌液组(FC)。液氮冷冻24 h的粪便及添加甘油后液氮冷冻24 h的粪便在静置的方法下制备粪菌悬液，将其分为液氮冷冻粪便24 h静置制备组(NS), 甘油+液氮冷冻粪便24 h静置制备组(glycerol nitrogen static，GNS)，进行上述的稀释涂布，37 ℃培养48 h后，平板菌落计数。1周后，从-80 ℃超低温冷冻冰箱取出终浓度10%的甘油保存的冷冻粪菌悬液样品，分为静置粪菌液于-80 ℃冷冻1周组(FFS)，离心粪菌液于-80 ℃冷冻1周组(FFC)，液氮冷冻粪便24 h静置制备液于-80 ℃冷冻1周组(NFS)，进行上述的稀释涂布，37 ℃培养48 h后，平板菌落计数。
1.6 菌落纯化及3730xl测序随机从冷冻和新鲜处理组中挑取单菌落，纯化培养后，用液体培养基富集培养，3 000 g离心2 min收集菌体，送检的试验样品经基因组DNA的提取后，扩增细菌16S rRNA基因序列(用27F/1492R引物)，扩增产物在3730xl平台进行Sanger测序(杭州擎科生物技术有限公司)。
1.7 数据统计平板计数所记录的菌落数用R软件中Mann-Whitney U test检验和Kruskal-Wallis检验进行显著性差异分析，显著水平置于0.05，且用R软件中的ggpubr包作图，16S rRNA基因测序结果在RDP网站(https://rdp.cme.msu.edu/classifier)及NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行比对分析，鉴定检测样品的分类及种属。一般将在NCBI上比对得到的同源性在97%以上且同源性最高的物种判断为送检样品的种属。
2 结果 2.1 静置和离心两种处理得到的粪菌悬液对分离培养菌落数的影响静置制备新鲜粪菌液组(FS)、离心制备新鲜粪菌液组(FC)、静置制备粪菌液于-80 ℃冷冻1周组(FFS)、离心制备粪菌液于-80 ℃冷冻1周组(FFC)分别在10-4、10-5、10-63个稀释梯度下涂布，在37 ℃厌氧培养箱中培养48 h后，平板上的菌落数统计如表 1所示，根据上述CFU计算规则，FS组的菌落数为1.54×108CFU·mL-1，FC组的菌落数为1.12×107CFU·mL-1，FFS组的菌落数为1.01×108CFU·mL-1，FFC组的菌落数为3.45×106CFU·mL-1。
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表 1 静置和离心两种处理得到的粪菌悬液对分离培养获得的菌落数的影响 Table 1 Effect of static settlement and centrifugation on the number of colonies obtained by separation and culture from faecal suspension |
静置和离心两种处理下菌落数目的显著性差异分析如图 2A所示，在制备新鲜粪菌液时，静置和离心两种方法处理，分离培养得到的菌落数(粪菌活性)存在显著差异，离心组显著低于静置组(P < 0.05)。但对于冷冻粪菌液，静置和离心两种方法处理下，得到的菌落数无显著差异(P>0.05)。
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NS.液氮冷冻粪便24 h静置制备组；GNS.甘油+液氮冷冻粪便24 h静置制备组。下同。A.粪菌悬液离心对分离培养菌落数影响；B.冷冻对分离培养得到的菌落数影响；C.添加和不添加甘油对冷冻粪菌液分离培养得到的菌落数影响；D.冷冻保存时间对粪菌液分离培养得到的菌落数影响 NS. The faecal microbial suspensions prepared from faeces frozen in liquid nitrogen for 24 h and treated by static state; GNS. The faecal microbial suspensions prepared from faeces frozen in liquid nitrogen for 24 h by static state and cryopreserved with glycerol. The same as below. A. Effect of centrifugation of faecal suspension on the numbers of isolated bacterial colonies; B. Effect of faecal suspension frozen on the numbers of isolated bacterial colonies; C. Effect of cryopreservation of faecal suspension with or without glycerol on the numbers of isolated bacterial colonies; D. Effect of the cryopreservation time of faecal suspension on the numbers of isolated bacterial colonies 图 2 不同粪菌悬液处理方法对分离培养得到的菌落数目影响 Fig. 2 Effect of different treatments of faecal microbial suspensions on the numbers of isolated bacterial colonies in culture |
结合表 1中新鲜和冷冻保存粪便制备的粪菌悬液分离培养得到的菌落数，发现无论采用静置还是离心方法制备的粪菌液，新鲜和冷冻粪便对粪菌活性均无显著影响(图 2B，P>0.05)。提示，若粪菌移植受到时间的限制时，可以考虑采用冷冻处理的粪菌，这在一定程度上提高了粪菌移植的可操作性。
2.3 添加和不添加甘油对液氮保存粪便粪菌活性的影响采集新鲜粪便样品后，有时并不能立即制备粪菌悬液并完成粪菌移植。试验采用添加和不添加甘油两种处理方式研究冷冻保存样品对分离培养的菌落数量的影响。其一是采集新鲜粪便后，立即用液氮冷冻24 h，然后采用静置的方法制备粪菌悬液(NS组)；其二将采集的新鲜粪便放入10%甘油中，混匀后随即快速用液氮冷冻。24 h后，采用静置的方法制备粪菌悬液(GNS组)。同时使用新鲜粪便制作的粪菌悬液作为对照(FS组)。制备的粪菌悬液分别在10-4、10-5、10-63个稀释梯度下涂布，在37 ℃厌氧培养箱中培养48 h后，FS、NS、GNS 3个处理组菌落数目见表 2。FS组的菌落数为5.00×107CFU·mL-1，NS组的菌落数为3.17×107CFU·mL-1，GNS组的菌落数为4.35×107CFU·mL-1。
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表 2 添加和不添加甘油对液氮保存粪便分离的菌落数影响 Table 2 Effect of adding and not adding glycerol on the number of colonies separated from feces preserved in liquid nitrogen |
FS、NS、GNS 3个处理组下粪菌活性的显著差异分析如图 2C所示，3种处理间分离培养的菌落数均无显著差异(P＞0.05)。这提示采集到新鲜粪便样品后，若不能在一定时间内处理新鲜粪便，可考虑将新鲜粪便用液氮冷冻后，在24 h内完成粪菌液制备，这将解决猪粪菌移植中时间限制的难题。
2.4 粪菌悬液－80 ℃冷冻保存对菌落分离数量的影响新鲜粪便经液氮冷冻24 h后制备粪菌悬液，即为液氮冷冻粪便24 h静置制备组(NS)。将其进行平板涂布培养，剩余的粪菌悬液加入终浓度为10%(V/V)甘油，在-80 ℃超低温冰箱保存1周，即粪菌悬液-80 ℃冷冻保存组(NFS)，使用新鲜粪菌悬液(FS)和-80 ℃超低温保存1周的粪菌悬液(FFS)作为对照。在37 ℃厌氧条件下平板涂布培养，48 h后观察记录菌落数，FS、FFS、NS、NFS 4种处理下粪菌悬液细菌培养得到的菌落数目见表 3。FS组的菌落数为2.73×107CFU·mL-1，NS组的菌落数为2.32×107CFU·mL-1，FFS组的菌落数为1.82×107CFU·mL-1，NFS组的菌落数为1.47×107CFU·mL-1。
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表 3 不同粪便处理方式得到的粪菌悬液分离培养得到的菌落数 Table 3 Number of colonies obtained by separation and culture of faecal suspensions obtained by different faecal treatment methods |
FS、FFS、NS、NFS 4种处理下的菌落数目的差异分析如图 2D所示。结果显示，粪便经液氮冷冻24 h后制成的粪菌液与将其置于-80 ℃超低温冷冻保存1周的粪菌液在活性上没有显著差异(P>0.05)。同时发现，FS、FFS、NS、NFS 4组处理均无显著差异，这给粪菌移植技术的实践应用提供了参考，在一定程度上，打破了此技术在时间和空间上的限制。
2.5 冷冻保存对所分离菌落细菌组成类型的影响根据菌落大小、形状、边缘、表面、颜色等特征，从静置制备新鲜粪菌液组(FS)、离心制备新鲜粪菌液组(FC)、静置制备冷冻粪便菌液组(FFS)、离心制备冷冻粪便菌液组(FFC)分别随机挑取17、16、33、21个单菌落，进行纯化培养后，再用液体培养基富集培养，离心收集得到菌体沉淀进行16S rRNA基因全长测序。试验聚焦于粪便冷冻对培养所得到的活菌组成的影响，结果如图 3所示，从属和种的分类水平可以看到，新鲜和经冷冻处理的粪便制备的菌悬液在得到的活菌组成上差异不显著，尽管冷冻后存在一些菌的丢失。新鲜粪便制备的悬液和冷冻粪便制备的菌悬液得到的活菌有62.5%的属是一致的，其中包括乳酸菌、普氏菌、链球菌、埃希氏菌、棍状菌属。在种水平，50%的种是一致的，包括Streptococcus alactolyticus、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus johnsonii和Escherichia fergusonii等。
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图 3 不同处理方式对粪菌悬液中存活菌群组成的影响 Fig. 3 Effect of different treatments on the composition of live bacteria of faecal microbial suspensions |
近年来，猪粪菌移植的应用越来越广，不仅有猪到猪的粪菌移植[20, 26]，还有猪到无菌小鼠的粪菌移植研究[27]。但与人的粪菌移植不同，猪的粪菌移植有时会受到时间和空间的限制，为了突破这一局限，目前基本都是用超低温冷冻保存粪菌的方法来进行粪菌移植。然而，很少有证据提示粪便冷冻处理会对粪菌移植中供体微生物产生何种影响。本研究采用了传统平板培养菌落计数并结合细菌16S rRNA基因全长测序鉴定的方法，分别对菌的活性以及菌群组成的多样性进行评估。研究中共设置了7个处理组，评估了粪菌液制备过程中静置和离心两种处理方法对粪菌活性和组成的影响，由于微生物的分子大小不一，在活性和组成上均有一些差异。离心会使菌群活性显著降低，这可能是由于离心将一些微生物沉淀，而基于重力沉降的静置方法，细菌损失反而更少。也有研究报道，采用重力沉降的方法，静置时间长短也会对结果产生显著的影响[28]，故本研究中严格控制了静置时间。
本研究还比较了新鲜粪菌悬液与-80 ℃超低温冷冻保存1周悬液培养得到的菌落数，在多次重复试验中均发现粪菌活性无显著差异，且在粪菌组成上也没明显差异，尽管存在少数菌的缺失，这与随机挑选的菌株数目也有关系。在人类医学领域，虽然利用新鲜粪菌治疗IBD的疗效优于冷冻粪菌[22]，但也有研究报道，新鲜粪菌与冷冻粪菌治疗艰难梭菌感染的疗效无显著差异，冷冻粪菌即使保存6个月后对艰难梭菌治疗依然有效[21]。本试验还比较了新鲜粪便、液氮冷冻保存24 h的粪便、以及加入甘油在液氮冷冻24 h粪便制成的粪菌悬液在菌落数及菌活性方面的差异，结果发现，3种处理组间菌落数及菌的活性无显著差异，但是加了甘油保护剂的处理组菌活性的确比液氮冻存组的菌活性高，尽管差异未达到显著水平。这可能是由于甘油可以防止微生物细胞在超低温冷冻保存下受到损伤。本研究还更深入地探究了经液氮冻存24 h后的粪便制成的粪菌液放于－80 ℃超低温保存1周后的粪菌活性，结果发现，这两种处理间粪菌活性也无显著差异。与新鲜粪菌相比，也是如此。这大大打破了猪粪菌移植的时间和空间限制。肠道中90%以上微生物为厌氧菌，已有研究表明，在空气中制备的粪菌悬液菌活性极显著降低[29]，故本研究中7种处理下的粪菌悬液的制备均在厌氧操作平台中进行。新鲜和冷冻处理的粪菌液在涂布平板培养后分离的菌在组成上没有显著的差异，虽然存在一些菌的缺失。这与挑选的进行测序的菌落数量有关，且一些菌经冷冻后重新培养复苏的时间也不一致。在本研究中，乳酸菌、普氏菌、链球菌、棍状菌及埃希氏菌等均不受冷冻处理影响，很可能是这些菌对冷冻环境有良好的耐受性且易于利用营养物质复苏生长。现已有研究也报道，冷冻并未显著改变存活的粪便微生物的组成[29]，这与本研究的结果一致。
本试验采用传统细菌培养方法，利用合适的培养基对粪便菌群进行厌氧培养，通过梯度稀释和菌落计数来评价粪菌悬液活性。虽然该方法存在一定的局限性，不同菌的生长时间和所需营养物质有差异，但本研究挑选了一个营养丰富的广谱培养基—哥伦比亚血琼脂培养基，且统一培养48 h，所有不同试验组的培养方法和培养时间都是一致的，这对于比较组间差异来说是可行的。另外，本研究虽未收集平板上的所有菌落进行测序分析，但所分析单菌落是从所有平板上根据不同菌落形态随机挑选而得，挑取的菌落能够包含大部分培养基生长出的菌落特征，有很好的随机性，在一定程度上能代表所分析样品情况。虽然本研究的结果展示了这几种低温处理方法对粪菌活性是无显著影响的，但这种方法只显示了能在相应培养基和培养条件下生长的有限微生物种类和数量，并不能体现出样品整体上的微生物数量和组成的差异，因为目前还没有一种能适应所有肠道菌群生长的广谱培养基。已有研究报道了一种叠氮溴化丙锭(PMA)结合16S rRNA基因测序及qPCR的方法可以检测到粪便样品中活菌的丰度及多样性[29-30]。因此，未来还需要结合新技术继续探索不同处理组样品整体微生物数量和组成的差异。
4 结论在猪的粪菌移植中，采用静置的方法制备粪菌悬液，经一定时间的低温冷冻处理，其与新鲜粪便制成的粪菌悬液在菌活性与组成上没有显著差异。研究结果有利于打破猪粪菌移植中时间和空间的限制。对养猪业中粪菌移植利用以及猪肠道菌群移植无菌小鼠研究都具有指导性意义。
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