随着人民生活水平的日益提高，生长速度快但口感欠佳的三元杂商品猪的肉质越来越难以满足社会多层次的消费需求[1]，因而提升高品质猪肉的生产效率已成为目前猪育种工作的重要组成部分。巴马香猪是广西特有的小型猪地方品种，以其优良的肉品质著称，素有“一家煮肉四邻香，七里之遥闻其味”的美称[2]，但由于其选育程度低、体型小、生长缓慢等特点，巴马香猪的产业化发展受到了严重制约。在猪的养殖生产中发现，不同猪种间的脊椎数差异很大，如西方猪种的脊椎数为21~23根[3]，而巴马香猪的脊椎数比西方猪种少2~3根，与其他中国地方猪种和野猪相一致[4-5]。据统计，每增加1根脊椎可使商品猪的胴体长度增长约80 mm，体重增加约4~8 kg[6]，可带来很大的经济效益。前人认为，西方猪种产肉性能更高与脊椎数密切相关，脊椎数的增加使得脊柱、背最长肌加长和胸腹腔的容积增大[7]。因此，寻找并鉴定影响猪脊椎数性状的主效基因和因果突变位点一直受到研究人员的关注。2003年，Sato等[8]对梅山猪×杜洛克F2资源群体进行研究后发现，7号染色体上存在与脊椎数变异相关的位点。Mikawa等[9]将7号染色体上与脊椎数相关的基因进行了定位，并命名为VRTN (vertebrae development homolog)。Fan等[10]通过全基因组关联分析及精细定位等方法，鉴定出VRTN基因中一个291 bp的插入(VRTN ins291)突变为猪脊椎数变异的因果突变。Hirose等[11]对杜洛克的研究发现，VRTN基因纯合突变(ins/ins)个体的体长比野生型(-/-)个体更长；Burgos等[12]发现，VRTN基因纯合突变个体具有更大的体重；Nakano等[13]发现，将VRTN作为分子标记选育时对产肉性状和肉质性状没有不良影响。在巴马香猪群体中同样存在脊椎数变异，综合以上研究结果来看，VRTN ins291可以作为一个不影响巴马香猪肉品质的潜在分子育种标记。有研究发现，巴马香猪群体中VRTN ins291拥有15%的等位基因突变频率[9]，说明该位点在巴马香猪群体中具有很大的选育潜力，但该研究检测的个体数较少(n=31)。
本研究以巴马香猪保种群体为对象，对VRTN基因进行了编码序列克隆、生物信息学和组织表达分析，检测了保种母猪群体(n=279)中VRTN ins291的频率分布，并将基因型与乳头数和产仔数性状进行了关联分析，为应用VRTN基因作为提高巴马香猪生产性能的分子标记提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验样品试验动物来自广西壮族自治区巴瑶族自治县巴马原种香猪农牧实业有限公司保种群体的3头0日龄巴马香猪(组织样品)和279头经产母猪(血液样品)。
1.2 主要试剂TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖购自北京全氏金生物技术有限公司；PCR Mix、DNA Marker、Loading Buffer购自广东东盛生物有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇购自广西南宁一棵松生物有限公司；Trizol、反转录试剂盒购自TaKaRa公司。
1.3 主要仪器、设备PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、全能成像系统购自美国Bio-Rad公司；微量紫外分光光度计购自美国Quawell公司；高速冷冻离心机购自Eppendorf公司；电子天平购自上海恒平科学仪器有限公司；微波炉购自广东格兰仕集团有限公司；超净工作台购自上海尚净仪器有限公司。
1.4 巴马香猪组织DNA和RNA提取根据TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA；采用Trizol法提取0日龄广西巴马香猪心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书合成cDNA。
1.5 引物的设计与合成以GenBank中VRTN基因mRNA序列(NM_001195113.1)和ENSEMBL中Sus scrofa VRTN基因序列(ENSSSCT00000002625.3)为参考，利用Oligo 7软件设计VRTN基因编码区扩增引物、多态性位点检测引物和荧光定量PCR引物(表 1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 1 PCR引物 Table 1 Primers for PCR |
以巴马香猪cDNA为模板，扩增巴马香猪VRTN编码区序列。PCR反应体系35 μL：Taq Mix 17.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 14.5 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，最适温度退火30 s，72 ℃延伸20 s，共32个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。取5 μL PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测有目的条带后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.7 巴马香猪VRTN基因编码区序列生物信息学分析参考戴开宇等[14]、奉玲丽等[15]、张跃博等[16]的方法对巴马香猪VRTN基因编码区进行生物信息学分析，包括序列分析、蛋白基本理化性质分析、空间结构分析、亲疏水性分析、磷酸化位点预测、糖基化位点预测、跨膜结构预测、信号肽预测、亚细胞定位预测、蛋白功能区预测、蛋白互作分析、物种间序列同源性分析和系统进化树构建。
1.8 荧光定量PCR检测巴马香猪VRTN的组织表达使用反转录后的cDNA为模板，以18S RNA为内参，利用荧光定量PCR检测VRTN基因在0日龄巴马香猪心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织中的表达。反应体系：SYBR染料5 μL, 模板1 μL，V1-F/R或18S-F/R各0.4 μL，ddH2O 3.2 μL。反应程序：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火延伸30 s，循环45次。采用2-△△Ct法计算VRTN基因在0日龄巴马香猪各组织的表达量，利用SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析后，使用Graphpad prism 7软件作图。
1.9 巴马香猪VRTN ins291多态性检测以巴马香猪DNA为模板，ins-F/R为引物，扩增巴马香猪VRTN ins291位点序列，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.10 VRTN ins291基因型与乳头数、产仔数性状的关联分析统计279头巴马香猪经产母猪左侧乳头数、右侧乳头数、总乳头数、两侧最大乳头数和平均产仔数的数据，利用SAS 9.2软件一般线性模型对3种不同基因型进行分析，模型：Yi=μ+Gi+ei，其中，Yi为巴马香猪表型值，μ为表型均值，Gi为基因型效应，ei为随机残差，结果以“最小二乘均值±标准误”表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 巴马香猪VRTN基因编码区序列分析通过PCR扩增、测序分析、拼接及数据库序列比对，获得了巴马香猪VRTN基因编码区全长序列2 097 bp(图略)，编码一条由698个氨基酸组成的多肽链。
2.2 巴马香猪VRTN蛋白结构分析 2.2.1 巴马香猪VRTN蛋白基本理化性质利用ProtPara tool软件分析VRTN蛋白基本理化性质结果显示，巴马香猪VRTN基因编码蛋白分子式为C3490H5490N974O989S32，分子质量为77 943.84 u，等电点为9.33，不稳定系数为62.96，亲水性平均系数(GRAVY)为-0.275，脂溶指数为81.25。VRTN编码多肽的20种氨基酸组成见图 1，其中亮氨酸(Leu)含量最高占12.3%，天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)含量最低均占1.6%，带负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)共65个占9.3%，带正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)共83个占11.9%。
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图 1 巴马香猪VRTN基因编码蛋白氨基酸组成 Fig. 1 Amino acid composition of VRTN gene coding protein of Bama Xiang pig |
利用SOPM软件预测蛋白质二级结构结果显示，α-螺旋区域共263个氨基酸占37.68%，延伸链区域共77个氨基酸占11.03%，β-折叠区域共36个氨基酸占5.16%，无规则卷曲区域共322个氨基酸占46.13%。ProtScale亲疏水性分析显示，构成此编码蛋白的氨基酸多为亲水性氨基酸，编码蛋白为亲水性蛋白，亲水性氨基酸占总氨基酸数的59.08%，疏水性氨基酸占总氨基酸数的40.92%，其中，第305位氨基酸分值最低，为－3.500，第640位氨基酸分值最高，为1.933(图 2A)。利用SWISS-MODEL构建了猪VRTN蛋白三级结构(图 2B)。
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A.亲-疏水性分析；B.三级结构；C. CDD功能区预测；D. SMART功能区预测(HTH.螺旋转角螺旋域；RPT.内部重复序列) A. Hydrophilic-hydrophobic property prediction; B. Tertiary structure prediction; C. Function domain prediction of CDD; D. Function domain prediction of SMART (HTH. Helix-turn-helix domains; RPT. Internal repetition sequence) 图 2 巴马香猪VRTN蛋白结构和功能预测 Fig. 2 Structure and function prediction of the Bama Xiang pig VRTN protein |
通过NetPhos预测发现，巴马香猪VRTN蛋白共有70个磷酸化位点，其中苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸磷酸化位点分别为22、44和4个。通过YinOYang在线分析软件预测发现了12个O-糖基化位点，分别位于第60、146、164、169、291、293、386、390、452、530、541、581位氨基酸；NetOGlyc预测发现了17个O-糖基化位点，分别位于第64、250、252、253、254、258、452、457、461、482、500、549、559、581、594、596、609位氨基酸。综合两个网站结果认为，在第452和581位氨基酸最有可能存在O-糖基化位点。通过NetNGlyc预测发现，第579位氨基酸为N-糖基化位点。
2.2.4 跨膜结构、信号肽和亚细胞定位预测MHMM Server v.2.0和SignalP 4.1 server未预测到巴马香猪VRTN蛋白的跨膜结构和信号肽序列，MitoProt Ⅱ v1.01预测发现，VRTN不存在信号肽，位于线粒体的可能性为0.191 3；TargetP 1.1 Server预测发现，VRTN可存在于除叶绿体、线粒体和分泌途径外的任何其他位置，PSORT Ⅱ Server预测发现，VRTN存在于细胞质、细胞核、细胞骨架、线粒体、过氧化物酶体和液泡的几率分别为56.5%、26.1%、4.3%、4.3%、4.3%和4.3%，综合以上预测结果认为，巴马香猪VRTN蛋白最可能存在于细胞质和细胞核中。
2.3 巴马香猪VRTN蛋白功能预测、互作分析和序列保守性分析通过CDD预测发现，巴马香猪VRTN蛋白在275~306位氨基酸区域有一个螺旋转角螺旋域(helix-turn-helix domain, HTH)超家族结构功能区(图 2C)，预测评估值为1.25×10-3；SMART预测发现，在第5~20和247~275位氨基酸区域有2个低复杂度区域，还存在DUF1767、PGAM和THAP等共17个没有显示的阈值较低区域；在第291~436和530~687位氨基酸区域有2个内部重复结构，预估值都为2.10×10-8(图 2D)。通过String网站分析发现，巴马香猪VRTN蛋白与NR6A1、PROX2和LRRC74A等蛋白具有互作关系(图 3)。利用clustalX软件分析多物种间VRTN蛋白氨基酸序列保守性，发现在5~20位氨基酸低复杂度区域和HTH超家族结构功能区保守性高，247~275位氨基酸低复杂度区域和两个内部重复区域保守性低，主要保守区域位于蛋白序列两端(1~251位氨基酸和700~770位氨基酸)。
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图 3 巴马香猪VRTN蛋白互作网络图 Fig. 3 Network diagram of proteins interacting with Bama Xiang pig VRTN |
使用MegAlign软件分析巴马香猪VRTN基因编码区序列与GenBank中猪(NM_001195113.1)、牛(NM_001206630.1)、人(KJ894163.1)、黑猩猩(XM_016926411.2)、猕猴(NM_001194898.1)、家犬(XM_ 022422491.1)、小鼠(NM_001168589.2)、褐家鼠(XM_003750199.4)、鸡(XM_015287674.2)、斑马鱼(NM_001077140.1)的核苷酸序列一致性分别为99.5%、88.4%、87.7%、87.7%、87.5%、87.4%、79.5%、79.3%、67.1%、55.9%，哺乳动物相近物种之间的序列一致性更高；基于不同物种的VRTN核苷酸序列，构建出VRTN的分子进化树(图 4)，从树的拓扑结构上看，巴马香猪、猪与牛构成一个小类群，与灵长类和家犬共同构成一个亚类群，与斑马鱼和鸡的遗传距离较远。
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图 4 基于不同物种VRTN核苷酸序列的分子进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree based on VRTN nucleotide sequences of different species |
对0日龄巴马香猪7个组织进行荧光定量PCR检测，结果显示，VRTN基因在背最长肌中表达量最高，极显著高于其他组织；脾中的VRTN基因表达量为其次，显著高于肺的表达量，与其在心、肝、肾和皮下脂肪组织中表达量均差异不显著(图 5)。
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不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)；不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)；相同字母表示差异不显著(P>0.05)；误差线表示标准差 The different capital letters showed extremely significant difference(P < 0.01); The different lowercase letters showed significant difference (P < 0.05); The same letter showed no significant difference (P>0.05); Error bars represent standard deviations 图 5 巴马香猪VRTN基因在7种组织中的相对表达量 Fig. 5 Relative expressions of the VRTN gene in 7 tissues of Bama Xiang pig |
对279头巴马香猪的DNA进行PCR扩增，检测到VRTN ins291位点共有3种基因型(图 6)：仅有339 bp条带的为纯合野生型(-/-)，仅有630 bp条带的为纯合突变型(ins/ins)，两者皆有的为杂合型(-/ins)。群体频率统计结果见表 2，基因型频率中纯合野生型占65.23%、纯合突变型占7.53%、杂合型占27.24%；等位基因频率中野生型占78.85%、突变型占21.15%；统计分析发现，VRTN ins291位点在该群体中不符合哈迪-温伯格平衡(P=0.002)。
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M. DNA相对分子质量标准；1~3. ins/ins基因型；4~10、21. ins/-基因型；11~20.-/-基因型；22.空白对照 M. 2000 bp DNA marker; 1-3. ins/ins; 4-10, 21. ins/-; 11-20.-/-; 22. Blank control 图 6 VRTN基因ins291位点PCR电泳图 Fig. 6 PCR electrophoresis of ins291 locus of VRTN gene |
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表 2 巴马香猪VRTN ins291位点基因型和等位基因频率统计结果 Table 2 Statistical results of VRTN ins291 genotypes and alleles frequencies in Bama Xiang pig |
将VRTN ins291位点3种基因型与279头巴马香猪左侧乳头数、右侧乳头数、总乳头数、最大乳头数和平均产仔数进行关联分析，表型性状数据分布如图 7所示。结果显示，巴马香猪VRTN ins291三种不同基因型在左侧乳头数、右侧乳头数、总乳头数、最大乳头数和平均产仔数性状上均没有显著差异(P>0.05)，但纯合突变型个体的左侧乳头数、右侧乳头数、总乳头数和最大乳头数均高于纯合野生型个体(表 3)。
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A.左侧乳头数数据分布；B.右侧乳头数数据分布；C.总乳头数数据分布；D.最大乳头数数据分布；E.平均产仔数数据分布 A. Distribution of left teat number; B. Distribution of right teat number; C. Distribution of total teat number; D. Distribution of maximum teat number; E. Distribution of average litter size 图 7 巴马香猪乳头数、产仔数数据分布 Fig. 7 Distribution of the teat number and litter size of Bama Xiang pigs |
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表 3 ins291位点与乳头数和产仔数的关联分析 Table 3 Association analysis between ins291 locus and teat number, average litter size |
脊椎数在少数哺乳动物上存在变异，如猪、牛[17]、羊[18-20]等，可能与高强度的人工选择有关。猪脊椎数性状的遗传力为0.60~0.62，是一个高遗传力性状[21-22]，因此，在具有较大变异的群体中通过选育即可获得较大的遗传进展。西方国家通过持续的高强度选育，将3大商品猪的脊椎数提高到了21~23根，大大增加了商品猪的经济效益。自Mikawa等[9]发现影响西方猪种脊椎数的VRTN基因以来，许多研究者对VRTN基因的分子机理进行了研究，如：欧阳子璇[23]确认了VRTN基因是影响西方商业猪种脊椎数变异的候选基因，并且极显著影响西方商业猪种胸椎数；张慧[24]证实了VRTN基因是影响脊椎数的因果基因，并有可能是通过Notch通路进行调控；Duan等[25]通过全基因组关联分析等方法证实了VRTN基因可以通过Notch通路进行作用。此外，针对VRTN基因还有大量与其他多个生产性状相关性的研究，如通过对大白、杜洛克、二花脸和山下黑猪等群体的系统研究发现，VRTN基因还影响了乳头数、胴体长、体长和体重，但对平均日增重、肌内脂肪含量、膘厚、皮厚、屠宰率、肉色、大理石纹、pH、嫩度和眼肌面积等性状没有显著影响[26-30]。Fan等[10]发现，VRTN ins291位点在所检测的16个中国地方猪种中只有巴马香猪、二花脸猪、杭猪、莱芜黑猪、藏猪和通城猪存在有利突变，且突变频率远小于西方商业猪种[31-32]，这说明许多中国地方猪种VRTN ins291位点的有利突变频率还有很大的提高空间；同时，作为终端父本使用的杜洛克猪在3大猪种中的突变频率最低，提示也可以通过分子育种手段进一步提高杜洛克猪VRTN ins291位点的有利等位基因频率。
本研究发现，巴马香猪VRTN基因编码区核苷酸序列与参考基因组的序列一致性为99.5%，与牛和犬等哺乳类动物的序列一致性均低于90%，说明VRTN基因在不同物种间的保守性相对较低[33]。蛋白互作预测分析发现，VRTN蛋白与NR6A1和PROX2蛋白相互作用，且NR6A1基因[21, 34]和PROX2基因[4, 35]均与猪、羊脊椎数相关，巴马香猪群体中VRTN与这2个蛋白对脊椎数的共同影响还有待进一步研究。Duan等[25]和Li等[20]研究发现，VRTN基因在胚胎期的表达量最高，而后表达量逐渐降低，本研究发现，0日龄巴马香猪组织表达显示VRTN基因在背最长肌中的表达量最高，但在各组织中均处于较低表达水平，可能是因为VRTN基因表达量从胚胎期开始逐渐降低，出生后的表达量已经很低，其主要在胚胎早期发挥调控脊椎发育的作用。
目前，针对中国地方猪种VRTN ins291位点突变频率的群体检测结果显示，枣庄黑盖猪为27.22%[36]、苏淮猪为18%[31]、杭猪为29%[10]、通城猪为28%[10]、莱芜黑猪为14%[10]、藏猪为8%[10]和二花脸猪为6%[10]，但是部分猪种检测群体数量较小，可能需要扩大群体进行进一步的检测。本研究选取了279头广西巴马香猪保种群体的核心群经产母猪对VRTN ins291位点进行检测分型，能很大程度上代表巴马香猪品种的群体频率分布。VRTN基因3种基因型中纯合野生型频率占65.23%，为优势基因型，突变型基因频率占21.15%，比Fan等[10]通过32头巴马香猪检测到的基因频率高6.15%。计算发现，巴马香猪群体VRTN ins291位点频率不符合哈迪-温伯格平衡，纯合野生型与纯合突变型频率皆相对较高，可能与该保种群体受到人工选择及近交程度较高有关。
关联分析发现，左侧乳头数、右侧乳头数、总乳头数和单侧最大乳头数在巴马香猪VRTN ins291 3种不同基因型个体中没有显著差异，与Dall’olio等[37]使用793头大白猪和闫德超[38]使用939头大白猪研究发现VRTN ins291位点与乳头数具有显著关联的结果不一致；但本研究发现，ins/ins基因型个体的左侧乳头数、右侧乳头数、总乳头数和单侧最大乳头数均高于其它基因型个体，与在大白猪中的研究结果一致，并且已有研究[39]表明，在长白猪和杜洛克猪群体中脊椎数和乳头数性状之间存在明显的关联，这可能与该位点在巴马香猪群体中对乳头数影响效应相对更小或本研究使用的群体规模较小有关；蛋白互作网络分析显示，VRTN与LRRC74A蛋白具有相互作用，而Tan等[28]通过全基因组关联分析认为，LRRC74A基因与乳头数有关，因此，在巴马香猪群体中，VRTN与LRRC74A基因对乳头数性状是否存在共同影响还有待进一步验证。巴马香猪平均产仔数在VRTN ins291 3个不同基因型中没有显著差异，与在大白猪群体中的研究结果[40]一致。
4 结论本研究成功克隆了巴马香猪VRTN基因全长2 097 bp的编码区序列；生物信息学分析发现，其编码698个氨基酸的蛋白序列，在不同物种间存在多个保守区域，预测其为亲水性蛋白且最可能存在于细胞质和细胞核中；VRTN基因在0日龄巴马香猪各组织中均有表达，其在背最长肌组织中表达量最高；VRTN ins291位点在巴马香猪保种群体中有利突变位点(ins)的等位基因频率为21.15%，具有很大的选育提高潜力；统计分析发现，ins/ins基因型个体乳头数性状相对较高，但ins291位点与巴马香猪乳头数、平均产仔数均无显著性关联。本研究为利用VRTN ins291位点选育巴马香猪提供参考，并提示该位点对其产仔数性状没有显著影响。
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