, WANG Pan, LUO Nanjian, XU Huizhong, WANG Wei, ZHANG Rong, CHENG Lei, ZHAO Wei, ZHAO Yongju
胎盘是哺乳动物妊娠期间形成的母胎之间用于物质交换的临时性器官，并具有分泌激素以及免疫防御等功能[1]。胎儿主要通过胎盘血液循环系统与母体进行物质交换，获取营养及排泄代谢废物。妊娠期间胎盘交换的大量增加主要取决于胎盘血管的增长[2]。研究发现，胎儿营养物质的供应取决于胎盘的血液灌注量，血管化程度决定着胎儿的发育[3]。反刍动物胎盘血管发生开始于妊娠早期，包括母体胎盘血管发生(子宫内膜的胎毛部分)和胎儿胎盘血管发生(绒毛膜尿囊的子叶部分)，并且持续整个妊娠期[2]。胎儿胎盘血管发生是血管新生的结果[4]。胎盘血管生成是胎盘发育的关键过程，其正常形成保证了胎儿营养物质的供应，满足了其存活及发育需求；而血管形成障碍会造成胎盘功能逐渐衰退，引起胎儿宫内生长受阻、子痫等妊娠疾病[5-6]，甚至导致流产、早产、母胎死亡等[7]。
胎盘血管形成过程受多种因子的调控[8]，主要因子包括血管内皮生长因子(VEGF)家族及其主要的跨膜酪氨酸激酶受体(FLT1和KDR)[9-10]、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)[11]、血管生成素1/2(angiopoietins 1/2, ANGPT1/2)及其酪氨酸激酶受体(TEK)[12-13]、内皮一氧化氮合酶(NOS3)[14]、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)[15]、可溶性鸟苷酸环化酶(GUCY1B3)[16]等。最近研究发现，卵泡刺激素受体(FSHR)与VEGF作用类似，能够促进胎盘血管生成[17]。VEGF和ANGPT家族是调控内皮细胞的两条特异性信号通路，在血管形成过程中发挥关键的作用[12-13, 18]。FGF2作为成纤维家族成员，提供最原始的促血管形成刺激信号，有助于血管内皮细胞增殖和血管形成[15, 19]。然而，胎盘血管研究多集中在人和小鼠上，在山羊上相关研究较少，且血管形成相关基因的表达与山羊胎盘血管形成的相关研究尚未见报道。
大足黑山羊属于国家级遗传资源，具有较高的繁殖性能，初产母羊平均单胎产羔率达197.31%，经产母羊达272.32%[20]。本研究以大足黑山羊胎儿胎盘组织为研究对象，分析山羊妊娠早期胎儿胎盘血管发育模式，并将其与主要血管生成因子及其受体进行关联分析，为揭示山羊胎盘血管形成机制，进一步提高山羊繁殖性能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集随机选取8月龄、体格相近、身体健康的大足黑山羊青年母羊15只，饲养于西南大学大足黑山羊研究所，所有羊只的饲养管理方式、饲料配方和环境均一致。经同一种公羊自然交配后(以末次配种当天记为0 d)随机分为5组(妊娠20 d组、妊娠25 d组、妊娠30 d组、妊娠45 d组、妊娠60 d组)，每组3只羊。妊娠20、25和30 d组母羊经剖腹产手术采集胎儿和胎儿胎盘组织，妊娠45和60 d组采用屠宰方式获得胎儿和胎儿胎盘组织。
1.2 免疫组织化学染色及胎盘血管图像分析测定免疫组织化学染色：石蜡切片经脱蜡，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭(3% BSA)，一抗(Ki67，1:400；CD31，1:300，购自于北京博奥森生物技术有限公司)孵育、二抗(HRP标记羊抗兔二抗，购自于武汉赛维尔生物科技有限公司)孵育后，DAB显色，苏木精复染脱水，透明，封片，镜检。
胎盘血管检测：在显微镜下随机获取2~6张图像(放大倍数100×；总面积≥1×107 μm2)，用图像分析系统测量血管数量、周长、面积以及组织的总面积，计算出CAD(CAD=毛细血管总面积/组织区域面积)；CND(CND=毛细血管总数/单位组织区域面积)；CSD(CSD=毛细血管总周长/单位组织区域面积)；APC(APC=毛细血管总面积/毛细血管根数)。血管内皮细胞增殖率测定：在显微镜下随机获取6~15张任意区域的图像(放大倍数400×)，用katikati2软件对血管内皮细胞及血管周围细胞进行计数，计算出Ki67阳性细胞率。
1.3 样本总RNA提取及反转录cDNA合成使用TRIzol试剂提取胎儿胎盘组织的总RNA，使用Nanodrop 2000微量核酸蛋白测定仪测RNA浓度和OD值，－80 ℃保存。采用TIANGEN公司的Fast Quant RT Kit(with gDNA)试剂盒反转录合成cDNA，样品-20 ℃保存。
1.4 定量引物设计根据GenBank中山羊VEGFA、FLT1、KDR、ANGPT1、ANGPT2、TEK、FGF2、FGFR1、FGFR2和β-actin基因的mRNA序列，利用NCBI中Primer-BLAST在线设计引物。引物信息如表 1所示，由北京六合华大基因科技有限公司合成。
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表 1 荧光定量引物信息 Table 1 The information of primer sequences for qPCR |
利用TIANGEN公司的Fast Quant RT Kit(With gDNA)试剂盒反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，反应总体积为10 μL：Go TaqQ-PCR Master Mix(2×)5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。PCR程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，Tm退火1 min，39个循环。反应结束后进行熔解曲线分析。
1.6 数据统计分析每组试验设计3个生物学重复，试验结果均以“平均值±标准误”表示。数据统计采用GraphPad Prism 6.0软件中的“Unpaired t test”进行差异显著性检验，用标记字母法表示差异显示性。qRT-PCR结果采用5个时期的平均值作为参考数据，计算ΔΔCt=(ΔΔCt待测基因-ΔΔCt内参基因)，根据公式算出基因的相对表达量。采用SPSS 24.0 Bivariate Correlations进行相关性分析。
2 结果 2.1 山羊妊娠早期胎儿体重及体长大足黑山羊妊娠早期不同时间点胎儿体重及体长见图 1。在妊娠20 d时未采集到胎儿，主要是因为胎儿太小和组织过于透明不易区分。结果显示，随着妊娠的进行，胎儿体重和体长呈逐渐增加趋势，且各时期间存在显著差异(P < 0.05)。
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不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下同 The different letters indicate significant difference(P < 0.05). The same as below 图 1 山羊妊娠早期胎儿重量及体长 Fig. 1 Fetal body weight and length in the early pregnancy of goat |
通过免疫组织化学染色对胎儿胎盘的血管进行检测。胎儿胎盘的组织学结构见图 2。图 2A为妊娠20 d的胎膜CD31免疫组化图，未观察到血管；图 2B为妊娠25 d的胎膜Ki67免疫组化图，可见大量的增殖细胞，此时逐渐形成腔室，且胎膜上分布着大量的毛细血管；图 2C为妊娠25 d的胎膜CD31免疫组化图，可见血管腔开始形成。图 2D为妊娠25 d的胎膜阴性对照图。
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A.妊娠20 d的胎膜CD31免疫组织化学染色; B.妊娠25 d的胎膜Ki67免疫组织化学染色; C.妊娠25 d的胎膜CD31免疫组织化学染色; D.妊娠25 d的胎膜免疫组织化学染色阴性对照。*. Ki67阳性细胞；#. CD31阳性染色；Fv.胎儿胎盘；Tr.滋养层 A. CD31 immunohistochemical staining of fetal membrane on pregnancy 20 d; B. Ki67 immunohistochemical staining of fetal membrane on pregnancy 25 d; C.CD31 immunohistochemical staining of fetal membrane on pregnancy 25 d; D. Negative control of immunohistochemical staining of fetal membranes on pregnancy 25 d. *. Ki67 positive cells; #. Positive immuno-staining of CD31; Fv. Fetal placenta; Tr. Trophoblast 图 2 胎儿胎盘Ki67及CD31免疫组织化学染色图 Fig. 2 Representative photomicrographs of immunohistochemical staining for Ki67 and CD31 in fetal placenta |
为了确定山羊胎盘血管内皮细胞的增殖情况，采用Ki67标记增殖细胞，对管腔内及血管周围细胞进行了计数。结果显示，妊娠25 d时可见血管腔，但血管内皮细胞增殖率随着妊娠的进行逐渐降低，25 d的增殖率是45~60 d的1.3~1.6倍，且有统计学显著差异(图 3A)。利用CD31抗体标记血管，通过显微图像分析测定了血管数量、周长及面积，计算出CAD、CSD、CND及APC，分析妊娠早期山羊胎儿胎盘血管分布情况。结果显示，CAD呈逐渐增加趋势，在60 d最高，此时CAD是25~30 d的1.4~1.7倍，且有显著性差异(图 3B)。CSD在妊娠早期无显著性变化(图 3C)，CND呈先增高后降低趋势(图 3D)，APC呈先降低后增高趋势(图 3E)，但均无统计学差异，这可能是试验动物个体差异过大所导致的。此外，血管内皮细胞Ki67阳性率与CAD(r2=－0.820；P=0.001)呈极显著负相关，与APC(r2=－0.639；P=0.025)呈显著负相关，与CND(r2=0.586；P=0.045)呈显著正相关，但与CSD(r2=0.003；P=0.994)无显著相关性。
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图 3 山羊妊娠早期胎儿胎盘血管检测 Fig. 3 Measurements of vascularity for fetal placenta during the early pregnancy in goat |
妊娠早期胎儿胎盘VEGFA的表达量随着妊娠的进行逐渐增加，60 d的表达量是20~25 d的2.5~ 6.0倍，且有统计学显著差异(图 4A)。FLT1的表达量先增高后降低，在30 d达到峰值，此时是20~25和45~60 d的1.5~2.0倍(图 4B)。KDR的表达量也呈现先增高后降低的趋势，但在45 d达到峰值，此时表达量是20~25 d的2.7~5.0倍，且有统计学显著差异(图 4C)。
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图 4 山羊妊娠早期胎儿胎盘血管形成相关基因的表达 Fig. 4 Expression of angiogenesis-related genes in fetal placenta during the early pregnancy in goat |
ANGPT1的表达量呈现先降低后升高的趋势，在妊娠25 d最低，20和30~60 d的表达量是25 d的3.5~9.0倍，且有统计学差异(图 4D)。ANGPT2的表达量先升高后降低，在30 d时达到峰值，此时是20~25和45~60 d的2.6~4.0倍，且有统计学显著差异(图 4E)。TEK的表达变化同ANGPT2，30 d的表达量是20~25和45~60 d的2.7~4.3倍, 且有统计学显著差异(图 4F)。
妊娠早期，FGF2的表达量呈先升高后降低的趋势，在妊娠30 d达到峰值，此时是20和60 d的2.1~6.8倍，且有统计学显著差异(图 4G)。FGFR2的表达变化同FGF2，但无统计学显著差异(图 4H)。
2.4 妊娠早期胎儿胎盘血管形成相关基因表达量之间的相关性血管形成相关基因的表达量之间的相关性分析结果见表 2。结果显示，VEGFA的受体FLT1与ANGPT1和TEK的表达量呈显著正相关(P < 0.05)；KDR与FGF2的表达量呈显著正相关(P < 0.05)。ANGPT2与TEK的表达量呈极显著正相关(P < 0.01)，与FGF2的表达量呈显著正相关(P < 0.05)；TEK与FGF2的表达量呈显著正相关(P < 0.05)。
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表 2 胎儿胎盘血管形成相关基因mRNA表达的相关性 Table 2 Correlation in mRNA expression among angiogenesis-related genes in fetal placenta |
山羊妊娠早期胎儿胎盘血管分布与血管生成相关基因的相关性分析结果见表 3。CAD与VEGFA的表达量呈极显著正相关(P < 0.01)，CND与FLT1的表达量呈显著正相关(P < 0.05)，APC与VEGFA的表达量呈极显著正相关(P < 0.01)。
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表 3 胎儿胎盘血管分布与主要血管形成基因mRNA表达的相关性 Table 3 Correlation of measures of angiogenesis with the expression of mRNA for the major angiogenic genes in the fetal placenta |
胎盘血管形成主要发生在妊娠早期，并在整个妊娠期持续进行。胎盘血管的发育是母胎间物质交换的关键，对胎儿的生长发育以及妊娠的维持起到至关重要的影响。妊娠胎盘血管的发育和血管生成因子的表达降低可能是引起胎儿生长受限的根本原因。研究发现，胎盘血管化程度的血管密度的增加是多产性的一个组分，有利于提高产仔数[21]。胎盘血管发育和血管生成因子表达与胎儿大小有关[22]，通过血管铸型研究也发现，胎儿初生质量与血管网面积呈高度相关[23]。大足黑山羊属于国家级遗传资源，具有较高的繁殖性能，初产母羊平均单胎产羔率达197.31%，经产母羊达272.32%[20]，但胎盘血管生成相关研究目前鲜见报道，因此，研究高繁山羊妊娠早期胎盘血管生成具有重要意义。本试验首先测定了大足黑山羊妊娠早期的胎儿体重及体长，发现其体重和体长随着妊娠的进行逐渐增加，且在不同时期有极显著差异，符合妊娠期间胎儿的体重及体长增长趋势[2]，说明山羊妊娠正常。妊娠60 d时，大足黑山羊胎儿体重达33.36 g，比同时期多为单胎的辽宁绒山羊胎儿(27.42 g)高[24]，但是低于绵羊同时期的胎儿重[25]。可能是由于高繁山羊胎盘血管密度较大，不同物种间胎盘血管发育以及血管生成因子表达存在差异。
研究发现，在绵羊中母体胎盘和胎儿胎盘的血管生长及重塑模式不同[26]。研究高繁山羊妊娠早期胎儿胎盘和母体胎盘血管发育模式对于妊娠维持以及提高山羊繁殖性能具有重要意义。本研究以大足黑山羊胎儿胎盘组织为试验材料，探索山羊胎儿胎盘血管发育模式。早期胚胎发育主要起始于细胞的生长、增殖、分化、迁移和蛋白质的合成及运输[27]。在人、猪、绵羊和大鼠早期妊娠过程中，胎盘血管内皮细胞增殖均处于较高水平[25, 28-30]。本试验也发现，胎儿胎盘血管内皮细胞处于高增殖状态，且随着妊娠的进行逐渐降低，表明山羊胎儿胎盘血管形成可能主要发生在妊娠早期。有趣的是，在胚胎移植后的绵羊胎膜上没有类似的细胞增殖情况发生[31]。这表明血管内皮细胞的高增殖率为早期妊娠识别以及胚胎附植提供了细胞基础。但是，调控山羊胎盘血管内皮细胞增殖的分子机制还需进一步研究。
评价胎盘血管分布的参数主要有血管直径、CAD、CND、CSD、APC等[32]。目前关于胎盘血管分布参数的计算方法主要有组织切片法和血管灌注法，而妊娠早期多用组织切片法[25]。本试验利用组织切片法免疫组化检测了胎儿胎盘血管生长模式，结果显示，妊娠25 d胎儿胎盘上才可见血管腔，CAD随着妊娠的进行逐渐增加。表明胎儿胎盘血管随着胎盘的发育以及妊娠的维持不断发育，CAD的增加主要是由于单位血管的直径增粗或(和)血管数量的增加。本研究发现，CSD在早期妊娠胎儿胎盘无明显变化，山羊妊娠30 d前，胎儿胎盘CND逐渐增加，但APC基本保持不变，表明在妊娠初期胎儿胎盘血管数量的增加占主导地位；而在妊娠30 d后，CND呈降低趋势，而APC逐渐增加，说明在此期间随着胎盘的发育胎儿胎盘新生血管生长，单位血管的直径增加占主导地位。本课题组前期研究表明，山羊妊娠30 d时，胎膜上可见绒毛叶阜(即子叶开始出现)，且其表面布满血管[33]。这进一步说明在子叶形成前，CAD的增加主要是由于血管数量的增加所致；而在子叶形成后，CAD的增加主要通过单位血管的直径增加实现。进而表明，胎儿胎盘的微脉管系统主要通过增加分支，从而导致毛细血管数目和表面密度大大增加，胎儿胎盘血管随着早期妊娠的发展不断发育。而母体的胎盘毛细血管床主要是通过增加毛细血管的大小来发展的，毛细血管数目或表面密度只有很小的增加[11]，这与前期研究的胎儿胎盘不同。此外，本试验发现，胎儿胎盘Ki67阳性率与CND呈显著正相关，这说明增殖的细胞主要用于毛细血管形成分支，从而增加毛细血管的数量。
3.2 山羊血管形成相关基因对血管生成的影响胎盘血管形成过程受多种因子的调控。本试验对VEGFA及其受体FLT1、KDR，ANGPT1/2及其受体TEK，FGF2及其受体FGFR2的mRNA水平进行了测定，并对胎儿胎盘血管形成基因表达之间以及与胎儿胎盘血管形成进行了相关性分析。VEGF家族是一种具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用的高度特异性促血管形成因子[34]，参与胎儿和胎盘血管生成[35]。VEGFA在大多数组织中都有表达，其可以通过与细胞上的FLT1、KDR结合发挥相应的作用[36]。研究发现，VEGFA通过与其特异性受体FLT1或KDR结合激活下游信号传导通路，诱导内皮细胞增殖、迁移及血管生成[37]。本研究在山羊胎儿胎盘上检测了VEGFA及其受体的表达，且与其他基因家族及胎盘血管分布存在一定的相关性，如FLT1与ANGPT1和TEK存在显著正相关，KDR与FGF2存在显著正相关。VEGF需要与其他血管生成因子协同作用来调节胎盘血管生成[38]，研究发现，ANGPT1结合TEK受体参与血管发育的稳定和成熟，并协同增加VEGF作用[39]。说明山羊胎盘血管形成中，VEGFA可能通过FLT1受体与ANGPT1及其受体TEK结合参与新生血管的成熟和稳定，山羊胎儿胎盘子叶血管生成与VEGF和ANGPT协同作用密切相关。此外，VEGFA的表达与CAD和APC存在极显著正相关，FLT1的表达与CND存在显著正相关。这说明，VEGFA可能在山羊妊娠早期胎儿胎盘血管发育中起主要作用，VEGFA主要通过与其受体FLT1结合促进胎儿胎盘血管形成分支。这与VEGFA参与毛细血管床的分支形态发生一致[40]。VEGFA在分支血管形成过程中升高，其主要通过影响滋养层细胞及内皮细胞的增殖发挥作用[41]。
ANGPT1/2作为胎盘分泌的主要血管形成因子，主要影响内皮细胞存活及血管重塑，从而参与胎盘发育及血管形成[42]。本研究发现，山羊胎儿胎盘在早期发育过程中，ANGPT1/2及其受体的表达变化均是先升高后降低，这和绵羊上的研究结果一致[16]。ANGPT1及TEK与FLT1存在显著正相关，并且FLT1与CND存在显著正相关，这可能由于ANGPT1与VEGF协同作用增加了管腔直径[43]。此外ANGPT2及TEK与FGF2存在显著正相关；ANGPT2与TEK存在极显著正相关。研究发现，ANGPT2是ANGPT1的天然拮抗剂，能竞争性抑制ANGPT1与TEK的结合[44]。ANGPT2在山羊妊娠早期胎盘中可能通过影响VEGF和FGF2对血管生成起调控作用。
FGF2属于成纤维生长因子家族成员，促进内皮细胞的迁移从而促进新血管形成[45]。本研究结果发现，FGF2及FGFR2在妊娠30 d的胎膜上表达最高。研究发现，上调FGF2的表达有助于血管内皮细胞增殖及血管生成[19]。FGF2与VEGFA受体KDR以及ANGPT2和受体TEK均呈显著正相关，表明FGF2可能与其他血管生成因子(如VEGFA和ANGPT2)共同在胎儿胎盘血管分支形态发生上起重要作用。此外，FGFR2的表达升高有助于体外滋养层细胞的生长分化，从而导致滋养层细胞增多[46]。这些结果表明，FGF2有助于胎儿胎盘上血管的生成，也进一步证实山羊子叶在妊娠30 d开始形成。
4 结论本试验以大足黑山羊胎儿胎盘组织为研究对象，分析了山羊妊娠早期胎儿胎盘血管发育模式，并将其与主要血管生成因子及其受体表达情况进行了关联分析。结果表明，胎儿体重和体长随着妊娠的进行逐渐增加，且血管内皮细胞阳性率处于较高水平(>26%)，山羊胎儿胎盘CAD随妊娠的进行逐渐升高；CND在妊娠25~30 d增加，30~60 d降低，APC呈相反趋势；CSD无显著变化。表明在妊娠30 d前，胎儿胎盘主要通过毛细血管形成分支促进血管面积的增加；而在30~60 d，主要通过单位血管的增粗来促进血管面积的增加，并且血管生成相关基因的表达在妊娠30 d时较高，这可能和子叶开始形成有关。随着妊娠的进行，VEGFA的表达逐渐升高，且与血管分布存在一定的相关性。综上表明，山羊妊娠早期胎儿胎盘中VEGFA可能通过其受体结合与其他血管生成因子共同作用调控胎儿胎盘血管形成。本试验为揭示山羊胎盘血管形成机制，进一步提高山羊繁殖性能奠定了基础。
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